多重激酶抑制剂瑞戈非尼对人员姓异种移植物胃癌模型的抗肿瘤活性

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激酶抑制剂在肿瘤治疗中的应用研究

激酶抑制剂在肿瘤治疗中的应用研究随着现代医学技术的不断发展，肿瘤治疗的方法越来越多样化和个性化。

其中，激酶抑制剂技术在肿瘤治疗中的应用引起了广泛关注。

本文将探究激酶抑制剂在肿瘤治疗中的应用研究。

一、激酶抑制剂生物学原理激酶抑制剂是一类能够抑制酶活性的小分子化合物，通过破坏蛋白质酶体系的关键酶活性，从而起到抑制细胞增殖和分裂的作用。

激酶抑制剂被广泛用于治疗很多疾病，特别是肿瘤治疗。

激酶抑制剂更多的是针对特定的激酶，如抑制肝细胞生长因子受体（EGFR）、血小板源性生长因子受体（PDGFR）等，进而阻碍癌细胞的刺激和增殖。

二、激酶抑制剂在肿瘤治疗中的应用（一） EGFR激酶抑制剂人表皮生长因子受体（EGFR）是肿瘤细胞增殖、转移和预后的重要分子靶标。

EGFR激酶抑制剂如培唑帕尼（gefitinib）和厄洛替尼（erlotinib），已被广泛应用于非小细胞肺癌的治疗。

这些药物口服后可抑制EGFR自身酶活性，从而阻止EGFR在癌细胞生长和转移过程中的作用。

因此，EGFR激酶抑制剂已成为一种广泛使用的治疗药物。

（二） PDGFR激酶抑制剂PDGF是一种细胞增殖和迁移的强烈刺激因子，为多种恶性肿瘤的发生和转移贡献了重要因素。

针对PDGFR的激酶抑制剂如伊马替尼（imatinib），已广泛应用于治疗皮肤型软组织肉瘤、胃肠瘤和慢性骨髓性白血病等恶性肿瘤。

（三） mTOR激酶抑制剂哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一种蛋白质激酶，存在于哺乳动物细胞的外涵体中。

mTOR是一种重要的信号转导通路，参与了细胞的增殖、生长和其它许多生命活动。

否定的作用也是负责细胞凋亡的。

目前，mTOR激酶抑制剂如依维莫司（everolimus）已被广泛使用于胰腺神经内分泌瘤、肾脏癌等肿瘤治疗中。

三、激酶抑制剂药物的副作用尽管激酶抑制剂的应用是极其广泛的，但其使用也有其独特的难点。

激酶抑制剂在肿瘤治疗中，药物用量是非常严格的。

如果剂量过大会导致严重的中毒反应，如过度抑制细胞增殖和免疫功能、引起毒性肝损伤等。

瑞戈非尼片说明书

核准日期：2017年3月22日修改日期：2017年12月5日瑞戈非尼片说明书请仔细阅读说明书并在医师指导下使用。

【药品名称】通用名称：瑞戈非尼片商品名称：Stivarga® 拜万戈® 英文名称：Regorafenib Tablets 汉语拼音：Ruigefeini Pian【成份】主要成份：瑞戈非尼化学名称：4-[4-({[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰}氨基)-3-氟苯氧基]-N-甲基吡啶-2-甲酰胺一水合物化学结构式：分子式：C 21H 15ClF 4N 4O 3•H 2O 分子量：500.83 【性状】本品为浅粉色椭圆形薄膜衣片。

【适应症】1. 适用于治疗既往接受过以氟尿嘧啶、奥沙利铂和伊立替康为基础的化疗, 以及既往接受过或不适合接受抗VEGF 治疗、抗EGFR 治疗（RAS 野生型）的转移性结直肠癌（mCRC ）患者。

2. 既往接受过甲磺酸伊马替尼及苹果酸舒尼替尼治疗的局部晚期的、无法手术切除的或转移性的胃肠道间质瘤（GIST ）患者。

3. 既往接受过索拉非尼治疗的肝细胞癌（HCC ）患者。

【规格】警告：肝脏毒性•在临床研究中发生了严重的、有时是致命性的肝脏毒性; •在治疗前及治疗中进行肝功能监测；•在使用瑞戈非尼片治疗中，可根据肝功检测或肝细胞坏死所表现出来的肝脏毒性的严重程度和持续性，暂停后降低剂量或停药。

40mg【用法用量】瑞戈非尼应由在抗癌治疗给药方面有经验的医生开具。

推荐剂量推荐剂量为160mg（4片，每片含40mg 瑞戈非尼），每日一次，于每一疗程的前21天口服，28天为一疗程。

服用方法瑞戈非尼片应在每天同一时间，在低脂早餐（脂肪含量30%）后随水整片吞服。

患者不得在同一天服用两剂药物以弥补（前一天）漏服的剂量。

如果服用瑞戈非尼后出现呕吐，同一天内患者不得再次服药。

治疗时间应持续治疗直至患者不能临床受益或出现不可耐受的毒性反应。

剂量调整及特殊使用说明基于个人的安全性及耐受性考虑，可能需要中断给药或降低剂量。

多靶点酪氨酸激酶抑制剂瑞戈非尼在实体瘤中的临床应用进展

１．３ Ⅲ 期临床研究（ＣｏＮＣＵＲ试验）
ｍＣＲＣ。其后，瑞戈非尼的研发进程不断加快，已在其他实体
瘤进行了多项临床研究，现对其在实体瘤治疗方面的研究进展及循证医学证据进行综述。
１治疗结直肠癌
结直肠癌是人类最常见的消化道肿瘤之一，每年全球有约１２０万例患者被确诊，＞６０万例患者直接或间接死于结直肠
ＤＯＩ１０．１４００９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－２１２４．２０１７．０８．００２
瑞戈非尼（Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ）为口服的多靶点酪氨酸激酶抑制剂（ｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＴＫＩ），可以抑制血管生成以及其他
昔单抗（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、帕尼单抗（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、瑞戈非尼
（Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ）Ｊ。其中，瑞戈非尼为唯一的口服ＴＫＩ，其在标准治疗失败的ｍＣＲＣ的治疗中有着重要的地位，目前已有多项临床研究结果证实瑞戈非尼在ｍＣＲＣ治疗方面的优势。
非尼组患者的ｍＯＳ明显优于安慰剂组（８．８个月ＶＳ．６．３个月），提示瑞戈非尼同样可以给亚洲ｍＣＲＣ患者带来生存获益。
１．４剂量调整研究
品局和ＦＤＡ目前已批准５个用于治疗结直肠癌的靶向药物，

人胃癌IFN-γ-STAT1通路的作用及其机制

***************临床研究 CLINICAL RESEARCH人胃癌IFN-γ-STAT1通路的作用及其机制邓昊, 镇鸿燕, 周红艳, 陈琼霞, 刘丽江邓昊, 镇鸿燕, 周红艳, 陈琼霞, 刘丽江,江汉大学医学与生命科学学院病理学与病理生理学教研室湖北省武汉市 430056刘丽江, 江大病理诊断中心湖北省武汉市 430056邓昊, 2006年华中科技大学同济医学院博士, 讲师, 主要从事胃肠道肿瘤的病理学研究.武汉市科技攻关基金资助项目, No. 20025007170武汉市晨光计划基金资助项目, No. 20045006071-7湖北省自然科学基金资助项目, No. 2006AB191作者贡献分布: 此课题由邓昊与刘丽江设计; 研究过程由邓昊、周红艳及陈琼霞操作完成; 研究所用新试剂及分析工具由镇鸿燕提供; 数据分析由邓昊完成; 本论文写作由邓昊与刘丽江完成.通讯作者:刘丽江, 教授, 430056, 武汉市沌口经济技术开发区学府路8号,江大病理诊断中心*******************电话*************传真*************收稿日期: 2009-01-30 修回日期: 2009-03-26接受日期: 2009-03-30 在线出版日期: 2009-04-18Role of IFN-γ-STAT1pathway in human gastric adenocarcinomaHao Deng, Hong-Yan Zhen, Hong-Yan Zhou,Qiong-Xia Chen, Li-Jiang LiuHao Deng, Hong-Yan Zhen, Hong-Yan Zhou, Qiong-Xia Chen, Department of Pathology and Pathophysiology, School of Medicine, Jianghan University, Wuhan 430056, Hubei Province, ChinaLi-Jiang Liu,Jiangda Pathology Center, Jianghan Univer-sity, Wuhan 430056, Hubei Province, ChinaSupported by:the Scientific and Technological Project in Wuhan City, No. 20025007170; the Young Chenguang Foundation of Wuhan, No. 20045006071-7; and the Hubei Natural Science Fund, No. 2006AB191 Correspondence to:Professor Li-Jiang Liu, Jiangda Pa-thology Center, Jianghan University, Wuhan 430056, Hubei Province,************************Received: 2009-01-30 Revised: 2009-03-26 Accepted: 2009-03-30 Published online: 2009-04-18AbstractAIM: To investigate relationships among STAT1, Caspase-7 and p21waf in gastric adenocarcinoma tissue and gastric adenocarcinoma cell SGC7901, and to shed light on features of IFN-γ-STAT1 pathway in gastric adenocarcinoma.METHODS:Gastric adenocarcinoma tissue was tested by immunohistochemical method. SGC7901 cell was treated with IFN-γ and STAT1 antisense oligonucleotides, and mRNA and protein expression was detected using RT-PCR, immunocytochemistry and image analysis meth-ods. Apoptosis was determined by Hoechest 33258.RESULTS:Caspase-7 was positive correlation with STAT1 and p21waf(r= 0.32, 0.22, both P< 0.05) in gastric adenocarcinoma tissue. IFN-γpromoted mRNA and protein expression of STAT1, Caspase-7 and p21waf was up-regulated in SGC7901 cell (P< 0.05). After treatment with IFN-γalong with varied concentrations of STAT1 antisense oligonucleotides, significantly lower STAT1 mRNA and protein expression was observed than IFN-γ used alone in SGC7901 cells, which showed a concentration-dependent manner (P < 0.05); significantly lower Caspase-7 and P21waf protein expression was observed than IFN-γused alone in SGC7901 cell in a concen-tration-dependent manner (P < 0.05). However, mRNA expression of Caspase-7 was down-reg-ulated first and then up-regulated, while mRNA expression of p21waf was up-regulated first and then down-regulated.CONCLUSION:There is a IFN-γ-STAT1 path-way in gastric adenocarcinoma tissue and SGC7901 cell line. IFN-γ-STAT1 could up-regulate the expression of Caspase-7 and p21waf in gastric adenocarcinoma, but could not induce apoptosis. The downstream molecular of IFN-γ- STAT1 pathway has different expression fea-tures in mRNA and protein expression level in gastric adenocarcinoma.Key Words: Interferon γ; Signal transducer and ac-tivator of transcription 1; Caspase-7; p21waf; Gastric adenocarcinomaDeng H, Zhen HY, Zhou HY, Chen QX, Liu LJ. Role of IFN-γ-STAT1 pathway in human gastric adenocarcinoma. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2009; 17(11): 1103-1107摘要目的:分析人胃癌组织和胃癌SGC7901细胞中STAT1、Caspase-7及p21waf的表达关系, 并探讨胃癌中IFN-γ-STAT1分子通路特点.方法:人胃癌组织免疫组织化学染色, IFN-γ ®■背景资料胃癌是一类严重威胁我国人群健康的恶性肿瘤, 其凋亡率较低.迄今,有关胃癌低凋亡率的机制尚未取得突破性的研究进展.干扰素γ(IFN-γ)是Ⅱ型干扰素中的唯一成员,其可通过STAT1促进肿瘤细胞凋亡.所涉及的主要环节可能是通过STAT1上调p21w a f、Caspase-7等表达,进而促细胞凋亡.关于胃癌IFN-γ-STAT1分子通路的特点以及与胃癌凋亡的关系当前研究较少.■同行评议者龚建平, 教授, 重庆医科大学附属第二医院肝胆外科及STAT1反义寡核苷酸处理SGC7901细胞. 免疫细胞化学、RT-PCR 及图像分析的方法检测mRNA 和蛋白水平变化, 应用Hoechest 33258观察细胞凋亡.结果: 人胃癌组织Caspase-7与STAT1和p21waf 正相关(r = 0.32, 0.22, 均P <0.05); SGC7901细胞经IFN-γ处理后, STAT1、Caspase-7和p21waf mRNA 和蛋白表达明显上升(P <0.05). 经IFN-和不同浓度STAT1反义寡核苷酸联合处理后, STAT1 mRNA 和蛋白表达较IFN-γ单独处理明显下降, 有浓度依赖性(P <0.05). Caspase-7和P21waf 蛋白表达较IFN-γ单独处理明显下降, 有浓度依赖性(P <0.05), 但是mRNA 表达量则随着STAT1反义寡核苷酸浓度变化, 出现Caspase-7先下降后上升, p21waf 先上升后下降的变化. 经IFN-γ和STAT1反义寡核苷酸处理后细胞无明显凋亡.结论: 人胃癌组织和胃癌细胞系SGC7901中存在IFN-γ-STAT1通路, 且可上调Caspase-7和p21waf 的表达, 但无明显凋亡调控作用; 胃癌IFN-γ-STAT1分子通路的下游分子在mRNA 水平和蛋白水平表达变化不一致.关键词: 干扰素-γ; 转录信号转导子和活化子1; Caspase-7; p21waf ; 胃腺癌邓昊, 镇鸿燕, 周红艳, 陈琼霞, 刘丽江. 人胃癌IFN-γ-STAT1通路的作用及其机制. 世界华人消化杂志 2009; 17(11): 1103-1107/1009-3079/17/1103.asp0 引言胃癌是一类严重威胁我国人群健康的恶性肿瘤[1-2]. 临床资料和实验研究显示胃癌细胞的凋亡率较低[3]. 转录信号转导子和活化子1(signal transducer and activator of transcription 1, STAT1)是干扰素γ(IFN-γ)信号传导通路中的重要分子, 可促进肿瘤细胞凋亡[4-6]. IFN-γ是Ⅱ型干扰素中的唯一成员, 在抗病毒, 细胞生长调节以及细胞凋亡调节等方面发挥其生物学作用[7-8]. IFN-γ主要通过与Jak 蛋白酪氨酸激酶(janus protein tyrosine kinase, JAK)2受体结合, 促进STAT1蛋白的Y701和S727位点磷酸化并使STAT1同源二聚化. STAT1同源二聚体入核后, 可与具有GAS(gamma activated sequence)结构的启动子序列结合发挥转录调控作用[9-11]. 在细胞凋亡方面, 所涉及的主要环节可能是STAT1可促进p21waf 、C a s p a s e-7等表达[12-13]. 本研究拟通过使用临1104 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2009年4月18日第17卷第11期床病理学和细胞生物学的方法, 观察STAT1、Caspase-7和p21waf 在胃癌组织和细胞系中的表达关系, 及经IFN-γ处理后三者分子水平的变化以及细胞凋亡情况, 探讨胃癌IFN-γ-STAT1分子通路的特点以及在胃癌中发挥的生物学作用. 1 材料和方法1.1 材料收集江汉大学附属医院1989-2003年胃腺癌根治性手术切除标本102例. 所有病例术前均未进行放疗和化疗. 胃癌细胞株SGC-7901, 使用含100 g/L 小牛血清(Gibcol)的RMPI 1640培养基(Gibcol), 置于37℃, 50 mL/L CO 2(体积分数)的培养箱中培养, 2-3 d 换液1次. 抗STA T1 mAb(P84/P91, C-136, Santa Cruz 公司产品)购至北京中山公司, 即用型鼠抗人Caspase-7 mAb(7CSP01, N e o M a r k 公司产品), 即用型鼠抗人p21w a f mAb(F-5, sc-6246, Santa Cruz 公司产品)和SP 法即用型检测试剂盒均购至福州迈新生物公司. 1.2 方法1.2.1 A S O N 的转染以及药物处理: 使用1000 IU/mL IFN-γ[14](102CY27, PEPROTECH EC)分别处理细胞0.5、3和24 h. 反义寡核苷酸及引物序列由赛百胜生物技术有限公司合成, 使用阳离子脂质体Transfectin(TianGENE)进行转染. 反义寡核苷酸的序列设计以及浓度的使用根据已发表的文献, STAT1反义寡核苷酸(ASON)5'-CCACTGAGACATCCTG CCACC-3', 按照600 nmol/L 和800 nmol/L 的浓度转染[15]. 将STAT1 ASON 与1000 IU/L IFN-γ联合处理细胞24 h; 细胞的转染严格按照说明书操作, 反义寡核苷酸:脂质体约为1∶2-3.1.2.2 RT-P C R 检测及图像分析: 用T R I z o l (Invitrogen)提取总RNA, 样品纯度和浓度经核酸测定仪测定, A 260/280为1.8-2.0. 严格按照RT-PCR 试剂盒(TaKaRa)说明书操作进行RT-PCR. 使用Primer 5.0引物设计软件分别设计STAT1、Caspase-7、p21waf 和β-actin 的上游和下游引物(表1). 目的引物与β-actin 用一管法进行PCR. PCR 产物经1.5 g/L 的琼脂糖凝胶电泳检测, 使用Biostep Photoimpact 软件分析各组目的基因与β-actin 条带的平均吸光度, 计算两者的比值, 进行相对定量.1.2.3 免疫组织化学、免疫细胞化学及图像分析: 使用DAB 显色, STAT1以癌组织细胞质和/或细胞核内呈棕黄色表达为阳性. Caspase-7和p21waf 以癌组织细胞质内呈棕黄色表达为阳性.■研发前沿传统观念认为STAT1是IFN-γ信号传导途径中极其重要的一环, 几乎所有IFN-γ刺激表达的蛋白均要通过其转录调控实现表达, 但是近期研究发现当STAT1通路缺如时, 仍有接近1/3的蛋白被激活表达; 同时, IFN-γ在促进STAT1磷酸化时, 也激活了大量其他信号通路分子, 这些现象及其发挥的作用远非IFN-γ-JAK2-STAT1经典通路可以解释. 胃癌中IFN-γ的生物学作用以及其信号通路的特点尚待研究.邓昊, 等. 人胃癌IFN-γ-STAT1通路的作用及其机制1105染色操作严格按照说明书要求进行. 免疫细胞化学染色结果, 经图像采集, 使用MOTIC 图像分析系统测量其平均吸光度.1.2.4 Hoechest3325染色检测细胞凋亡: 无菌条件下取出细胞爬片并固定后, Hoechest33258孵育15 min, 0.01 mol/L PBS 洗5 min ×1次. 水溶性封片剂封片, 荧光显微镜紫外光下观察, Hoechest33258染料呈现蓝色荧光. 高倍镜下观察, 凋亡细胞为蓝色亮点, 亮度明显强于未凋亡细胞, 形态学上出现核膜消失、核固缩、核碎裂等特征. 随机数取1000个细胞进行凋亡细胞记数.统计学处理全部数据经SPSS12.0统计学软件处理, 相关因素分析采用Spearman 等级相关分析, 各组平均光密度值通过t 检验分析. P <0.05有统计学意义.2 结果2.1 人胃癌组织中各指标的相关性 S TAT1, p21waf 与Caspase-7呈正相关关系(r = 0.32, 0.22, P = 0.001, 0.02). STAT1与p21waf 无关(r = 0.03, P = 0.75).2.2 I F N-γ处理后各指标基因及蛋白水平的表达变化 RT-PCR 结果显示: IFN-γ刺激SGC7901细胞0.5、3和24 h 后STAT1、Caspase-7和p21waf mRNA 表达呈先下降后上升的趋势,并于IFN-γ处理24 h 时三者表达量达到峰值(P <0.05, 图1A). 免疫细胞化学结果显示: IFN-γ刺激SGC7901细胞24 h 后与对照组比较, STAT1蛋白表达明显上调(P = 0.04); Caspase-7与p21waf的表达量较未处理组相应上升(均P = 0.03, 图1C).2.3 IFN-γ联合STAT1 ASON 处理后各指标基因及蛋白水平的表达变化 RT-PCR 结果显示: 使用IFN-γ处理的同时, 使用STAT1反义寡核苷酸600 nmol/L 和800 nmol/L 浓度抑制STAT1表达, 与IFN-γ组比较, IFN-γ+600 nmol/L 组STAT1(P = 0.008)和Caspase-7(P = 0.0002)表达量显著降低,p21waf 表达量显著升高(P = 0.002); 与未处理组比较, STAT1(P = 0.003)、Caspase-7(P = 0.0005)和p21waf (P = 0.006)表达量升高(图1B). 与IFN-γ组比较, IFN-γ+800 nmol/L 组STAT1 (P = 0.002)表达量显著降低, 而Caspase-7(P = 0.2)和p21waf (P = 0.8)无显著变化. 与未处理组比较, STAT1表达量无显著变化(P = 0.9), Caspase-7(P = 0.0005)和p21waf (P = 0.006)表达量升高(图1B). IFN-γ+600nmol/L 组和IFN-γ+800 nmol/L 间STAT1(P = 0.005)、Caspase-7(P <0.0001)和p21waf (P = 0.03)表达有显著性差异(图1B).免疫细胞化学结果显示: 使用I F N-γ处理的同时, 使用STAT1反义寡核苷酸600 nmol/L 和800 nmol/L 浓度抑制STAT1表达, 与IFN-γ组比较, IFN-γ+600 nmol/L 组STAT1(P = 0.28)、Caspase-7(P = 0.18)和p21waf (P = 0.52)表达量无显著性差异; 与未处理组比较, STAT1(P = 0.18)表达量无显著变化, Caspase-7(P = 0.001)和p21waf (P = 0.002)表达量升高(图1C). 与IFN-γ组比较, IFN-γ+800 nmol/L 组STAT1(P = 0.01)、Caspase-7(P = 0.03)和p21waf (P = 0.03)表达量显著降低. 与未处理组比较, STAT1(P = 0.2), Caspase-7(P = 0.4)和p21waf (P = 0.5)表达量无显著变化(图1C). IFN-γ+600 nmol/L 组和IFN-γ+800 nmol/L 间STAT1(P = 0.04)、Caspase-7(P <0.0001)和p21waf (P = 0.005)表达有显著性差异(图1C) . 2.4 细胞凋亡的变化 Hoechest33258染色结果显示, SGC7901胃癌细胞在未处理组、IFN-γ处理组、IFN-γ+STAT1反义寡核苷酸600 nmol/L 组、IFN-γ+STAT1反义寡核苷酸800 nmol/L 组, 凋亡细胞数无明显变化(P >0.05). 3 讨论胃癌是全球第二大常见的恶性肿瘤, 是我国最常见的恶性肿瘤之一, 一经发现多为进展期. 迄今, 有关胃癌的发生与发展的机制尚未取得突破性的进展. 信号转导子和转录活化子(signal transducer and activator of transcription, STAT)家族至少包括STAT1(α和β)、2、3、3β、4、5、6和果蝇STAT 蛋白[即D-STAT(mrl)]等8个成员. STAT1是该家族的重要成员, 可促肿瘤细胞1■应用要点本研究证实人胃癌中存在IFN-γ-JAK2-STAT1及其通路, 并可调节其下游凋亡相关调控分子, 但无明显凋亡调节作用, 该结论可望进一步完善当前凋亡调控理论, 并为临床治疗提供新的角度和思考.凋亡[16]. 虽然其机制尚未完全阐明, 但所涉及的主要环节可能是: (1) IFN-γ等信号因子作用于Jak 2等, 使胞质中STAT1激活并形成二聚体, 进入细胞核促进相应靶基因转录, 从而促进细胞凋亡[17]. (2)STAT1直接上调细胞质Caspase-3、7的水平, 诱发细胞凋亡[18]. (3)STAT1促进p21waf 表达, 后者与细胞周期调节因子CDK4结合为复合物, 使肿瘤细胞生长停滞, 继而诱发凋亡[19]. 胃癌细胞中S TAT1促凋亡及其机制的研究较少.Beppu et al 研究发现, IFN-γ可同时促进胃癌细胞系MK-1和GCTM 中STAT1(促凋亡)和NF-κB(抑凋亡)表达上调[20], 当IFN-γ和环孢菌素A(CsA, 抑制NF-κB 活性)同时使用时, 凋亡明显增加, 继而使用STAT1反义寡核苷酸抑制STAT1活性时, 胃癌细胞系凋亡发生率大大下降. 证实IFN-γ主要通过JAK-STAT1途径促进胃癌凋亡. 但STAT1在胃癌中抑制凋亡的分子通路, 尚未见文献报道.本研究在人体胃癌组织中发现S TAT1与Caspase-7正相关, p21waf 与Caspase-7正相关. 提示人胃癌中STAT1的作用机制可能与其他肿瘤一致. 因此, 选用胃癌细胞系SGC7901进一步研究. SGC7901是1981年建立的一株胃癌淋巴结转移癌细胞系, 该细胞系凋亡率低[17].本研究通过使用IFN-γ处理细胞后, STAT1在mRNA 和蛋白水平的表达量均明显升高, 而当同时使用IFN-γ和STAT1反义寡核苷酸作用与细胞时, STAT1表达量出现不同程度的降低, 且下降程度与STAT1反义寡核苷酸的浓度有关. 提示, 本研究中使用IFN-γ和反义寡核苷酸对于细胞的处理是成功的, 同时, IFN-γ-STAT1可促进Caspase-7以及p21waf 表达的上调. 在IFN-γ处理不同时间点, 三者mRNA 有先下降再上升的趋势未见报道, 其机制有待进一步研究.当同时使用IFN-γ和STAT1反义寡核苷酸作用与细胞时, Caspase-7以及P21waf 的蛋白表达量出现下降的变化, 而且下降程度与STAT1反义寡核苷酸的浓度有关. 该现象与STAT1通过上调Caspase-7和p21waf 的表达, 实现促细胞凋亡功能的理论一致.但在mRNA 水平, 两者表达量的变化则与蛋白水平不同步, 出现Caspase-7先下降后上升,p21waf 先上升后下降的变化. 该结果提示: STAT1在胃癌中分子通路的调控形式与其他肿瘤不同, 其下游分子(Caspase-7和p21waf )在mRNA 水平和蛋白水平表达并不一致, 可能存在其他上游调控基因或在mRNA 和蛋白水平之间存在调控, 具体机制有待进一步研究.本研究中, 使用IFN-γ作用于SGC7901细胞, 细胞凋亡水平无明显变化, 该结果与Beppu et al 研究结果一致[20].传统观念认为STAT1是IFN-γ信号传导途径中及其重要的一环, 几乎所有IFN-γ刺激表达的蛋白均要通过其转录调控实现表达, 但是近期研究发现IFN-γ信号网络非常复杂, 当经典的IFN-γ-JAK2-STAT1通路缺如的情况下, 仍有接近1/3的蛋白被激活表达[21-24]; 同时, IFN-γ在促进STAT1磷酸化时, 也激活了CAMK Ⅱ(Calcium/Calmaculint Kinase Ⅱ), 3-kinase(PI3-K)/Akt, MAPK(Mitogen Activated Protein Kinase)和PKC(Protein Kinase C)等信号通路分子[25-29], 这些现象及其发挥的作用远非I F N-γ-J A K2-STAT1经典通路可以解释. 本研究发现, 人胃癌中存在IFN-γ-JAK2-STAT1通路; 人胃癌细胞系SGC7901中, IFN-γ可促进STAT1表达继而上调Caspase-7和p21waf 表达, 而当STAT1缺如时, 两者在蛋白质和mRNA 水平的表达却不一致, 同时1106 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2009年4月18日第17卷第11期A 图 1 胃癌SGC7901细胞经IFN-γ以及STAT1 ASON处理后各指标mRNA及蛋白水平的表达变化. A: IFN-γ(1000 U/mL)处理0.5、3、24 h后各指标mRNA表达的变化; B: IFN-γ(1000 U/mL)联合STAT1 ASON处理后各指标mRNA表达的变化; C: IFN-γ(1000 U/mL)联合STAT1 ASON处理后各指标蛋白表达的变化.BC Normal IFN-γ1000 IFN-γ1000+ IFN-γ1000+ ST A T1 600 ST A T1 8000.00090.00080.00070.00060.00050.00040.00030.00020.0001平均吸光度WAFST A T1ASON ST A T1ASON 600 800STAT1Caspase-7p21WAF3.02.52.01.51.00.50.0-0.5平均吸光度STAT1Caspase-7p21WAF0.70.60.50.40.30.20.10平均吸光度■名词解释转录信号转导子和活化子1(STAT1): 是干扰素γ(IFN-γ)信号传导通路中的重要分子, 参与调节许多正常功能活动, 如: 分化、增殖、生存、凋亡和血管发生等, 在肿瘤中主要发挥促凋亡作用.邓昊, 等. 人胃癌IFN-γ-STAT1通路的作用及其机制 1107IFN-γ-JAK2-STAT1通路对胃癌凋亡无明显调节作用; 提示胃癌细胞中存在IFN-γ-JAK2-STAT1及其通路, 且该通路可被IFN-γ激活但无明显凋亡调节作用, 该通路在胃癌中的作用及其机制尚需进一步研究.4 参考文献1 Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P. Global cancerstatistics, 2002. CA Cancer J Clin 2005; 55: 74-1082 孙秀娣, 牧人, 周有尚, 戴旭东, 张思维, 皇甫小梅, 孙杰, 李连弟, 鲁凤珠, 乔友林. 中国胃癌死亡率20年变化情况分析及其发展趋势预测. 中华肿瘤杂志2002;24: 101-1053 L a u w e r s G Y,S c o t t G V,K a r p e h M S.Immunohistochemical evaluation of bcl-2 proteinexpression in gastric adenocarcinomas. Cancer 1995;75: 2209-22134 Klampfer L. The role of signal transducers andactivators of transcription in colon cancer. FrontBiosci 2008; 13: 2888-28995 Klampfer L. Signal transducers and activatorsof transcription (STATs): Novel targets ofchemopreventive and chemotherapeutic drugs.Curr Cancer Drug Targets 2006; 6: 107-1216 Battle TE, Frank DA. The role of STATs inapoptosis. Curr Mol Med 2002; 2: 381-3927 Isaacs A, Lindenmann J, Valentine RC. Virusinterference. II. Some properties of interferon. ProcR Soc Lond B Biol Sci 1957; 147: 268-2738 Boehm U, Klamp T, Groot M, Howard JC. Cellularresponses to interferon-gamma. Annu Rev Immunol1997; 15: 749-7959 Briscoe J, Rogers NC, Witthuhn BA, Watling D,Harpur AG, Wilks AF, Stark GR, Ihle JN, KerrIM. Kinase-negative mutants of JAK1 can sustaininterferon-gamma-inducible gene expression butnot an antiviral state. EMBO J 1996; 15: 799-80910 Wen Z, Zhong Z, Darnell JE Jr. Maximal activationof transcription by Stat1 and Stat3 requires bothtyrosine and serine phosphorylation. Cell1995; 82:241-25011 Decker T, Kovarik P, Meinke A. GAS elements: afew nucleotides with a major impact on cytokine-induced gene expression. J Interferon Cytokine Res1997; 17: 121-13412 Huang YQ, Li JJ, Karpatkin S. Thrombin inhibitstumor cell growth in association with up-regulation of p21(waf/cip1) and caspases via a p53-independent, STAT-1-dependent pathway. J BiolChem 2000; 275: 6462-646813 Sironi JJ, Ouchi T. STAT1-induced apoptosis ismediated by caspases 2, 3, and 7. J Biol Chem 2004;279: 4066-407414 李莹, 韩炯, 王立峰, 林树新, 药立波, 俞强, 刘新平.人胃癌细胞株抗脱落凋亡特性的分析. 第四军医大学学报 2003; 24: 485-48815 Beppu K, Morisaki T, Matsunaga H, Uchiyama A,Ihara E, Hirano K, Kanaide H, Tanaka M, KatanoM. Inhibition of interferon-gamma-activatednuclear factor-kappa B by cyclosporin A: A possiblemechanism for synergistic induction of apoptosisby interferon-gamma and cyclosporin A in gastriccarcinoma cells. Biochem Biophys Res Commun 2003;305: 797-80516 Olie RA, Simões-Wüst AP, Baumann B, Leech SH,Fabbro D, Stahel RA, Zangemeister-Wittke U. Anovel antisense oligonucleotide targeting survivinexpression induces apoptosis and sensitizes lungcancer cells to chemotherapy. Cancer Res2000; 60:2805-280917 Darnell JE Jr. STATs and gene regulation. Science1997; 277: 1630-163518 Leonard WJ, O'Shea JJ. Jaks and STATs: biologicalimplications. Annu Rev Immunol 1998; 16: 293-32219 Li F, Ambrosini G, Chu EY, Plescia J, Tognin S,Marchisio PC, Altieri DC. Control of apoptosis andmitotic spindle checkpoint by survivin. Nature 1998;396: 580-58420 Reed JC, Bischoff JR. BIRinging chromosomesthrough cell division--and survivin' the experience.Cell 2000; 102: 545-54821 Gil MP, Bohn E, O'Guin AK, Ramana CV, LevineB, Stark GR, Virgin HW, Schreiber RD. Biologicconsequences of Stat1-independent IFN signaling.Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98: 6680-668522 Shresta S, Sharar KL, Prigozhin DM, Snider HM,Beatty PR, Harris E. Critical roles for both STAT1-dependent and STAT1-independent pathways inthe control of primary dengue virus infection inmice. J Immunol 2005; 175: 3946-395423 Malmgaard L, Salazar-Mather TP, Lewis CA, BironCA. Promotion of alpha/beta interferon inductionduring in vivo viral infection through alpha/betainterferon receptor/STAT1 system-dependent and-independent pathways. J Virol 2002; 76: 4520-452524 Ramana CV, Gil MP, Schreiber RD, Stark GR. Stat1-dependent and -independent pathways in IFN-gamma-dependent signaling. Trends Immunol 2002;23: 96-10125 Varinou L, Ramsauer K, Karaghiosoff M, Kolbe T,Pfeffer K, Muller M, Decker T. Phosphorylation ofthe Stat1 transactivation domain is required for full-fledged IFN-gamma-dependent innate immunity.Immunity 2003; 19: 793-80226 Choudhury GG. A linear signal transductionpathway involving phosphatidylinositol 3-kinase,protein kinase Cepsilon, and MAPK in mesangialcells regulates interferon-gamma-inducedSTAT1alpha transcriptional activation. J Biol Chem2004; 279: 27399-2740927 Deb A, Haque SJ, Mogensen T, Silverman RH,Williams BR. RNA-dependent protein kinasePKR is required for activation of NF-kappa B byIFN-gamma in a STAT1-independent pathway. JImmunol 2001; 166: 6170-618028 Nair JS, DaFonseca CJ, Tjernberg A, Sun W, DarnellJE Jr, Chait BT, Zhang JJ. Requirement of Ca2+and CaMKII for Stat1 Ser-727 phosphorylation inresponse to IFN-gamma. Proc Natl Acad Sci U S A2002; 99: 5971-597629 David M, Petricoin E 3rd, Benjamin C, Pine R,Weber MJ, Larner AC. Requirement for MAP kinase(ERK2) activity in interferon alpha- and interferonbeta-stimulated gene expression through STATproteins. Science 1995; 269: 1721-1723编辑李军亮电编吴鹏朕■同行评价本研究着眼于胃癌细胞中STAT1凋亡信号通路的探讨,重点研究了STAT1与下游因子Caspase-7和p21waf的关系, 以期为阐明胃癌发病机制做基础性研究,立题较新颖, 理论依据较充分, 目的明确, 结果具有较大实用价值.。

精准医学时代肝细胞癌的系统治疗

精准医学时代肝细胞癌的系统治疗1概述自2011年美国国立医学院推出精准医学(Precision Medicine)概念以来，如今精准医学领域已变得炙手可热。

美国已于2015年启动精准医学计划，我国也于2017年启动精准医学计划［1］。

精准医学是在基于分子表型的疾病分类的基础上，利用基因测序技术和生物医学分析进行大样本人群与特定疾病类型进行生物标志物的分析与鉴定、验证与应用，从而寻找到病因和治疗的靶点并对一种疾病不同状态和过程进行分型，针对性的开发应用靶向特异性药物，实现对于疾病和特定患者进行基于基因的个性化精准治疗［2-3］。

2011年，美国国家科学院出版的Toward Precision Medicine: Building a Knowledge Network for Biomedical Research and a New Taxonomy of Disease提出，基因组学成果促进生物医学信息学和临床信息学的整合［4］，从而加速精准医学时代的到来。

多组学技术的快速发展和大规模平行测序的出现同时也为精确医学的实施提供了强有力的技术支持［3］。

精准医学强调，通过强大的检测手段和临床特征的整合，可以将异质性疾病很好地分为更精确的亚型，从而使临床医生针对疾病亚型人群制订更准确的诊断和治疗策略，以最大限度地提高。

肿瘤领域一直是精确医学的前沿，因恶性肿瘤不同的遗传背景和驱动突变，肿瘤导致的死亡在世界范围内都是患者死亡的主要原因之一。

肝细胞癌(HCC，以下简称肝癌)是一种异质性很高的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在世界范围内呈上升趋势［5］。

这种异质性会影响细胞内关键的信号通路，驱动其表型变异，影响肿瘤的进化，并对肝癌的治疗提出了严峻的挑战。

精准医学的应用将对肝癌的治疗策略产生一定的影响。

本文将讨论精准医学框架下肝癌系统治疗的最新进展和面临的挑战。

2肝癌多学科治疗的发展原发性肝癌具有发病率高、预后差、死亡率高的特点，最新世界卫生组织的数据显示其发病率在全球恶性肿瘤中的排名为第五位，死亡率则排第三位。

瑞戈非尼说明书

瑞戈非尼说明书关键信息项：1、药品名称：瑞戈非尼2、适应症：＿___________________________3、用法用量：＿___________________________4、不良反应：＿___________________________5、禁忌：＿___________________________6、注意事项：＿___________________________11 药品介绍瑞戈非尼是一种口服的多靶点激酶抑制剂，属于抗肿瘤药物。

111 作用机制其主要通过抑制多种与肿瘤血管生成、肿瘤细胞增殖和肿瘤微环境相关的激酶，发挥抗肿瘤作用。

12 适应症适用于治疗既往接受过以氟尿嘧啶、奥沙利铂和伊立替康为基础的化疗，以及既往接受过或不适合接受抗 VEGF 治疗、抗 EGFR 治疗（RAS 野生型）的转移性结直肠癌（mCRC）患者。

还适用于既往接受过索拉非尼治疗的肝细胞癌（HCC）患者。

121 特定疾病的应用限制在某些特定情况下，可能需要根据患者的具体病情、合并疾病等因素来评估是否适合使用瑞戈非尼进行治疗。

13 用法用量131 剂量推荐剂量为每次 160mg，每日一次，口服，连续服用 3 周，停药 1 周，每 4 周为一个治疗周期。

132 服用方法应在每天相同的时间服用，整片吞服，不得咀嚼或压碎。

133 剂量调整根据患者的个体耐受性和安全性，可能需要对剂量进行调整。

14 不良反应141 常见不良反应包括手足皮肤反应、疲劳、腹泻、食欲下降、高血压、发声困难等。

142 严重不良反应可能出现肝功能异常、出血、心肌缺血和梗死等严重不良反应。

143 不良反应的处理对于轻度至中度的不良反应，可通过对症治疗、剂量调整等方式处理。

对于严重不良反应，可能需要停药并进行相应的治疗。

15 禁忌对瑞戈非尼成分过敏者禁用。

151 特殊人群禁忌孕妇、哺乳期妇女禁用。

16 注意事项161 肝功能监测在治疗开始前、治疗期间定期监测肝功能。

新型口服多激酶抑制剂瑞戈非尼治疗癌症的研究进展

新型口服多激酶抑制剂瑞戈非尼治疗癌症的研究进展李进【期刊名称】《临床肿瘤学杂志》【年(卷),期】2014(000)005【摘要】Targeted therapies by means of compounds that inhibit a specific target molecule represent a new perspective in the treatment of cancer. Various signaling pathways have been implicated in the development and progression of cancer. There is a general agreement that molecules interfering simultaneously with multiple targets might be more effective than single target agents. Regorafenib ( BAY 73-4506) is a novel, oral multikinase inhibitor, which demonstrates a broad spectrum of antitumor activity, probably due to the targeting of several angiogenic, oncogenic and stromal kinases. On September 2012, regorafenib was approved by US Food and Drug Administration( FDA) for previously heavy treated metastatic colorectal cancer. On February 2013, US FDA expanded the approved use to treat patients with advanced gastrointestinal stromal tumors. Two large, randomized,international multicentre,phase Ⅲ clinical trial in patients with metastatic colorectal cancer and gastrointestinal stromal tumour treated by regorafenib were finished. The CORRECT tri-al evaluated regorafenib for the treatment of patients with metastatic colorectal cancer who had progressed after standard therapies. The results confirmed that regorafenib was associated with significant improvementsin overall survival. The GRID trial showed that rego-rafenib could provide a significant improvement in progression-free survival compared with placebo in patients with metastatic gastroin- testinal stromal tumour following failure of imatinib and sunitinib. The toxicity profile of regorafenib is comparable with other oral mul-tikinase inhibitors with similar molecular targets. Most toxicities associated with regorafenib are mild/moderate and clinically managable. Further extensive clinical development as a single agent or in combination with standard chemotherapeutic agents in various malignant tumors is ongoing.%分子靶向治疗是近年来肿瘤治疗领域的研究热点。

UHPLC－MS

ＵＨＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳ法测定瑞戈非尼中两种痕量基因毒性杂质陈爽ꎬ刘柱ꎬ石云峰ꎬ朱价ꎬ罗英(浙江省食品药品检验研究院ꎬ浙江杭州３１００５８)摘要:目的㊀建立超高效液相色谱－串联质谱(ＵＨＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳ)方法测定瑞戈非尼中两类基因毒性杂质[３－氟－４－氨基苯酚(ＳＭ２)㊁３－三氟甲基－４－氯异氰酸苯酯(ＳＭ３)]的含量ꎮ方法㊀采用色谱柱ＡｇｉｌｅｎｔＲＲＨＤＣ１８(２.１ｍｍˑ１００ｍｍꎬ１.８μｍ)ꎬ流动相为０.０５％甲酸水－甲醇ꎬ梯度洗脱ꎬ流速为０.３ｍＬｍｉｎ－１ꎬ柱温为３５ħꎻ采用Ａｇｉｌｅｎｔ１２９０－６４７０Ａ液质联用仪和电喷雾离子源(ＡＪＳＥＳＩ)源检测ꎬ正负离子模式采集数据ꎮ结果㊀本方法的专属性㊁线性与范围㊁定量限与检测限㊁准确度㊁精密度及稳定性均符合«中国药典»的验证指标ꎮ结论㊀本方法操作简便ꎬ结果可靠ꎬ用于两批瑞戈非尼中潜在毒性杂质(３－氟－４－氨基苯酚㊁３－三氟甲基－４－氯异氰酸苯酯)的测定ꎮ两批样品中均未检测到ＳＭ２ꎬ而基因毒性杂质ＳＭ３的含量分别为１３.６ˑ１０－６和４１.４ˑ１０－６ꎮ关键词:瑞戈非尼ꎻ基因毒性杂质ꎻ超高效液相色谱－串联质谱中图分类号:Ｒ９２７.１㊀文献标志码:Ａ㊀文章编号:２０９５－５３７５(２０２３)０７－０４８５－００５ｄｏｉ:１０.１３５０６/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｒ.２０２３.０７.０１０ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｗｏｔｒａｃｅｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓｉｎＲｅｇｏｒａｆｅｎｉｂｂｙＵＨＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳＣＨＥＮＳｈｕａｎｇꎬＬＩＵＺｈｕꎬＳＨＩＹｕｎｆｅｎｇꎬＺＨＵＪｉａꎬＬＵＯＹｉｎｇ(ＺｈｅｊｉａｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌꎬＨａｎｇｚｈｏｕ３１００５８ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｎＵＨＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳａｎａｌｙｔｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓｉｎＲｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＴｈｅｍｅｔｈｏｄｗａｓａｃｈｉｅｖｅｄｏｎａＡｇｉｌｅｎｔＲＲＨＤＣ１８ｃｏｌｕｍｎ(２.１ｍｍˑ１００ｍｍꎬ１.８μｍ)ｕｔｉｌｉｚｉｎｇａｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｏｆ０.０５％Ｆｏｒｍｉｃａｃｉｄｗａｔｅｒ(Ａ)－Ｍｅｔｈａｎｏｌ(Ｂ)ｗｉｔｈｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎａｔｔｈｅｆｌｏｗｒａｔｅｏｆ０.３ｍＬｍｉｎ-１.Ｔｈｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆｃｏｌｕｍｎｗａｓｓｅｔａｔ３５ħ.ＴｈｅＡｇｉｌｅｎｔ１２９０－６４７０ＡＬＣ－ＭＳｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔ(ＡＪＳＥＳＩｓｏｕｒｃｅꎬｉｎＭｕｌｔｉｐｌｅＲｅａｃｔｉｏｎＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇｍｏｄｅ).Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀ＴｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙꎬｌｉｎｅａｒｉｔｙａｎｄｒａｎｇｅꎬＬＯＱａｎｄＬＯＤꎬａｃｃｕｒａｃｙꎬｐｒｅｃｉｓｉｏｎａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅａｌｌｉｎａｃｃｏｒｄａｎｃｅｗｉｔｈｔｈｅｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀Ｔｈｅｐｒｏｐｏｓｅｄｍｅｔｈｏｄｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙａｐｐｌｉｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｔｒａｃｅ－ｌｅｖｅｌＰＧＩｓｉｎｔｗｏｂａｔｃｈｅｓｏｆｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ.ＴｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆＳＭ２ｗｅｒｅｎｏｔｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎｔｈｅｔｗｏｂａｔｃｈｅｓｏｆｓａｍｐｌｅｓꎬｗｈｅｒｅａｓｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆＳＭ３ｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｔｏｂｅ１３.６ˑ１０－６ａｎｄ４１.４ˑ１０－６ꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＲｅｇｏｒａｆｅｎｉｂꎻＧｅｎｏｔｏｘｉｃｉｍｐｕｒｉｔｙꎻＵＨＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳ㊀㊀基因毒性杂质(或遗传毒性杂质ꎬｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｍ￣ｐｕｒｉｔｙꎬＧＴＩ)是少量即能引起细胞ＤＮＡ损伤ꎬ诱导基因突变ꎬ并具有致癌倾向的化合物[１]ꎮ欧洲药品管理局(ＥＭＥＡ)㊁美国食品药品管理局(ＦＤＡ)及人用药品注册技术要求国际协调会(ＩＣＨ)先后颁布了基因毒性杂质控制的指导文件[２－４]ꎬ推荐以毒理学关注阈值(ＴＴＣꎬ１.５μｇｄ－１)来控制用药风险ꎬ并发布基因毒性警示结构基团ꎮ瑞戈非尼(Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ)是拜耳药业研发并于２０１７年３月在国内上市的一种新型口服多靶点的磷酸激酶抑制剂ꎬ本品以促进肿瘤血管生成和细胞增殖的多种蛋白激酶为靶标ꎬ达到治疗晚期及转移性结肠癌㊁进展期肝细胞癌㊁胃肠道恶性间质肿瘤㊁儿童神经母细胞瘤和胶质母细胞瘤及一些转移性实体肿瘤的目的ꎮ瑞戈非尼的合成路线中起始物料ＳＭ２㊁ＳＭ３结构中均含有苯胺类基因毒性警示结构基团ꎬ具有潜在基因毒性ꎬ详见图１ꎮ瑞戈非尼已收载于«中国药典»和«欧洲药典»ꎬ已经报道了一种ＬＣ－ＭＳ/ＭＳ法定量同时测定肝细胞癌患者血浆中瑞戈非尼中及其两种活性代谢物的含量的方法[１７]ꎬ但目前也未见相关文献报道本品中两种苯胺类基因毒性杂质ＳＭ２㊁ＳＭ３的测定方法ꎮ㊀作者简介:陈爽ꎬ女ꎬ硕士ꎬ副主任药师ꎬ研究方向:药物质量研究㊁标准提高研究ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｃｒｅｄｅａｒ＠１２６.ｃｏｍＡ.３－氟－４－氨基苯酚(ＳＭ２)ꎻＢ.３－三氟甲基－４－氯异氰酸苯酯(ＳＭ３)图１㊀瑞戈非尼中苯胺类基因毒性杂质结构因此建立超高效液相色谱－串联质谱(ＵＨＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳ)方法对瑞戈非尼中少量的苯胺类基因毒性杂质的含量进行控制ꎮ本研究依照ＩＣＨ推荐的条件ꎬ建立了方法并从方法的专属性㊁溶液稳定性㊁线性与范围㊁定量限与检测限㊁准确度㊁精密度方面进行了方法学研究ꎬ本法灵敏㊁可靠㊁简便ꎬ为瑞戈非尼工艺过程控制和质量保障提供参考依据ꎮ１㊀仪器与试剂Ａｇｉｌｅｎｔ１２９０－６４７０ＡＬＣ－ＭＳ联用系统(美国安捷伦)ꎬ配备电喷雾离子源(ＡＪＳＥＳＩ)ꎬ质谱软件为ＡｇｉｌｅｎｔＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ工作站ꎻＸＳ２０５ＤＵ百万分之一电子天平(瑞士梅特勒托利多公司)ꎮＡｇｉｌｅｎｔＲＲＨＤＣ１８(２.１ｍｍˑ１００ｍｍꎬ１.８μｍꎬ填料:十八烷基硅烷键合硅胶ꎻＡｇｉｌｅｎｔ公司)ꎮ３－氟－４－氨基苯酚对照品(批号:Ｐ１１５６８１１ꎬ纯度:９８％)ꎬ３－三氟甲基－４－氯异氰酸苯酯对照品(杭州华东医药集团新药研究院有限公司ꎬ批号:１９１２０１ꎬ纯度:９９.７６％)ꎻ瑞戈非尼(批号:ＲＧＦＮ－Ｂ－１９０９０１㊁Ｚ１９３－Ａ１９１１００１ꎬ由Ａ公司提供)ꎻ甲醇(默克试剂有限公司)㊁异丙醇㊁甲酸(阿拉丁有限公司)均为色谱级ꎮ２㊀方法与结果２.１㊀色谱条件㊀液相色谱柱:ＡｇｉｌｅｎｔＲＲＨＤＣ１８(２.１ｍｍˑ１００ｍｍꎬ１.８μｍ)ꎻ流速０.３ｍＬｍｉｎ－１ꎻ０.０５％甲酸水为流动相Ａꎬ甲醇为流动相Ｂꎬ梯度洗脱(０~１.２ｍｉｎꎬ１０％Ｂꎻ１.２~４.０ｍｉｎꎬ１０％Ｂң６０％Ｂꎻ４.０~８.０ｍｉｎꎬ６０％Ｂꎻ８.０~１３.０ｍｉｎꎬ９５％Ｂꎻ１３.０~１３.１０ｍｉｎꎬ９５％Ｂң１０％Ｂꎻ１３.１０~１５.０ｍｉｎꎬ１０％Ｂ)ꎻ柱温３５ħꎻ进样体积５μＬꎮ取０.６ｎｇｍＬ－１混标对照品溶液ꎬ在ＭＲＭ模式下进样分析ꎬ结果如图２所示ꎬ各杂质之间分离度良好ꎮ２.２㊀质谱条件㊀采用电喷雾离子源(ＡＪＳＥＳＩ)ꎬ正负离子检测模式ＭＲＭ采集(ＳＭ２正离子模式㊁ＳＭ３㊀ＳＭ２[３－氟－４－氨基苯酚(３－Ｆｌｕｏｒｏ－４－ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｌ)]ꎻＳＭ３[３－三氟甲基－４－氯异氰酸苯酯(３－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌ￣ｃｈｌｏｒｏｉｓｏｃｙａｎａｔｅ)]图２㊀混合对照品溶液总离子流图负离子模式)ꎬ参数见表１ꎮ喷雾电压为３.５ｋＶꎬ鞘气为２５０ħꎬ鞘气流速为１１Ｌｍｉｎ－１ꎬ雾化气为４５ｐｓｉꎬ干燥气温度为３００ħꎬ干燥气流速为５Ｌｍｉｎ－１ꎮ母离子及子离子:取０.６μｇｍＬ－１混标对照品溶液ꎬ在Ｓｃａｎ模式下进样ꎬ进行ＭＳ分析ꎬ两种基因毒性杂质的质谱图如图４所示ꎬ其中３－氟－４－氨基苯酚的母离子为ｍ/ｚ１２８.０５ꎬ３－三氟甲基－４－氯异氰酸苯酯的母离子为ｍ/ｚ２８０.００ꎮ各基因毒性杂质的ＭＲＭ参数见表１ꎬ定量离子及定性离子的选择见表１ꎮ表１㊀ＭＲＭ采集参数设置化合物类型母离子(ｍ/ｚ)子离子(ｍ/ｚ)碰撞能量/ｅＶ碎裂电压/Ｖ扫描时间/ｍｓＳＭ２(ＥＳＩ＋)ＳＭ３(ＥＳＩ－)定量离子１２８.０５１０８１７定性离子１２８.０５８１.１２５定量离子２８０２１９.９１３定性离子２８０１９９.９２５８５１１２１００㊀ＳＭ２[３－氟－４－氨基苯酚(３－ｆｌｕｏｒｏ－４－ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｌ)]ꎻＳＭ３[３－三氟甲基－４－氯异氰酸苯酯(３－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌ￣ｃｈｌｏｒｏｉｓｏｃｙａｎａｔｅ)]图３㊀两种基因毒性杂质的质谱图２.３㊀混标对照品溶液㊀精密称取３－氟－４－氨基苯酚对照品㊁３－三氟甲基－４－氯异氰酸苯酯对照品各约６ｍｇꎬ加稀释剂异丙醇溶解并稀释成６ｎｇｍＬ－１的混标对照品储备液ꎮ精密量取适量ꎬ稀释１０倍ꎬ作为０.６ｎｇｍＬ－１混标对照品溶液ꎮ２.４㊀供试品溶液㊀取本品约２０ｍｇꎬ精密称定ꎬ置２０ｍＬ容量瓶ꎬ用稀释剂溶解并稀释到刻度ꎬ摇匀ꎻ再精密量取０.１ｍＬꎬ置１０ｍＬ容量瓶ꎮ异丙醇稀释至刻度ꎬ摇匀ꎬ作为供试品溶液(１０μｇｍＬ－１)ꎮ２.５㊀１００％加标供试品溶液㊀取本品约２０ｍｇꎬ精密称定ꎬ置２０ｍＬ量瓶中ꎬ用异丙醇溶解稀释至刻度ꎬ摇匀ꎻ再精密量取０.１ｍＬꎬ置１０ｍＬ容量瓶ꎬ加入１ｍＬ对照品储备液后ꎬ再用异丙醇稀释至刻度ꎬ摇匀ꎬ作为１００％加标供试品溶液ꎮ２.６㊀方法学考察㊀２.６.１㊀专属性试验㊀取稀释剂照上述条件进行试验ꎬ记录色谱图ꎬ结果显示稀释剂不干扰测定ꎬ表明该方法专属性良好ꎮ２.６.２㊀线性关系㊁检测限和定量限㊀精密量取混标对照品储备液适量ꎬ加稀释剂稀释得到浓度分别为０.１５㊁０.３㊁０.４５㊁０.６㊁０.９㊁１.２ｎｇｍＬ－１的混标对照品溶液ꎬ进样分析ꎬ绘制标准曲线ꎬ得线性方程(见表２)ꎮ逐步稀释ꎬ考察定量限及检测限(见图４)ꎮ表２㊀瑞戈非尼中两种基因毒性杂质的线性范围㊁定量检测限及精密度参数ＳＭ２ＳＭ３线性方程Ｙ＝４７９９.５Ｘ＋２７.１Ｙ＝８９３.３Ｘ＋２７.１范围/ｎｇｍＬ－１０.１５~１.１７０.１５~１.１９ｒ０.９９９９０.９９９１检测限/ｎｇｍＬ－１０.０６０.０６定量限/ｎｇｍＬ－１０.１５０.１５精密度ＲＳＤ(％)１.３２１.９７中间精密度ＲＳＤ(％)２.５３２.２４图４㊀定量限和检测限ＭＲＭ质谱图２.６.３㊀稳定性试验㊀取２.３项下０.６ｎｇｍＬ－１的混标对照品溶液ꎬ ２.５项下１０μｇｍＬ－１的１００％加标供试品溶液ꎬ连续进样１６ｈ进行分析ꎬ各峰面积偏离度的绝对值在８ｈ内均小于１７.２２％ꎬ表明对照品溶液和１００％加标供试品溶液在８ｈ内稳定性良好ꎮ２.６.４㊀准确度和精密度试验㊀精密称取瑞戈非尼(批号:ＲＧＦＮ－Ｂ－１９０９０１㊁Ｚ１９３－Ａ１９１１００１)约２０ｍｇꎬ一式１２份ꎬ分别置２０ｍＬ量瓶中ꎬ用异丙醇溶解稀释至刻度ꎬ摇匀ꎻ再精密量取０.１ｍＬꎬ置１０ｍＬ容量瓶ꎬ精密加入２.３项下浓度为６ｎｇｍＬ－１的混标对照品储备液溶液０.２５㊁０.５㊁１.０㊁１.５ｍＬꎬ分别溶解并稀释至刻度ꎬ摇匀ꎬ即得低(０.１５ｎｇｍＬ－１ꎬ３份)㊁中(０.３０ｎｇｍＬ－１ꎬ３份)㊁高(０.６０ｎｇｍＬ－１ꎬ３份)㊁极高(０.９０ｎｇｍＬ－１ꎬ３份)４个浓度的供试品加标溶液ꎬ取混标对照品溶液和各加标供试品溶液分别进样分析ꎬ外标法计算回收率结果见表３ꎬ各基因毒性杂质回收率均在９０.６４％~１０５.４４％之间ꎬＲＳＤ均小于３.５０％ꎬ表明各基因毒性杂质回收率和精密度良好ꎮ２.７㊀样品测定㊀取瑞戈非尼供试品２批(批号:ＲＧＦＮ－Ｂ－１９０９０１㊁Ｚ１９３－Ａ１９１１００１)ꎬ每批精密称取２份约２０ｍｇꎬ置２０ｍＬ量瓶中ꎬ加稀释剂溶解并稀释至刻度ꎬ摇匀ꎻ再精密量取０.１ｍＬꎬ置１０ｍＬ容量瓶ꎬ异丙醇稀释至刻度ꎬ摇匀ꎬ作为供试品溶液(１０μｇｍＬ－１)ꎬ进样分析ꎬ结果２批次瑞戈非尼中ＳＭ２均未检出ꎬＳＭ３均有检出(见表４)ꎮ表３㊀瑞戈非尼中各基因毒性杂质的回收率化合物加入量测得量回收率平均回收ＲＳＤ(％)ＳＭ３１.５０２.９９５.９８８.９８２.７７１０１.３３２.７８１００.６７３.９７９０.６４４.１３９５.９９４.３２１０２.３４７.０５９６.８２７.２２９９.６７７.４２１０２.８４１０.２５１００.００１０.０９９８.３３１０.２３９９.８９９９.１５３.４１表４㊀瑞戈非尼中基因毒性杂质检测结果批号ＳＭ２含量(％)ＳＭ３含量(％)Ｚ１９３－Ａ１９１１００１０.０００００.００１３６ＲＧＦＮ－Ｂ－１９０９０１０.０００００.００４１４３㊀讨论３.１㊀瑞戈非尼的合成工艺㊀如图１所示ꎬ以３－氟－４－氨基苯酚和Ｎ－甲基－４－氯－２－吡啶甲酰胺为原料㊁氢氧化钠为碱ꎬＴＨＦ为溶剂ꎬ回流反应得到中间体４－(４－氨基－３－氟苯氧基)－Ｎ－甲基吡啶－２－甲酰胺ꎬ该中间体再与４－氯－３－三氟甲基苯胺以羰基连接得到瑞戈非尼无水物(４－[４－[[[４－氯－３－(三氟甲基)苯基]氨基甲酰]氨基]－３－氟苯氧基]－Ｎ－甲基吡啶－２－甲酰胺)ꎬ加水而成ꎮ合成路线中涉及多个起始物料及中间体带有基因警示结构ꎬ因此ꎬ必须对瑞戈非尼合成路线中引入的带有基因警示结构的潜在基因毒性杂质进行控制ꎮ３.２㊀控制限度㊀参照瑞戈非尼片药品使用说明书ꎬ建议每日最低剂量为８０ｍｇꎬ每日最高剂量为１６０ｍｇꎮ因为瑞戈非尼为抗肿瘤用药ꎬ可以不以ＩＣＨＭ７推荐的最严格的毒理学关注阈值(ＴＴＣꎬ１.５μｇｄ－１)为控制限制ꎮ本研究基于治疗期ꎬ以相对严格的１~１０年治疗期的ＴＴＣ(１０μｇｄ－１)为控制限制计算ꎬ瑞戈非尼中基因毒性杂质限度应为６２.５ˑ１０－６ꎬ本研究以６０ˑ１０－６作为瑞戈非尼中基因毒性杂质的控制限度ꎮ本次研究用样品中未检出ＳＭ２ꎬ检出的ＳＭ３分别为１３.６ˑ１０－６㊁４１.４ˑ１０－６ꎬ均符合限度要求ꎬ但ＳＭ３检出量已超３０％限度ꎬ值得关切ꎮ３.３㊀色谱条件的优化㊀色谱条件优化试验中ꎬ探索了甲醇㊁异丙醇和乙腈３种有机相(Ｂ相)ꎬ水相(Ａ相)中添加不同比率的酸(０.１％甲酸水ꎬ０.０５％甲酸水和０.１％乙酸水)对分离度和灵敏度的影响ꎮ结果显示ꎬ采用ＡｇｉｌｅｎｔＲＲＨＤＣ１８色谱柱ꎬ当流动相０.０５％甲酸水溶液－甲醇梯度洗脱时ꎬ３－氟－４－氨基苯酚(ＳＭ２)㊁３－三氟甲基－４－氯异氰酸苯酯(ＳＭ３)响应较好ꎬ且两个化合物分离度良好ꎬ故流动相中选择０.０５％甲酸水ꎮ本试验考察了流速０.２~０.４ｍＬｍｉｎ－１范围内对苯胺类物质响应和峰形的影响ꎬ发现流速０.３ｍＬｍｉｎ－１时ꎬＳＭ２ꎬＳＭ３离子化效率最高ꎬ出峰时间合适ꎬ且峰形较好ꎮ３.４㊀质谱解析㊀３－氟－４－氨基苯酚的质谱图中ｍ/ｚ１２８.０５为[Ｍ＋Ｈ]＋离子ꎬ主要的碎片离子有ｍ/ｚ１０８和ｍ/ｚ８１.１ꎬ其中ｍ/ｚ１０８为去氟基产物ꎬ反映了３－氟－４－氨基苯酚的结构特征ꎮ试验对３－氟－４－氨基苯酚２个离子对ｍ/ｚ１２８.０５ң１０８和ｍ/ｚ１２８.０５ң８１.１的ＭＲＭ参数见表１ꎬ其中ꎬ离子对ｍ/ｚ１２８.０５ң１０８的信噪比较离子对ｍ/ｚ１２８.０５ң８１.１更高ꎬ因此选择ｍ/ｚ１２８.０５ң１０８作为定量离子对ꎬｍ/ｚ１２８.０５ң８１.１作为定性离子对ꎮ本法中ＳＭ３检测采用异丙醇衍生化ꎬ分析对象为ＳＭ３与异丙醇衍生后的产物ꎮ衍生产物精确分子量为２８１.０４ꎬ其[Ｍ－Ｈ]－为２８０ꎬ反应过程见图５ꎮ图５㊀ＳＭ３衍生化反应(下转第５２５页)ｆａｔｔｙａｃｉｄｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ:ａｎｅｗｆａｍｉｌｙｏｆａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒａｇｅｎｔｓ?[Ｊ].ＣｕｒｒＰｈａｒｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌꎬ２００６ꎬ７(６):４８３－４９３.[８７]ＣＨＥＮＸꎬＨＵＡＮＧＫꎬＨＵＳꎬｅｔａｌ.ＦＡＳＮ－ＭｅｄｉａｔｅｄＬｉｐｉｄＭｅｔａｂｏｌｉｓｍＲｅｇｕｌａｔｅｓＧｏｏｓｅＧｒａｎｕｌｏｓａＣｅｌｌｓＡｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄＳｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｎＰｈｙｓｉｏｌꎬ２０２０(１１):６００.[８８]ＣＨＯＹＫꎬＳＯＮＹꎬＫＩＭＳＮꎬｅｔａｌ.ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１０ａ－５ｐｒｅｇｕｌａｔｅｓｍａｃｒｏｐｈａｇｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｓｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ[Ｊ].ＭｏｌＭｅｔａｂꎬ２０１９(２９):８６－９８.[８９]ＸＵＥＭꎬＹＡＮＧＭｘｉｎｇꎬＺＨＡＮＧＷꎬｅｔａｌ.Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎꎬｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓꎬａｎｄｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉｃｅｆｆｅｃｔｏｆｂｅｒｂｅｒｉｎｅｌｏａｄｅｄｓｏｌｉｄｌｉｐｉｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ[Ｊ].ＩｎｔＪＮａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅꎬ２０１３(８):４６７７－４６８７.[９０]ＸＵＥＭꎬＺＨＡＮＧＬꎬＹＡＮＧＭＸꎬｅｔａｌ.Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ－ｌｏａｄｅｄｓｏｌｉｄｌｉｐｉｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓａｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｉｎｔｈｅｌｉｖｅｒａｎｄａｍｅｌｉｏｒａｔｅｈｅｐａｔｏｓｔｅａｔｏｓｉｓｉｎｄｂ/ｄｂｍｉｃｅ[Ｊ].ＩｎｔＪＮａｎｏ￣ｍｅｄｉｃｉｎｅꎬ２０１５(１０):５０４９－５０５７.[９１]ＺＨＡＯＪꎬＺＨＡＯＱꎬＬＵＪＺꎬｅｔａｌ.ＮａｔｕｒａｌＮａｎｏ－ＤｒｕｇＤｅ￣ｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｉｎＣｏｐｔｉｄｉｓＲｈｉｚｏｍａＥｘｔｒａｃｔｗｉｔｈＭｏｄｉｆｉｅｄＢｅｒｂｅｒｉｎｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅＰｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ[Ｊ].ＩｎｔＪＮａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅꎬ２０２１(１６):６２９７－６３１１.[９２]ＤＵＯＮＧＴＴꎬＩＳＯＭÄＫＩＡꎬＰＡＡＶＥＲＵꎬｅｔａｌ.Ｎａｎｏｆｏｒｍｕ￣ｌａｔｉｏｎａｎｄＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＯｒａｌＢｅｒｂｅｒｉｎｅ－ＬｏａｄｅｄＬｉｐｏｓｏｍｅｓ[Ｊ].Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓꎬ２０２１ꎬ２６(９):２５９１.[９３]ＳＡＨＩＢＺＡＤＡＭＵＫꎬＺＡＨＯＯＲＭꎬＳＡＤＩＱＡꎬｅｔａｌ.Ｂｉｏ￣ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙａｎｄｈｅｐａｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆｂｅｒｂｅｒｉｎｅａｎｄｉｔｓｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｐｒｅｐａｒｅｄｂｙｌｉｑｕｉｄａｎｔｉｓｏｌ￣ｖｅｎｔｍｅｔｈｏｄ[Ｊ].ＳａｕｄｉＪＢｉｏｌＳｃｉꎬ２０２１ꎬ２８(１):３２７－３３２.[９４]ＣＨＯＷＹＬꎬＳＯＧＡＭＥＭꎬＳＡＴＯＦ.１３－Ｍｅｔｈｙｌｂｅｒｂｅｒｉｎｅꎬａｂｅｒｂｅｒｉｎｅａｎａｌｏｇｕｅｗｉｔｈｓｔｒｏｎｇｅｒａｎｔｉ－ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｎｍｏｕｓｅ３Ｔ３－Ｌ１ｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１６ꎬ６(１):３８１２９.[９５]ＲＥＢＥＬＬＯＣＪꎬＧＲＥＥＮＷＡＹＦＬ.Ｏｂｅｓｉｔｙｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ[Ｊ].ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＩｎｖｅｓｔｉｇＤｒｕｇｓꎬ２０２０ꎬ２９(１):６３－７１.(收稿日期:２０２２－１２－３１)(上接第４８８页)㊀㊀ＳＭ３衍生产物ꎬ在质谱离子源中ꎬ子离子为酯键断裂后重排的ｍ/ｚꎬ碎裂途径见图６ꎮ图６㊀ＳＭ３子离子裂解途径本研究建立了超高效液相色谱－串联质谱法测定瑞戈非尼中的２种基因毒性杂质(３－氟－４－氨基苯酚(ＳＭ２)㊁３－三氟甲基－４－氯异氰酸苯酯(ＳＭ３)ꎬ并进行了方法学验证ꎬ可以有效控制瑞戈非尼的潜在基因毒性杂质ꎮ该方法专属性强ꎬ灵敏度高ꎬ满足基因毒性杂质测定要求ꎬ可以作为瑞戈非尼原料药中基因毒性杂质的质控方法ꎮ参考文献:[１]㊀ＥｕｒｏｐｅａｎＭｅｄｉｃｉｎｅｓＡｇｅｎｃｙ(ＥＭＡ).ＧｕｉｄｅｌｉｎｅｏｎｔｈｅＬｉｍｉｔｓｏｆＧｅｎｏｔｏｘｉｃＩｍｐｕｒｉｔｉｅｓ(欧洲药品管理局关于基因毒性杂质限度指导原则)[ＥＢ/ＯＬ].[２０１５－０３－０２].ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.Ｅｍａ.Ｅｕｒｏｐａ.ｅｕ/ｄｏｃｓ/ｅｎ＿ＧＢ/ｄｏｃｕｍｅｎｔ＿ｌｉ￣ｂｒａｒｙ/Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＿ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ/２００９/０９/ＷＣ５００００２９０３.ｐｄｆ.[２]ＥｕｒｏｐｅａｎＭｅｄｉｃｉｎｅｓＡｇｅｎｃｙ(ＥＭＡ).ＱｕｅｓｔｉｏｎｓａｎｄＡｎｓｗｅｒｓｏｎｔｈｅＧｕｉｄｅｌｉｎｅｏｎｔｈｅＬｉｍｉｔｓｏｆＧｅｎｏｔｏｘｉｃＩｍ￣ｐｕｒｉｔｉｅｓ[ＥＢ/ＯＬ].(２０１０－０９－２３)[２０１５－０３－０２].ｈｔｔｐ//ｗｗｗ.ｅｍａ.ｅｕｒｏｐａ.ｅｕ/ｄｏｃｓ/ｅｎ＿ＧＢ/ｄｏｃｕｍｅｎｔ＿ｌｉｂｒａｒｙ/Ｓｃｉ￣ｅｎｔｉｆｉｃ＿ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ/２００９/０９/ＷＣ５００００２９０７.ｐｄｆ.[３]ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ(ＦＤＡ).ＧｅｎｏｔｏｘｉｃａｎｄＣａｒ￣ｃｉｎｏｇｅｎｉｃＩｍｐｕｒｉｔｉｅｓＩｎＤｒｕｇＳｕｂｓｔａｎｃｅｓａｎｄＰｒｏｄｕｃｔｓ:ＲｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄＡｐｐｒｏａｃｈｅｓ.[２０１５－０８－２６].[４]ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＨａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎｏｆＴｅｃｈｎｉｃａｌＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒＲｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓｆｏｒＨｕ￣ｍａｎＵｓｅ(ＩＣＨ).ＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔａｎｄＣｏｎｔｒｏｌｏｆＤＮＡＲｅａｃｔｉｖｅ(Ｍｕｔａｇｅｎｉｃ)ＩｍｐｕｒｉｔｉｅｓｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓｔｏＬｉｍｉｔＰｏ￣ｔｅｎｔｉａｌＣａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃＲｉｓｋＭ７(Ｒ１).[２０１５－０８－２６].[５]ＲＡＭＡＮＮＶＶＳＳꎬＰＲＡＳＡＤＡＶＳＳꎬＲＥＤＤＹＫＲ.Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓｉｎｄｒｕｇｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ:ａｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｉｎｄｕｓｔｒｙｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ[Ｊ].ＪＰｈａｒｍＢｉｏｍｅｄＡｎａｌꎬ２０１１ꎬ５５(４):６６２－６６７.[６]ＳＺＥＫＥＬＹＧꎬＡＭＯＲＥＳＤＥＳＯＵＳＡＭＣꎬＧＩＬＭꎬｅｔａｌ.ＧｅｎｏｔｏｘｉｃＩｍｐｕｒｉｔｉｅｓｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ:ＳｏｕｒｃｅｓꎬＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｓꎬａｎｄＭｉｔｉｇａｔｉｏｎ[Ｊ].ＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓꎬ２０１５ꎬ１１５(１６):８１８２－８２２９.[７]甘勇军ꎬ王以武ꎬ张量ꎬ等.瑞戈非尼的合成工艺优化[Ｊ].中国医药工业杂志ꎬ２０２０ꎬ５１(２):１９６－１９９.[８]曹琳ꎬ罗淑青ꎬ章燕ꎬ等.ＬＣ－ＱＱＱ－ＭＳ/ＭＳ分析苯磺酸氨氯地平中痕量苯磺酸酯类基因毒性杂质[Ｊ].中国现代应用药学ꎬ２０２０ꎬ３７(１１):１２９６－１３００.[９]芦飞ꎬ邢珊珊ꎬ王咏.ＬＣ－ＭＳ测定醋酸甲羟孕酮中对甲苯磺酸甲酯及对甲苯磺酸乙酯的含量[Ｊ].中国现代应用药学ꎬ２０１８ꎬ３５(５):６５７－６５９.(收稿日期:２０２３－０２－２４)。

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多重激酶抑制剂瑞格非尼对人源性异种移植物胃癌模型的抗肿瘤活性
建立模型
给药
数据分析
分析结果
免疫组化

WB
模型的选取与建立
1、测试使用剂量，得出第一个结论瑞格非尼抑制胃癌异种移植物的生长通过剂量依赖的方式
2、选择10mg／kg／day的剂量并证明可以抑制胃癌异种移植物的生长
瑞格非尼有效的抗肿瘤活性是独立的，不依赖于任何组织学类型，因为实验中包含了肠型，弥漫性，混合型。但肿瘤间变异不一致，且数量较少。
10
5、瑞格非尼可以诱导细胞坏死和中心性坏死
本文涉及的信号通路
1、MAPK：丝裂原活化蛋白激酶 2、PI3K／AKT／mTOR：磷酯酰激酶3/蛋白激酶B／雷帕霉素靶蛋白 3、ERK：磷酸化的细胞外调节蛋白激酶 4、PUMA：受p53基因上调表达的凋亡调控基因
总结
1、瑞格非尼抑制胃癌异种移植物的生长通过剂量依赖的方式 2、10mg／kg／day的剂量可以抑制胃癌异种移植物的生长 3、瑞格非尼可以减少胃癌肿瘤血管生成 4、瑞格非尼可以抑制胃癌肿瘤细胞的激增 5、瑞格非尼可以诱导胃癌细胞坏死和中心性坏死
3、瑞格非尼可以减少肿瘤血管生成
TIE2只存在于宿主衍生的基质细胞和血管中，不存在于肿瘤细胞中，瑞格非尼组和载体组无差异
4、瑞格非尼可以抑制肿瘤细胞的激增
肿瘤细胞的激增依赖于磷酸化的组蛋白H3阳性细胞，在6个实验组中，瑞格非尼对比载体组 p- Ser histone H3-positive cells减少2—5倍