第二章 纯培养和显微技术

3、单细胞（孢子）分离法
解剖显微镜下用吸管挑选单细胞（孢子） 一般采用显微操作仪，在显微镜下进行； 操作难度与细胞或个体的大小成反比；
4、选择培养分离法
原理：
创造适于目的微生物生长条件； 使待分离的目的微生物成为优势菌； 抑制大多数其它非目的微生物；
• 方法：
• 1、利用选择培养基直接分离目的微生物 • 2. 富集培养
无菌操作：
在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行
二、微生物的分离纯培养技术
• 微生物的纯种分离： • 从多种混杂的微生物中，经某种技术或方法获 得单一菌株的过程。 • 微生物的纯培养物（pure culture)： • 一株菌种或一个培养物中的所有细胞或孢子都 是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代 •
• 暗视野显微镜原理： • 聚光系统加以改造，实现斜射照明，给样品照 明的光不直接穿过物镜，而是由样品反射或折 射后在进入物镜，所以样品是一个暗背景下显 现亮的物象。 • 暗视野显微镜的分辨率很高 • 荧光显微镜的原理： • 在紫外线的照射下，发荧光的物体会在黑暗的 背景下表现为光亮的有色物体
光学显微镜的特性
• 相差显微镜
• 暗视野显微镜
• 荧光显微镜
• 相差显微镜的原理： • 当光线通过透明的活细胞时，由于细胞内各部 分结构密度的差异（或折射率的不同)，而使 光波的相位发生变化，形成相位差，但人的眼 睛分辨不出相位差异，相差显微镜就是根据光 波干涉利用特殊的环状光阑和相差板将相位差 转变为振幅差，从而使原来透明的物体表现出 明显的明暗差异，对比度增强。 • 用途：活细胞运动情况和微细结构的观察
三、显微观察样品的制备
• （1）光学显微镜制样 • 有活体直接观察和染色观察 • 悬滴法
• 活体观察
• •
压滴法
菌丝包埋法
（2）细菌染色法:
种类
细菌染色
活菌染色
死菌染色
正染色
负染色
普通染色
特殊染色
简单染色法
复杂染色法
芽孢染色法
荚膜染色法细胞壁染色法源自抗酸染色革兰氏染色
• 步骤： • 固定（加热固定、化学剂固定） • 染色
• 1、利用选择培养基直接分离目的微生物 • 抑制性选择培养基（selective medium）:
•
根据某种微生物的特殊营养要求或对某化学、 物理因素的抗性而设计，只允许特定微生物生长， 而同时抑制或阻止其它微生物生长的培养基。
•
例一：从土壤中分离筛选蛋白酶产生细菌
含牛奶选择培养基目的菌的平板
第 2章 食品微生物学技术
（微生物的分离纯化及显微观察技术）
• 目的和要求： • 本章主要使大家熟练掌握无菌技术、纯种 分离技术，并对显微镜的结构、种类、原 理和显微观察技术有初步了解 • 重点、难点 ： • （1）微生物学实验操作的最基本的无菌技 术 • （2）掌握微生物的分离、纯化及纯培养技 术。 • （3）熟练使用普通光学显微镜，理解提高 光学显微镜分辨率的原理。
第一节 微生物的分离和纯培养
一、无菌技术 在分离、转接、纯种培养过程中为保持纯种 的“纯洁”性而防止被其它微生物污染的技术。 用于分离、转接、培养微生物的器具事先不含任 何微生物； 在分离、转接、培养微生物做到无菌操作
1、微生物培养的常用器具及接种室的灭菌 试管、瓶子、培养皿等 （1）常用的器具：
例二：从土壤中分离筛选产高温淀粉酶（65℃）细菌
2. 富集培养
特定的条件
使目的微生物旺盛生长
待分离微生物在群体中成为优势菌
从自然界中分离到所需的特定微生物
例：从土壤中分离能降解利用对羟基苯甲酸的细菌
富集培养是分离微生物菌种最强有力的技术手段之一。 根据微生物的特殊要求，从自然界分离出各类特异的微生物；
常用的灭菌方法：
高压蒸汽灭菌 高温干热灭菌
（2）接种室的空气灭菌
• • • • • • 紫外线 杀菌效率与照射强度和时间的成积成正比 化学消毒剂熏蒸灭菌 霉菌较多先用5%石碳酸喷洒，再用甲醛熏蒸 细菌较多乳酸和甲醛交替熏蒸 超净工作台的灭菌
2、接种操作
无菌操作： 培养基经过高压蒸汽灭菌后，用无菌工具在无菌条件下 火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行 将含菌材料移接于培养基的这一过程。
5、二元培养物
培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的
保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。
病毒和宿主细胞；
第二节 微生物观察技术
1.微生物群体肉眼观察 菌落（colony）： 单个（或一团相同）微生物在适宜的固体培养基表 面或内部生长、繁殖到一定程度形成肉眼可见的、有一 定形态结构的子细胞生长群体 众多菌落连成一片
• 纯种分离的原理和方法
1. 用固体培养基分离纯培养法
• 原理： 使微生物稀释后在固体培养基平板上形成 单个菌落
方法： • 稀释倒平板法 • 涂布平板法 • 平板划线法 • 厌氧微生物的固体平板分离法
2、涂布平板法
使用较多的常规 方法，但有时涂 布不均匀！
1、稀释倒平板法
对好氧菌、热敏感 菌效果不好！
λ：可见光波长 n ：玻片与物镜间介质的折 射率 θ：物镜镜口角的半数 n sinθ：物镜的数值口径值
• 提高普通光学显微镜分辨率的技术措施：
• 使用波长较短的可见光（450nm的蓝光）； • 使用油浸物镜 • 增大反差（色差）的技术措施： • 对微生物细胞或特殊结构染色
• 2、特殊的光学显微镜
第二章思考题： 1、利用选择培养基如何筛选： （1）抗链霉素（str）细菌？ （2）降解利用尿素的细菌？ （3）分解利用纤维素的细菌？ 2、利用富集培养和选择培养如何分离： （1） 如何从土壤中分离筛选高温（70℃）解烃细菌？ （2） 如何从污染废水中分离筛选苯胺降解细菌？
能辨别两点之间最小距离的能力 被观察物区别于背景的程度
二、光学显微镜的种类及原理
1. 普通光学显微镜
光学显微镜的一般配置
目镜：10 ~ 15 ╳；物镜： 100 ╳；总放大倍数1000~1500 ╳； 如何实现光学显微镜一般配置的最佳观察效果？
l 分辨率（最小可分辨距离）= ———— 2n sin q
二、电子显微镜的种类及原理
• 1、透射电镜（transmission electron microscope, TEM） • 电磁波作“光源”
• 高速电子透射样品，电子束通过电磁场产生偏转、 汇集或发散等复杂的螺旋式运动，聚集成像，用荧 光屏或感光胶片做记录。
• 电磁波波长短，分辨率高：光学显微镜μm级，电镜 nm级。
3、平板划线法
方法： • 平行划线法 • 之字形划线法 •
4、厌氧微生物的分离 对严格厌氧微生物的培养采用稀释摇管法进行分离
厌氧罐
厌氧手套箱
2、用液体培养基分离纯培养
个别细胞较大细菌
固体平板不能长菌落
原生动物、藻类
接种物用液体培养基顺序梯度稀释法分离:
培养物在液体培养基中进行顺序梯度稀释，使每一 稀释度都含有很多平行试管，如果同一个稀释度的 大多数（一般应超过95%）平行试管中没有微生物 生长，有微生物生长的试管得到的培养物可能就是 纯培养物。
• 2、扫描电镜（scanning electron microscope, SEM） • 电子束做电子探针在样品表面扫描时激 发出二次电子，二次电子产生的多少与 样品表面立体形貌有关。对二次电子处 理，在荧光屏呈现放大样品表面立体图 像。
• 3、扫描隧道显微镜 • 原理： • 当金属探针可以接触到样品表面的电子云 时，在探针和样品之间加零点几伏的电压将有 隧道电流产生，该电流对针尖及样品间的距离 非常敏感，保持探针扫描样品时的电压和高度 恒定，通过记录电压或电流的变化了解样品的 表面形貌。 • 4、原子力显微镜 • 用激光装置监测探针随样品表面的升降变化来 获取样品表面形貌的信息
菌苔（lawn）
不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般 都具有稳定的特征（形状、颜色等），可以成为对该微 生物进行分类、鉴定的重要依据。
同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落
2、 显微镜个体观察技术
一、显微技术： 用显微镜进行观察的技术 显微镜的自身特点有关 也取决于显微观察时对显微镜的正确使用 良好的标本制作和观察技术 评价显微镜性能的指标 放大倍数 分辨率 反差