糖类消化酶活性的测定方法及原理
葡萄糖淀粉酶的活力测定
葡萄糖淀粉酶的活力测定一．原理：葡萄糖淀粉酶（糖化酶）在一定的条件下能水解生成葡萄糖，葡萄糖的醛基被弱氧化剂次碘酸钠氧化。
过量的碘用硫代硫酸钠滴定。
从碘的减少量计算葡萄糖的量，从而计算酶活力。
二．试剂与材料：1.2%可溶性淀粉液：称取可溶性淀粉2g，以少许蒸馏水调匀，侵入80ml的沸水中，继续煮至透明状，冷却后，加水定容至100ml2.PH4.6，0.1mol/L醋酸缓冲液：0.1mol/L苏酸溶液与0.1mol/L醋酸钠溶液等体积混合。
3.0.1mol/L碘液：称取36g碘化钾，溶于100ml蒸馏水中，加入14g碘，逐渐溶解，加3滴盐酸，定容至1000ml4.0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g NAOH，用水溶解，定容至1000ml5.1mol/L硫酸溶液。
量取56ml浓硫酸，倒入适量水中，用水稀释至1000ml6.0.05mol/L硫代硫酸钠溶液：称取25g硫代硫酸钠，0.2g碳酸钠，溶于1000ml煮沸冷却后的水中，存于棕色瓶。
放置一周后，用0.1mol/L重络酸钾滴定。
7.0.5%淀粉指示剂：称取0.5g可溶性淀粉用少量水调匀。
倒入80ml沸水中，继续煮至透明，冷却后，定溶100ml三．操作方法：1.吸取2%可溶性淀粉液10ml，加入PH4.6醋酸缓冲液5ml，混匀后于40℃水浴中预热10min2.加入酶液1ml，于40℃，反应10min。
反应结束时，沸水中煮10min，以终止酶反应。
3.吸取上述反应液5ml于碘量瓶中，加入0.1mol/L碘液5ml及0.1mol/L NAOH溶液5ml，混匀，于室温下暗处放置15min，加入2mol/L硫酸酸化。
4.以0.5%可溶性淀粉液作为指示剂，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至蓝色消失为终点。
记录0.05mol/L硫代硫酸钠消耗的毫升数（A），以及空白试验消耗的硫代硫酸钠毫升数。
四．结果计算：在上述条件下，每小时催化淀粉水解生成1mg葡萄糖的酶量定义为一个酶力单位。
酶活性的测定原理
酶活性的测定原理
酶活性是指单位时间内酶所催化的底物转化的速率。
测定酶活性的原理主要基于酶和底物之间的反应，通常采用比色法、发光法、电化学法等不同技术来测量产物的生成量。
一种常用的测定酶活性的方法是比色法，该方法主要通过测量底物转化后所产生的色素的强度或吸收率来反映酶活性的大小。
具体操作步骤如下：
1. 首先，准备好所需的实验试剂和设备，包括底物、酶溶液、缓冲液、比色剂等。
2. 将酶溶液加入适当的量的缓冲液中，以调节pH值和酶的浓度。
此步骤有助于提供适宜的反应环境，以发挥酶的最佳催化效果。
3. 在试管中加入适量的底物溶液。
4. 立即加入酶溶液，并立即开始计时。
为了确保测量的准确性和可比性，要确保每个实验条件下反应时间一致。
5. 在一定时间内（通常为几分钟或数十分钟），停止反应。
这可以通过加入酶活性停止剂、改变反应条件或其他合适的方法来实现。
6. 加入比色剂，使产物产生明显的颜色。
比色剂的选择要根据具体试剂和底物的特性来进行，以保证在所使用的检测设备
（如分光光度计）的波长范围内有明显的差异。
7. 使用合适的仪器（如分光光度计）测量产生的色素的吸光度或强度。
根据吸光度或强度的变化，可以通过对比标准曲线或对照组的结果，计算出酶活性的数据。
需要注意的是，在测定酶活性时，实验条件的控制非常重要。
包括温度、pH值、底物浓度和酶浓度等因素的选择和控制，都会对测定结果产生影响。
因此，在进行酶活性测定时，应该对这些因素进行合理的控制和调节，以提高实验结果的准确性和可比性。
糖化酶活力测定(精)
糖化酶活力测定1. 定义1g 固体酶粉(或 1ml 液体酶,于 40℃、 pH 值为 4.6的条件下, 1h 分解可溶性淀粉产生 1mg 葡萄糖,即为 1个酶活力单位,以 u/g(u/ml表示。
2. 原理糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。
葡萄糖分子中含有醛基, 能被次碘酸钠氧化, 过量的次碘酸钠酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液滴定,计算酶活力。
3. 试剂和溶液(1乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 为 4.6。
称取乙酸钠(CH3COONa·3H2O 6.7g ,溶于水中,加冰乙酸(CH3COOH 2.6ml ,用水定容至 1000ml 。
配好后用 pH 计校正。
(2硫代硫酸钠标准溶液(Na2S2O3, 0.05mol/L。
(3碘溶液(1/2I2, 0.1mol/L。
(4氢氧化钠溶液(NaOH , 0.1mol/L。
(5 200g/L可溶性氢氧化钠溶液。
(6硫酸溶液(2mol/L。
(7 20g/L可溶性淀粉溶液。
(8 10g/L淀粉指示液。
4. 仪器和设备恒温水浴锅、秒表、比色管、玻璃仪器。
5. 步骤(1 待测酶液的制备称取酶粉 1~2g , 精确至 0.0002g (或吸取液体酶 1.00ml , 先用少量的乙酸缓冲液溶解, 并用玻璃棒捣研, 将上清液小心倾入容量瓶中。
沉渣部分再加入少量缓冲液,如此捣研 3~4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度(估计酶活力在 100~250u/ml范围内,摇匀。
通过 4层纱布过滤,滤液供测定用。
(2测定于甲、乙两支 50ml 比色管中,分别加入可溶性淀粉 25ml 及缓冲液 5ml ,摇匀后,于 40℃恒温水浴中预热 5min 。
在甲管(样品中加入待测酶液 2ml , 立刻摇匀, 在此温度下准确反应 30min , 立刻各加入氢氧化钠溶液 0.2ml , 摇匀,将两管取出迅速冷却,并于乙管(空白中补加待测酶液 2ml ,吸取上述反应液与空白液 5ml ,分别置于碘量瓶中,准确加入碘溶液 10ml ,再加氢氧化钠溶液 15ml ,摇匀,密塞,于暗处反应15min 。
食品中酶活性的测定方法与作用评价
食品中酶活性的测定方法与作用评价食品中的酶活性是指食品中含有的酶的活性水平。
酶是一种能够加速化学反应速率的蛋白质分子，它们在生物体内起着至关重要的作用。
在食品中，酶的活性对于食品的品质、储存和加工都有着深远的影响。
因此，准确测定食品中的酶活性，并评价其对食品的作用，对于食品工业及消费者来说都具有重要意义。
目前，常见的测定食品中酶活性的方法主要有两种，分别是酶动力学法和酶质谱分析法。
酶动力学法通过测定酶催化反应速率的变化来间接测定酶的活性。
首先，确定反应所需的底物和酶的适宜浓度，然后通过改变反应体系中底物或酶的浓度，观察反应速率的变化。
利用这种方法，可以推算出酶的催化反应速率常数和底物的最大转化速率。
最常用的是Michaelis-Menten动力学方程和Lineweaver-Burk双倒数图法。
酶动力学法可以测定食品中多种酶的活性，并通过调整酶活性来改善食品的加工性和品质。
酶质谱分析法则是通过质谱仪的技术手段直接测定酶的活性。
质谱仪是一种能够测定物质分子质量的仪器，通过将食品样品中的酶分子离子化，并根据其质量比例进行分离和测定。
这种方法具有高灵敏度和高分辨率的特点，可以在食品中快速、准确地确定酶的活性水平，但由于设备复杂和价格昂贵，应用较为有限。
无论使用何种方法进行酶活性的测定，评价酶在食品中的作用都是至关重要的。
首先，酶活性的测定可以评价食品的新鲜度。
以水果为例，水果中的酶在成熟过程中发挥着重要的作用。
通过测定水果中的酶活性，可以了解水果的成熟程度和品质。
当果实成熟时，酶的活性会降低，从而导致果肉变软、变甜。
相反，当果实过度成熟或腐烂时，酶活性将会增加，导致果肉褐变和气味恶化。
因此，通过监测酶活性可以及时评估水果的新鲜度，对于确定最佳食用时机具有重要意义。
其次，酶活性的测定可以评价食品的加工品质。
食品加工过程中，酶常常被用于提高食品的口感和质感。
以面包为例，加入面团中的面包酵母能够产生酶来催化面团中的淀粉转化为糖，从而使面包更加松软和香甜。
酶活力测定方法
空白和对照试验： 空白试验：是指杂质反应和自发反应引起
的变化量，它提供的是未知因素的影响。空 白值可以通过不加酶，或不加底物，或二者 都加（酶预先经过失效处理）。
对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得 的结果，主要作为比较或标定的标准。
3）测定方法：
取样测定法：
酶变性剂：5% 三氯醋酸 3% 高氯酸 其它酸、碱、醇类
A1 - A2
0.003 : 1 =
:X
T
A1 - A2 0.003T
每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
A1 - A2
0.003TW
A1—A 2 P=
0.003 T W
重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽 图分析
肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其 生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方 法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ-ＰＡＧＥ微量肽 图法和胰蛋白酶切ＲＰ ＨＰＬＣ肽图法。返回练习与思考
1．何谓：生化药物、生物技术药物、 基因工程药物和生物制品？ 2．生化药物和基因工程药物各分哪 几种？ 3．与化学合成药物的分析相比，生 物药物的分析有何特点？
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加热：使酶失效
酶反应
不同的时间取样
终止反应
测定
连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法： 紫外-可见分光光度法 旋光法 荧光分光光度法 电化学测定法 酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶
活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学 反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越 高。
食品中酶活性的检测与影响因素研究
食品中酶活性的检测与影响因素研究食品中的酶活性是衡量食品品质和食品加工过程中酶的作用程度的重要指标。
酶是一种生物催化剂，具有高效的催化特性和广泛的应用价值。
本文将综合分析食品中酶活性的检测方法以及影响酶活性的因素，并从温度、pH值、浓度、金属离子等方面进行详细探讨。
一、食品中酶活性的检测方法食品中酶活性的检测方法主要包括酶活性测定法、酶底物转化率法和酶解程度测定法等。
酶活性测定法是通过测定酶催化反应所产生的产物来确定酶的催化活性，常见的方法有光谱法、色谱法、电泳法等。
酶底物转化率法是通过测定酶对底物的转化率来确定酶的催化活性，常见的方法有酶标仪法、比色法、滴定法等。
酶解程度测定法是通过测定酶催化底物的降解程度来确定酶的催化活性，常见的方法有滴定法、重量法、电导率法等。
在实际检测中，可以根据具体食品特点和要求选择适合的检测方法。
二、影响酶活性的因素1. 温度：温度是影响酶活性的重要因素之一。
一般来说，随着温度的升高，酶活性会增加，因为温度的升高可以增加酶分子的振动能量，加快反应速率。
然而，当温度过高时，酶分子的构象会发生改变，容易引起酶变性，导致酶活性下降甚至失活。
2. pH值：pH值是影响酶活性的另一个关键因素。
不同的酶在不同的pH值下具有最适宜的活性。
这是因为酶分子的酸碱性质和离子化状态会随着pH值的改变而发生变化。
一般来说，酶的酸碱性质会随着其功能性羧基和氨基的质子化和解质子化发生改变，从而影响酶的活性。
3. 浓度：底物浓度对酶活性也有一定的影响。
一般来说，当底物浓度较低时，酶活性受底物浓度限制，反应速率较慢。
随着底物浓度的增加，酶活性会逐渐提高，直至达到酶的最大催化速率。
然而，当底物浓度过高时，在酶的催化作用下，产物的积累和抑制效应会抑制酶的活性。
4. 金属离子：金属离子对酶活性也有重要影响。
一些金属离子可以作为酶的辅助因子，促进酶催化作用的进行，被称为激活剂。
例如，金属离子Mg2+常被用作酶的辅助因子，可以提高酶的催化活性。
测定糖化酶活性的方法
对照组
I2 NaIO
完全歧化反应， 无葡萄糖
NaIO3 I2
实验组
I2
NaIO
NaIO另一部分 歧化反应 生成NaIO3
NaIO一部分与 葡萄糖反应
I2
试剂与器材
1.糖化酶试剂；
2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角瓶、 pH计、电子天平；
3.试剂
2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋 酸缓冲液； 0.1mol/L碘液；0.1mol/L氢氧化钠 溶液； 2mol/L硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶 液；0.5%淀粉指示剂。
式中:
B——空白滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数；
A——酶液滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数（取3次滴定的平 均值）；
N——硫代硫酸钠的当量浓度。
180.1——葡萄糖的摩尔质量。
8/5——表示从8ml酶反应体系取出5ml反应液。
2——所加酶液为0.5ml，按定义为1ml。
60/10——表示酶反应时间为10min，按定义为1h。
（2）在上述条件下， 1ml酶液每分钟催化2% 淀粉溶液水解生成1μmol葡萄糖的酶量定义 为1个酶活力单位（U）：
酶活力单位（U/ml）=（B－A）×10-3 ×（N/2）× （8/5）×106×2 ×（1/10）
式中符号与前式相同，
其中：
10-3—— ml换算成L。
106—— μmol换算成mol。
4.以0.5%可溶性淀粉为指示剂（4-5滴即可）， 用0.1N硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终 点。记录0.1N硫代硫酸钠消耗的毫升数：酶 液样品（A）、空白对照（B）；
计算
(1)在上述条件下，1ml酶液每小时催化2%淀粉溶液生 成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位：
酶活性测定原理
酶活性测定原理
酶活性测定原理是通过测量酶催化反应所产生的产物或消耗的底物来确定酶的活性水平。
该方法基于酶与其底物之间的特异性相互作用，从而观察到底物的转化速率。
常用的酶活性测定方法包括以下几种：
1. 颜色反应法：根据酶催化反应产生的产物或消耗的底物与其他试剂发生特定反应而改变颜色。
通过测量反应后的溶液颜色的光密度或吸光度来确定酶活性水平。
2. 发光法：某些酶催化反应会发出特定的发光，可以利用光度计或荧光计来测量产生的光信号强度来判断酶的活性水平。
3. 吸收光谱法：酶活性测定过程中底物或产物的吸光度随着反应的进行而发生变化。
利用光度计测量底物或产物的吸光度值来确定酶的活性水平。
4. 放射性测定法：将放射性同位素标记在底物或产物上，通过测量放射性衰减情况来评估酶催化反应的速率和酶的活性水平。
这些酶活性测定方法可以选择合适的底物和试剂来识别特定的酶，并根据反应产物的生成或底物的耗尽来测定酶的活性水平。
通过对酶活性的测定，可以评估酶在生物体内的功能以及在疾病诊断和治疗中的应用。
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B1为对照管中麦芽糖的浓度（mg/ml）
V为酶促反应体积 D为酶液总体积
β 酶活性=(α ＋β )酶活性-α 酶活性
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糖类消化酶活性的测定方法 及原理（以淀粉酶为例）
资料查找：林俊凤、罗雨涵、刘恺妍 ppt制作：何叶 演讲者：杨麒麟淀Fra bibliotek酶的定义及 分类：
淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的 总称，按照其水解淀粉的作用方式，可 分为α -淀粉酶和β-淀粉酶等。α -淀粉酶 和β-淀粉酶是其中最主要的两种，存在
酶活性的定义： 指酶催化特定化学反应的能 力，其大小可用一定条件下 酶促反应速度来表示，酶促 反应速度可用单位时间内底 物的减少量或产物的增加量 来表示。
3 ,5-二硝基水杨酸比色法
①以1号管为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度，以 麦芽糖浓度（mg/ml）为横坐标，A540nm为纵坐标，用 Excel绘制标准曲线 ②取两只试管一只对照，一只测定——各加淀粉酶原液1ml— —70℃加热15min——冷却——向对照管加4ml0.4mol的
（3）实验操作
NaOH，终止酶活性。
③向各管中各加入柠檬酸缓冲液1mL。 ④将测定管与对照管于40℃中加热15min——各加入2mL40℃
预热的淀粉溶液——将2管混合均匀后立即用40℃水浴5min—
—取出后迅速向测定管加入4mLo0.4mol的NaOH ⑤取对照管和测定管中的溶液各2ml，分别加入刻度试管中—— 分别向两只试管加入2ml3,5-二硝基水杨酸——沸水浴5min— —冷却——稀释至20mL——混匀——以制作麦芽糖标准曲线 （2）实验材料 的1号试管为参比溶液，调零，测定540nm处吸光度——记录 淀粉酶液50ML 、恒温水浴锅、刻度试管、0.4mol的NaOH、1%淀粉、3,5-二 结果 硝基水杨酸、麦芽糖标准溶液（ 1mg/ml）、0.1molpH=5.6的柠檬酸缓冲液
通过标准曲线获得相应的麦芽糖含量（mg/ml）
按下列公式计算淀粉酶活性
α -淀粉酶活性=(A2-A1)*V*D/W 其中：A1为对照管中麦芽糖的浓度（mg/ml）
4 实验结果计算
A2为测定管中α -淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的浓度（mg/ml）
V为酶促反应体积 D为酶液总体积
W为样品鲜重
（α ＋β ）淀粉酶总活力=（B2-B1）*V*D/样品鲜重 其中：B2为(α ＋β )淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的浓度（mg/ml）
于禾谷类的种子中。β-淀粉酶存在于休
眠的种子中，而α -淀粉酶是在种子萌发 过程中形成的。
课本提要
实验原理：
1、在最适温度之前，淀粉酶的活性随着温度的升高而升高，达到 最适温度之后，淀粉酶的活性随着温度的升高而降低至失活。 2、淀粉水解反应：淀粉 蓝糊精－>紫糊精－>红糊精－>无色糊精 －>麦芽糖 遇碘呈现颜色：蓝色－> 蓝色－>紫色－>红色 －> 无色－>无色
（1）实验原理
α-淀粉酶：耐热不耐酸，70℃加热15min 仍保持活性，pH<3.6时钝化； β-淀粉酶：耐酸不耐热，70℃加热15min 即钝化 本实验采用加热法钝化β-淀粉酶，测定α淀粉酶的活性。具体方法：利用3,5-二硝 基水杨酸比色法来测定淀粉酶水解生成麦 芽糖的含量，以单位时间内淀粉酶分解生 成麦芽糖的量来表示淀粉酶活性大小，再 与非钝化条件下的（α＋β）总活性进行加 减运算得到另一个淀粉酶的活性