PCR
pcr的分类
pcr的分类PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于现代生物科研和诊断领域的技术，其原理是通过扩增特定DNA片段实现对基因序列的检测和研究。
根据PCR的应用及操作方式的不同，可以将PCR分为以下几种不同的分类。
1. 根据目的分类PCR可以根据其目的的不同进行分类。
主要有以下几种类型：1.1. 基因检测PCR（diagnostic PCR）：用于检测特定基因序列是否存在，例如用于检测某一种遗传病的基因突变。
这种PCR通常使用专门设计的引物对目标基因进行扩增，然后通过凝胶电泳等方法进行分析。
1.2. 定量PCR（quantitative PCR，qPCR）：用于测定目标基因在样本中的数量。
定量PCR使用荧光探针或DNA染料来监测扩增过程中产生的DNA量，可以提供更精确的定量结果。
1.3. 反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）：用于从RNA模板合成相应的DNA，然后再进行PCR扩增。
反转录PCR可以用于研究基因的表达水平以及检测RNA病毒等。
1.4. 集成PCR（nested PCR）：在两轮PCR扩增的过程中，第二轮PCR的引物会嵌套在第一轮PCR产物的内部。
这种PCR能够提高特异性和灵敏性，尤其适用于低丰度靶分子的检测。
2. 根据扩增方式分类PCR可以根据扩增方式的不同进行分类，主要包括以下几种类型：2.1. 传统PCR：传统PCR是最早开发的PCR方法，通过加热、降温等步骤来实现DNA的分离、扩增和合成。
2.2. 实时定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）：实时定量PCR是一种在线监测扩增过程的PCR方法。
它通过配合荧光探针或DNA染料，实时记录PCR反应中的信号变化，可以快速、准确地定量目标DNA的数量。
2.3. 数字PCR（digital PCR）：数字PCR是一种通过将PCR反应分割成多个小体积反应，然后单独计数其中正反应的方法。
pcr的基本反应步骤是
pcr的基本反应步骤是PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
它是基于酶的循环反应，通过不断的加热、退火和延伸的步骤，使DNA模板的特定部分被复制成大量的复制物。
PCR反应通常由以下三个步骤组成：变性，退火和延伸。
1. 变性PCR反应的第一步是变性。
在这一步中，PCR反应体系中的DNA模板被加热至高温（通常为95°C），使双链DNA变性成两条单链，分离开来。
这个过程中，DNA的氢键断裂，双链DNA变成两个单链DNA。
2. 退火第二步是退火。
在这一步中，PCR反应体系中的温度被降低，使引物能够与目标DNA序列上的特定区域互补配对。
引物是由DNA序列设计的，通常是20-30个碱基长的短DNA片段。
一般情况下，引物的温度可低至55°C。
引物会在目标DNA上寻找能与其配对的序列，并与其结合。
引物的配对使得酶能够在这个特定的DNA区域上合成新的DNA链。
当引物与DNA序列互补配对时，酶会识别这个结合，将新的DNA链合成为双链DNA，使得这个特定区域得到复制。
3. 延伸第三步是延伸。
在这一步中，PCR反应体系中的温度被升高，使酶能够在目标DNA 序列上继续合成新的DNA链。
酶通常是一种热稳定聚合酶，如Taq聚合酶，能够在高温下活性稳定。
由于引物的存在，新的DNA链会以两个引物为起始点，分别向前和向后合成。
延伸的步骤会不断重复，生成大量的DNA复制物。
PCR的反应周期通常为30次，每个周期包括变性、退火和延伸。
通过不断的PCR循环反应，从一个DNA模板可以产生数百万甚至数十亿份目标DNA片段。
这使得PCR成为了许多生物学和医学应用的重要工具，如基因测序、DNA 指纹分析、基因突变检测等。
总结起来，PCR的基本反应步骤包括变性、退火和延伸。
这些步骤的循环重复能够产生大量的DNA复制物，使PCR成为了一种常用的分子生物学技术。
pcr知识点总结归纳
pcr知识点总结归纳PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链反应，是一种用于抑制、合成、扩增DNA的技术。
PCR技术广泛应用于科学研究、临床诊断、法医鉴定和生物工程等领域。
PCR技术的出现不仅提高了DNA的扩增速度，而且在很大程度上解决了DNA分析的难题和可行性问题。
PCR技术的关键在于DNA的扩增，通过特定的引物（primer）和热稳定的DNA聚合酶在不同温度下进行多次循环反应，使目标DNA片段扩增成百上千倍。
PCR技术的应用可以在较短时间内获得充足的DNA，为后续的实验提供了可行性基础。
PCR技术是分子生物学研究的重要工具，掌握PCR技术的原理和操作方法对于分子生物学研究者来说至关重要。
下面将对PCR技术的知识点进行总结和归纳，包括PCR的基本原理、PCR反应体系、PCR引物设计、PCR技术的优缺点以及PCR技术在生物学研究中的应用等方面。
一、PCR的基本原理PCR技术是通过DNA的酶解、DNA的引物延伸、DNA的片段合成来实现DNA扩增。
PCR主要由以下三个步骤组成：变性、退火和延伸。
1. 变性步骤：将DNA的双链解链成两条单链，即使DNA解链。
2. 退火步骤：将引物与DNA模板结合成双链，即使DNA复性。
3. 延伸步骤：在退火变性条件下将引物作为起始核酸，然后DNA聚合酶将其扩增成DNA。
通过以上三个步骤的循环反应即可实现DNA的多次扩增。
二、PCR反应体系PCR反应体系主要包括DNA模板、引物、DNA聚合酶、四种dNTPs、缓冲液和辅助剂等。
1. DNA模板：PCR反应的起始材料，可以是基因组DNA、cDNA或其他DNA模板。
2. 引物：在退火步骤中将与DNA模板特异性结合，为DNA的扩增提供起始核酸。
3. DNA聚合酶：用于合成DNA，PCR反应中通常采用热稳定的DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶。
4. dNTPs：即脱氧核苷酸三磷酸盐，即dATP、dCTP、dGTP和dTTP，是DNA聚合的四种脱氧核苷酸单体。
pcr扩增技术原理
pcr扩增技术原理PCR扩增技术原理。
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种能够在体外扩增DNA片段的技术，它是由美国生物化学家凯瑟琳·穆勒和美国生物学家基利斯·史密斯于1985年共同发明的。
PCR技术的原理是通过DNA聚合酶酶链反应，在一定的温度条件下，使DNA片段在体外迅速扩增，从而获得大量的目标DNA片段。
PCR扩增技术的原理主要包括三个步骤，变性、退火和延伸。
首先是变性步骤。
在这一步骤中，将含有目标DNA片段的双链DNA模板加热至94-98摄氏度，使其两条链解开，形成两条单链DNA。
这一步骤是为了使DNA双链解开，以便后续的DNA复制。
接下来是退火步骤。
在这一步骤中，将温度降低至50-65摄氏度，使引物（primers）与目标DNA片段的末端结合。
引物是一小段单链DNA，它们是PCR反应的起始点，能够识别并结合到目标DNA片段的特定区域。
引物的选择对PCR扩增的特异性和效率至关重要。
最后是延伸步骤。
在这一步骤中，将温度升高至72摄氏度，加入DNA聚合酶，使其在引物的引导下，沿着目标DNA片段的模板链合成新的DNA链。
这一步骤是PCR扩增的关键步骤，也是最为重要的步骤之一。
通过不断重复这三个步骤，就可以在体外迅速扩增目标DNA片段。
通常，PCR反应会进行25-35个循环，每个循环包括变性、退火和延伸三个步骤。
经过多次循环后，可以获得数以百万计的目标DNA片段。
PCR扩增技术在生物学研究、医学诊断、法医学鉴定等领域有着广泛的应用。
它不仅能够扩增极微量的DNA样本，还能够对DNA片段进行特异性扩增，具有高灵敏度和高特异性的特点。
因此，PCR扩增技术已成为现代生物学和医学领域中不可或缺的重要技术之一。
总之，PCR扩增技术的原理是通过DNA聚合酶酶链反应，在一定的温度条件下，使DNA片段在体外迅速扩增。
其原理简单清晰，操作方便快捷，具有高度的特异性和灵敏度，因此在科研和临床应用中得到了广泛的推广和应用。
pcr技术原理及步骤
pcr技术原理及步骤PCR技术原理及步骤。
PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种分子生物学技术，它能够在短时间内从少量DNA样本中扩增出足够多的DNA片段，是分子生物学实验中常用的技术之一。
本文将介绍PCR技术的原理及步骤。
一、PCR技术原理。
PCR技术是通过DNA聚合酶（DNA polymerase）在一系列温度循环中，不断地复制DNA片段，从而实现DNA的扩增。
其基本原理如下：1. 双链DNA解旋，首先将DNA样本加热至94-98°C，使双链DNA解旋成两条单链DNA。
2. 引物结合，将温度降低至50-65°C，引物（primers）与单链DNA互相结合，为DNA聚合酶提供复制的起点。
3. DNA聚合，将温度升高至72°C，DNA聚合酶开始复制DNA片段，合成新的DNA链。
通过这样的温度循环，可以在短时间内扩增出大量的目标DNA片段。
二、PCR技术步骤。
1. 样本处理，首先需要从样本中提取DNA，通常使用酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒进行DNA提取。
2. 引物设计，根据目标DNA序列设计引物，引物的选择对PCR扩增的效果至关重要。
3. PCR反应体系配置，配置PCR反应体系，包括DNA模板、引物、DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs等成分。
4. PCR扩增，将反应体系置于PCR仪中，进行一系列温度循环，完成DNA的扩增。
5. PCR产物分析，通过琼脂糖凝胶电泳或其他方法对PCR产物进行分析，验证扩增效果。
三、PCR技术应用。
PCR技术在分子生物学研究、医学诊断、法医学和生物工程等领域有着广泛的应用。
例如，可以用于基因克隆、基因突变分析、病原微生物检测等。
总之，PCR技术作为一种快速、高效的DNA扩增技术，已经成为现代生物学和医学研究中不可或缺的工具之一。
掌握PCR技术的原理及步骤，对于开展相关实验和研究具有重要的意义。
以上就是关于PCR技术原理及步骤的介绍，希望对您有所帮助。
PCR
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要 求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好 有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明 显同源性。 ⑧引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最 低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错 配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会 。
聚合酶链式反应，简称PCR（Polymerase Chain Reaction），指在引物指导下由酶催化 的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增 反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特 异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物 学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、 DNA测序、分子系统遗传学等。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩 增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效 果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分 布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补， 特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异 的扩增条带。
二、退火 模板DNA与引物的退火（复性），模板 DNA经加热变性成单链后，温度降低至 55℃左右，引物与模板DNA单ห้องสมุดไป่ตู้的互补序 列配对结合。
三、延伸 DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，dNTP为反应原料靶序列为模板 ，按碱基配对与半保留复制原理，合成一 条新的与模板DNA链。
PCR
例: 以下为一段cDNA序列,试设计一对引物扩增划 线部分的序列。
5’ ttccagggga tgatctcaga gctgaaggta cgcaaaaccc cccgggtgag 5’tgatctcaga gctgaaggtac3’ GC%=47 ccctgtgcac tgtctggatg aagaagatga tgatgaagac cgggcatctg
靶DNA序列
10
•引物决定PCR扩增产物的特异性与长度 •PCR技术的特异性取决于引物和模板 DNA结合的特异性。 •理想的引物应该有效地与靶序列杂交， 而不与模板其它序列杂交
5’ 3’
3’
5’
11
引物设计原则
1.引物长度： 特异性一般通过引物长度和退火温度 控制。寡核苷酸长度一般为16~30bp。引 物长度增加，能提高特异性，但是在扩 增退火时被引发的模板会减少，而降低 反应效率。
21
• 错配碱基的数量受温度、Mg2+浓度和循 环次数的影响 • Taq DNA聚合酶在反应体系中的终浓度 常为2~2.5U/100μL。酶量过少合成产物 量低，酶量过高则非特异性产物随之增 加。
22
（四）缓冲液
• 用于PCR的标准缓冲液含： 50mmol/L KCl 10mmol/L Tris-HCl(pH8.3) 1.5mmol/L MgCl • 另加入保护Taq酶试剂: 牛血清白蛋白（100μg/ml） 或明胶(0.01%)或二硫苏糖醇(DTT)等
1 2 3 4 M
37
常用PCR介绍
（七）荧光PCR（着色互补PCR） 用不同的荧光染料，如红色的罗丹 明和绿色荧光素等分别标记于不同寡核 苷酸引物上，同时扩增多个DNA区段。 反应完毕后，用紫外线照射扩增产物， 就能显示某一种或几种荧光染料的颜色 组合，为临床自动化诊断打下基础。
pcr的名词解释
pcr的名词解释PCR，全称为聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种能够在体外迅速并大量复制DNA序列的技术方法，由美国生物化学家凯瑟琳·穆利斯与基里·穆利斯于1983年发明。
PCR在遗传学、生物医学研究、临床诊断等领域广泛应用，被誉为分子生物学中最重要的发现之一。
PCR的工作原理基于DNA的复制，它通过复制反应周期使得原始DNA序列在短时间内指数级增加。
PCR反应的基本步骤包括：变性、退火和延伸。
首先，PCR反应系统中加入待复制的DNA样品，然后样品经过变性，即使DNA双链分离为两条单链，这可以通过高温或碱性条件触发。
接下来，低温使引物（primers）与目标DNA序列的互补序列结合，这一步骤被称为退火（annealing）。
在DNA引物的作用下，通过DNA聚合酶酶作用，沿着模板DNA链合成新的DNA链（延伸）。
延伸步骤的最终结果是生成两条完整的DNA分子，它们与初始目标DNA序列相同。
这个过程重复多次，通过指数增加的PCR循环数目，可以在短时间内快速扩增目标DNA。
PCR具有许多优点，因此被广泛应用于科研和诊断场景中。
首先，PCR具有高度特异性，只扩增目标DNA序列，能够从复杂的混合物中选择性地放大具体的DNA片段。
其次，PCR速度快，反应时间仅需数小时，能高效进行批量的DNA复制。
此外，PCR具有高灵敏度，能够检测到非常微量的DNA，极大地提高了DNA分析的灵敏性和准确性。
此外，PCR还可以应用在限制性酶切分析、序列测定、基因突变检测和基因表达分析等方面。
PCR技术的一些衍生应用也被广泛使用。
实时定量PCR（real-time PCR）是一种结合PCR和荧光探针技术的方法，它可以实时测量PCR过程中的产物量，并在PCR反应的不同阶段对扩增产物进行定量分析。
反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是PCR的一个变种，它在反应前将RNA转录成DNA，使得可以将RNA作为模板进行扩增，而不仅仅局限于DNA。
pcr概念和基本原理
pcr概念和基本原理
PCR（聚合酶链式反应）是一种基于DNA复制的体外合成DNA的技术。
它是由克利夫·库里思和凯瑟琳·穆利斯于1983年发明的，该技术后来获得了1993年的诺贝尔化学奖。
PCR的基本原理如下：
1. 反应体系：PCR反应需要DNA模板、DNA引物、DNA聚合酶、dNTPs（四种脱氧核苷三磷酸）以及缓冲液等组成的反应体系。
2. Denaturation（变性）：反应开始时，将反应体系加热至高温（通常为94-98℃），使DNA双链分离成单链。
这一步骤将使模板DNA的两条链分开，使引物能够结合。
3. Annealing（退火）：将反应体系降温至50-65℃，使引物与模板DNA的单链互补配对。
引物是一段短DNA序列，它会识别并结合模板DNA的特定区域。
4. Extension（延伸）：将反应体系温度升高至72℃，加入DNA聚合酶以及dNTPs。
DNA聚合酶会从引物结合的位置开始向模板链的3'端延伸，并在每个引物的序列上合成一条新的DNA链。
以上的三个步骤构成了PCR的一个循环。
在一个PCR反应过程中，这个循环可以重复多次，通常需要进行20-40个循环。
每次循环都会使目标DNA区域的数量成倍增加，因此可以在
几小时内从极少量的DNA样本中合成大量的DNA。
PCR可以用于多种应用，包括基因突变的检测、DNA序列的测定、基因克隆、疾病诊断等。
它在分子生物学研究、医学诊断和法庭鉴定等领域起着重要作用。
PCR操作温度
PCR操作温度PCR（聚合酶链式反应）是一种在实验室中快速繁殖特定DNA片段的方法。
在PCR 过程中，温度是非常重要的因素，不同温度的调控可以协助完成DNA的变性、引物的结合和DNA延伸等关键步骤。
反应体系和步骤PCR反应一般包括DNA样本、Taq DNA聚合酶、引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和缓冲液等组分。
PCR操作通常分为以下步骤：1.变性（Denaturation）：将PCR反应管中的DNA加热至92-98摄氏度，使双链DNA解开成两条单链模板。
2.引物结合（Annealing）：将温度降低至55-65摄氏度，使引物与单链DNA模板互补配对形成双链DNA。
3.延伸（Extension）：将温度升高至72摄氏度，启动Taq DNA聚合酶的活性，使其沿着双链DNA模板进行DNA链的合成。
以上三个步骤构成PCR的一个循环，整个PCR反应通常需要进行20-40个循环，每个循环持续时间约为1-2分钟。
温度调控的重要性温度在PCR反应中起到重要的调控作用，主要体现在以下几个方面：DNA变性温度变性是PCR反应的第一步，通过高温解开DNA双链结构，使DNA变成两条单链模板。
变性温度通常设置在92-98摄氏度，高温可以帮助DNA变性，使其双链结构解开，提供单链DNA供引物结合和复制。
引物结合温度引物结合温度是指引物与单链DNA模板互补配对的温度范围。
在引物结合温度下，引物能够与单链DNA模板准确匹配，形成双链DNA。
引物结合温度一般设置在55-65摄氏度，不同引物的结合温度略有差异。
DNA延伸温度DNA延伸温度是PCR反应中最重要的温度环节。
延伸温度通常设置在72摄氏度，这是因为在72摄氏度下，Taq DNA聚合酶具有最佳的活性，能够加入新的dNTPs并延伸DNA链。
延伸温度过低会导致延伸速率较慢，延伸温度过高则可能会损害Taq DNA聚合酶的活性。
周期延伸PCR反应需要进行多个循环来扩增特定的DNA片段。
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聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction聚合酶链式反应，简称PCR技术，是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA 片段的技术，是最常用的、以分子水平研究微生物的技术之一。
PCR技术具有特异、敏感、产率高，快速、简便、重复性好，且极易操作等突出的优点，能在一个小扩增管内，将所需研究的目的基因或某一DNA片段在短短数小时内获得几十万乃至百万个特异DNA序列的拷贝，使肉眼能直接观察和判断。
PCR技术虽然问世时间仅二十余年，但它已迅速渗透到分子生物学的各个分支领域，在分枝克隆、遗传病的基因诊断、法医学、考古学等诸多方面得到了广泛应用。
如此神秘的技术，是怎样诞生的呢？1983年在Cetus公司任职、时年39岁的科学家Dr.Kary Mullis正在着手解决用简单的方法鉴定某一段DNA的技术问题。
有一天晚上，他灵机一动想出了一个能在试验中产生某个特定DNA序列无限拷贝的简单方法，这一方法就是“聚合酶链式反应——PCR”。
该方法的应用在1983年10月的一次学术会议上首次公开于学术界。
对这一新技术，许多到会的科学家都很吃惊因为在此之前，没有人想到过这个方法如此简单，即只需要三个不同温度的水浴槽，通过控制反应时间和循环数，就可以实现DNA的大量扩增。
Cetus 公司为此奖给Dr.Kary Mullis一万美元，后来Cetus公司以3亿美元的价格把PCR 技术的专利权卖给了一个制药公司（Hoffman-La Roche）.PCR技术以此得到了迅速发展，截止到1993年底，有7000篇科学论文引用了PCR文献。
1993年Dr.Kary Mullis荣获诺贝尔化学奖。
核酸研究已有100多年的历史，最初人们为了以生物材料中获得某一特定的DNA 片段或进行其序列分析、鉴定，按传统的方法，要经过DNA酶切、连接、转化等步骤构建含有目的基因的克隆体，然后导入细胞进行扩增，再经过同位素标记探针的筛选等过程。
虽然技术上已无难点，但操作复杂，一般需要数周到数月的时间。
而PCR技术可在数小时内对仅有极少拷贝（几个即可）的基因放大到至百万倍！大大简化了传统的分子克隆技术，比较容易地对目的基因进行鉴定。
20世纪60年代末70年代初时，DNA的体外分离技术尚需完善，人们都在致力于研究并建立这方面的技术。
Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。
”但那时候，如何实现仍是个谜。
这一谜底于1985年由Dr.Mullis揭开。
一、PCR技术原理PCR技术实际上是在体外模拟体内的DNA复制过程。
细胞内的DNA复制时，首先解旋酶解开DNA双链，使其变成作为模板的单链。
然后，另一种酶——RNA聚合酶合成一小段引物（primer），结合到DNA，模板上。
最后，DNA聚合酶以这段引物为起点，合成与DNA模板链配对的新链。
PCR技术是用加热的办法让所研究的双链DNA片段变性，变成两条单链。
之后将人工合成的两个引物，结合到DNA模板的两端。
最后在DNA聚合酶的作用下大量复制该模板整个过程的实现，完全是通过控制不同温度来进行的。
因此，PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。
PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。
整个反应过程分为三步。
第一步：变性（denaturation），通过加热至92-95℃，使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。
第二步：退火（annealling），也是双链复性的过程。
当温度突然降低至55℃左右时，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。
由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA的量大大多于模板DNA，引物与互补的模板形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。
第三步：延伸（extension），指引物延伸。
在Taq-DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物（dNTP）以及Mg2+存在的条件下，以引物为起始点，在Taq-酶催化下进行5`-3`方向的DNA链延伸反应（72℃条件）。
重复循环“变性-退火-延伸”三个过程，这三步为一个循环（cycle）。
每一cycle的产物可以作为下一次cycle的模板，每经一次循环所获得的产物就是模板量的2倍，经过25-30次cycle之后，介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到大量复制，理论上数量可达225-30=2×107-9拷贝，时间仅仅需要1-3小时。
二、PCR体系及条件选择参与PCR的物质主要有5种：引物、DNA聚合酶，dNTP，模板和Mg2+（缓冲液）。
PCR过程是在弱碱性条件下进行的，通常用10-50mmol/L Tris-HCl （Taq-DNA Polymerase 提供的反应缓冲液）。
KCl在50mmol/L时能促进引物退火，即与模板单链DNA结合，高于此浓度也将抑制Taq-酶的活性，因此10×缓冲液中含有500mmol/L的KCl。
此外，Mg2+的浓度是影响反应特异性和扩增片段的产率的主要因素。
这是因为，Taq-酶的活力受Mg2+离子的影响。
实验发现，用鱼精DNA作模板，总dNTP浓度在0.7-0.8mmol/L，Mg2+浓度为2.0mmol/L时激活能力最高，超过这一浓度则产生抑制。
因此，Mg2+离子浓度过高，使反应的特异性降低；Mg2+浓度过低，PCR产物则减少。
在dNTP总浓度达到0.2mmol/L时，Mg2+离子浓度为1.5mmol/L较为合适。
若样品中含有EDTA或其他螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。
一般Mg2+的终浓度以1.5-2.0mmol/L较好。
2.dNTPdNTP是PCR反应中的底物，该溶液具有较强的酸性，使用时都是用NaOH将pH调至7.0-7.5，-20℃存放。
但应避免过多的冻融，使其产生降解。
PCR过程中，4种dNTP的总浓度大多在0.2mmol/L，浓度高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误参入。
反之，低浓度的dNTP会导致反应速度降低，过早停止延伸，但可提高合成的准确性。
4中dNTP 使用时必需等当量浓度配制，否则就会诱发聚合酶的错误参入。
此外，dNTP能与Mg2+结合，使有利的Mg2+降低，因此，应注意Mg2+与dNTP 浓度之间的关系。
3.Taq-DNA聚合酶Taq-酶具有很好高的耐热性，经95℃持续高温仍不会失活，一次加入酶即可完成整个PCR过程。
在100μL体系中，一般加入2-4U（或0.5-5U）的酶量，足以达到每分钟延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。
酶量过多导致产生非特异性产物，而过低则合成产物辆减少。
不同公司或不同批次的常有很大的差异，因此应做预实验或者使用公司推荐的浓度。
当降低反应体积时，如采用20μL或50μL，酶的用量仍不可小于2U，否则反应效率将降低。
引物是决定PCR结果的关键。
PCR中引物的浓度一般为0.1-0.5μmol/L，浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的概率，最终会影响DNA合成产率。
引物的纯度和稳定性可直接影响PCR的结果。
纯度决定于公司，引物合成后必须通过PAGE或HPLC纯化。
引物的稳定性则依赖于储存条件。
应将引物干粉和溶解液保存于-20℃冰箱。
保存条件干粉溶解物（TE 10μmol/L）-20℃至少一年6个月室温2个月少于1周保存条件干粉溶解物（TE 10μmol/L）-20℃至少一年6个月室温2个月少于1周通常将引物用100μmol/L TE溶解，分装小管保存，使用前再稀释10倍。
水的pH偏酸性，易引起寡核苷的水解。
5.模板的制备和需要量PCR过程对模板的要求并不严格，单、双链DNA都可以，纯度要求也不严。
模板制备可以不必像克隆酶切、连接、标记等反应所用DNA纯度那样严格，某些情况下，以利用快速简便的方法，如用高渗低渗液体、（煮沸）、或仅加SDS溶解细胞制备模板也可满足PCR实验要求。
但是若模板中混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以及DNA结合蛋白，都可以干扰PCR反应。
模板的用量很低，理论上102~104拷贝模板足可满足各种要求的PCR。
6.变性温度一个PCR过程开始，首先是双链模板DNA解离为单链，使之有利于与引物相结合，这个过程可以通过加热完成，在93-95℃条件下，即使复杂的DNA分子，如人基因组DNA，也可变性为单链。
若低于93℃，则需延长变性时间。
一般选择94℃，30秒就可以使各种复杂的DNA分子完全变性。
过高温度或高温持续时间长，会对Taq-酶活性及dNTP分子造成损害。
7.退火温度（复性温度）（Ta：annealling temperature）退火温度是影响PCR特异性的较重要的因素。
变性后温度快速冷却至40-60℃，可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA比引物复杂的多，所以引物与模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
不必担心引物找不到“朋友”。
退火温度的选择是根据引物的长度和（G+C）含量确定。
如引物为20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，选择55℃为最适退火温度七点比较理想。
退火温度可通过溶解（解链）温度Tm（melting temperature）计算得到：Tm=4(G+C)+2(A+T)在Tm允许的范围内，选择较高的退火温度可减少非特异性扩增。
退火时间设置30s，足以使引物与模板完全结合。
一般实验中，退火温度Ta 比扩增引物的解链温度Tm低5℃。
复性（退火）温度=Tm-5（~10）℃8.延伸温度PCR的延伸温度建议选择在70~75℃之间，此时Taq DNA聚合酶具有最高活性。
Taq-酶活性与温度关系如下：70~80℃：150核苷酸/s/酶分子70℃：60核苷酸/s/酶分子55℃：24核苷酸/s/酶分子>90℃：合成几乎不进行因此，PCR延伸温度常用72℃。
延伸反应的时间可依据待扩增片段的长度而定。
根据延伸速度以25~50个核苷酸/s计算，一般1kb以内的片段，延伸时间1min足够了，3~4kb的靶序列需3~4min，扩增大片段如10kb 需15min。
9.循环次数其它参数选定后，理论上经过25~30个循环，PCR产物的积累即可达到最大值。
实际操作中，由于每一步的反应速率及产率不可能达到100%，因此无论模板浓度是多少，20~30次是较为合理的循环次数。
循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
在PCR过程中，同样遵循酶的催化动力学原理：在反应初期，目的DNA 片段呈指数形式增加。
随着DNA产物的逐渐积累，在引物-模板与DNA 聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增速度减慢进入相对稳定状态，这种“停滞效应”称为“平台期”。