志贺氏菌,的监测方法,

志贺氏菌是引起人类肠道疾病常见的病原菌，在我国感染性腹泻病原菌中高居首位。

为了能够有效地预防、治疗和控制水或食源性传染病，对水或食品中志贺氏菌的快速检测与鉴定显得十分重要。

本文主要介绍了志贺氏菌的各项检测技术及其优缺点，并对志贺氏菌的检验技术进行了展望志贺氏菌的检测方法随着生物实验技术的发展，志贺氏菌的检测和鉴定技术也在不断的完善，大致可分为三大类：常规生化鉴定方法、免疫学方法以及分子生物学方法。

其中最为常用的是分子生物学上的常规PCR检测。

2.1 常规生化鉴定方法常规生化检测须经过增殖培养、分离纯化、生化试验、血清学实验等，检验步骤繁琐、耗时长、准确性低，且一次检测完成样品项数较少[5]，不能应对市场需求的快速准确检验方法的要求。

但这种方法具有直观、准确、稳定性好且假阳性率低等特点，因此一直被沿用至今。

国家标准方法[6]中采用常规生化鉴定方法对志贺氏菌进行检测，整个过程需要4～5d。

通过对SS 培养基、Mac 培养基、HE 培养基和MT 培养基进行比较，发现SS 培养基对志贺氏菌的检出率最高。

为防止漏检其他菌型，可同时采用Mac 培养基来提高检出率。

2.2 免疫学方法免疫学的发展为致病菌的快速检测提供了新方法，同时大大提高了致病菌检测的灵敏性和特异性。

除了凝集实验、沉淀实验和补体实验等经典的免疫学检测方法，以免疫学方法为基础建立起来的检测技术也已被应用于志贺氏菌的检测。

2.2.1 酶联免疫技术酶联免疫技术 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术。

建立间接 ELISA 方法以检测检测志贺菌纯培养液，其检出限为105～106CFU/ml；建立双抗夹心 ELISA 方法检测含0.1～1CFU/ml 志贺氏菌的样品在增菌13h 后可检出阳性反应，含1～10CFU/ml志贺氏菌的样品在增菌11h 后可检出阳性；用间接 Dot-ELISA 方法检测志贺氏菌的检出限可达106CFU/ml。

E L ISA 法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点，适用于志贺氏菌的快速检测，但ELISA 方法影响因素多，假阳性率高且不易确定，还需要其他方法辅助检测。

2.2.2 SPA协同凝集法金黄色葡萄球菌 A 蛋白(Staphylococcal protein A，SPA)是某些金黄色葡萄球菌细胞壁的一种表面蛋白，具有同人和多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合的能力。

SPA 协同凝集法是用已知标准血清吸附到含 A 蛋白的金黄色葡萄球菌表面，使之成为吸附抗体的载体，再以此去诊断相应未知抗原产生的肉眼可见的凝集颗粒。

用含 A 蛋白丰富的金黄色葡萄球菌菌体与志贺氏菌抗血清在一定条件下混合致敏，让抗体结合到金黄色葡萄球菌细胞壁的A 蛋白上制成SPA 诊断试剂，样品经增菌后即可用SPA 诊断试剂来检验。

SPA 协同凝集法在 24～48h 内即可得到检测结果，且检出率高，可作为一种快速灵敏的检验方法。

由于SPA 能结合大量抗体，大大提高了灵敏性，缩短了检验周期。

2.3 分子生物学方法以分子生物学为基础建立的众多检测技术以其敏感、快速、高特异等特点成为生物技术革命的新产物,已经应用于食源性致病菌的检测。

检测志贺氏菌的分子生物学技术主要包括：聚合酶链反应、脉冲场凝胶电泳、基因芯片和探针技术等。

2.3.1 聚合酶链式反应志贺氏菌的传统检测方法耗时长，操作繁琐，已不能满足食品安全控制的需要。

分子生物学尤其是 PCR技术的发展给志贺氏菌的快速检测提供了广阔的空间。

在此主要介绍用于志贺氏菌检测的常规 PCR 检测方法，实时荧光 PCR 检测方法和多重 PCR 检测方法。

2.3.1.1 常规PCR检测聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是依据DNA 模板模仿体内的复制过程，在体外适合的条件下，以单链DNA 为模板，以人工设计与合成的寡核苷酸为引物，利用热稳定的DNA 聚合酶沿5′→ 3′方向掺入单核苷酸来特异性地扩增 DNA 片段的技术。

通过对已知序列DNA 进行扩增，以侵袭性质粒抗原(invasive plasmid)作为检测志贺氏菌的目的基因来设计引物，建立 PCR 检测方法。

PCR 检测志贺氏菌的目的基因有ipaB.ipaC、ipaD 和ipaH，还包括set1A.set1B、ial和virA等片段。

现将有关文献中报道的用于检测志贺氏菌的引物序列总结于表2－1。

表2－1检测志贺氏菌的引物序列2.3.1.2 基于PCR 方法的复合技术PCR-ELISA 只需要6.5h 即可检测出，当测试大量标本时 PCR-ELISA 所需时间比PCR-琼脂糖凝胶电泳更短。

环介导等温扩增法能有效地在2h内检测最低限细菌量中的ipaH基因以检测志贺氏菌。

基于PCR 结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术，利用志贺氏菌特异基因序列分别设计特异性引物，复合PCR 扩增产物经DHPLC 技术进行快速检测，从样品制备、增菌到结果报告可在2d 内(26～28h)全部完成。

该方法是一种具有高灵敏度、低检测成本、高通量检测新技术。

2.3.2 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)又称脉冲式交变电场电泳，是一种用于分离大分子量线状DNA 的电泳技术。

通过限制性内切酶消化菌株DNA 来进行细菌分型鉴定，经PFGE 分离，比较染色体限制性内切图谱，经过不同图型间比对来分析同一菌种亚型的不同菌株来源及其变异特点。

PFGE 方法是一种非常有效的分子分型技术，是目前进行志贺氏菌流行病学分析最常用的方法之一。

采用多重荧光定量PCR技术做基因诊断，并通过PFGE 的分型方法，达到理想的志贺氏菌分型效果。

PFGE方法具有分型能力强，重复性好等特点，能及时查明暴发流行的传染源从而有效控制疫情的蔓延，在志贺氏菌的分子流行病学研究中具有重要作用。

虽然这一技术检测成本低，但却存在着反应产物后处理极易受到污染造成假阳性的缺点。

2.3.3 RAPD技术随机扩增多态性 DNA 技术(random amplified polymorphicDNA，RAPD)是建立在 PCR 基础上的一种可对未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。

利用 RAPD 技术建立一套可对水或食品中志贺氏菌进行鉴定的方法，其结果显示，志贺氏菌ipaH引物扩增阳性的细菌经 RAPD 技术进行基因水平的分型，发现同种志贺氏菌株产生基本相同的条带模式，不同种的菌株，甚至同一种菌的不同型间的条带模式存在一定差异。

RAPD 技术利用随机引物扩增未知序列DNA，它具有特异性强、操作简便、快速等特点，并且弥补了标准PCR 方法只能应用于已知DNA 序列的不足，可用于水或食品中志贺氏菌的鉴定。

2.3.4 基因芯片是利用细菌16S rRNA(或16S rDNA)基因作为检测的靶基因，设计针对不同菌属的寡核苷酸探针制备基因芯片，通过杂交检测细菌的种类。

基因芯片可以通过以下三种途径应用于肠道致病菌的检测：直接检测致病菌的DNA或RNA；结合多重PCR 对致病菌的毒力因子或者特异性基因进行鉴定；以致病菌核糖体RNA作为检测的靶基因同时检测多种肠道致病菌。

设计的基因芯片能够区分沙门菌属、志贺菌属、葡萄菌属和耶尔森菌，对于未知菌落，利用基因芯片能在4h内完成细菌菌属的鉴定。

李君文等利用基因芯片技术检测水中常见致病菌获得较高的敏感性，可实现高通量、并行检测，一次实验即可得到全部结果。

用一个包括有8 种肠道致病菌中34 种毒力基因的肠道致病菌基因芯片，可以成功地应用于腹泻患者粪便样品中病原菌的鉴定。

由于基因芯片技术具有特异性强、敏感性高，操作简便且高效快速等优点，该技术要优于其他分子生物学检测方法。

基因芯片技术在肠道致病菌检测中有着巨大的应用价值，具有广阔的应用前景。

2.3.5 基因探针技术基因探针是从微生物中提取或扩增特异性的DNA片段，纯化后标记上可被检测的指示剂如放射性同位素、荧光物质等，使之成为特异性DN 探针。

用决定该微生物特有生理、生化特性并与rRNA互补的rDNA序列来构建特异性的DNA 探针，检测细菌rRNA中的靶序列可大大提高其敏感性。

志贺氏菌的检验（国标法）一、增菌称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃培养6~8h。

培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。

二、分离和初步生化试验取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板各1个，于36℃培养18~24h。

志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。

挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。

一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培养18~24h，分别观察结果。

下述培养物可以弃去：a. 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；b. 在18~24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物；c. 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；d. 产气的培养物；e. 有动力的培养物；f. 产生硫化氢的培养物。

凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。

三、血清学分型挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。

先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。

如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。

福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1。

可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。

4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1~15各型因子血清检查。

如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3~12型多价血清及各型因子血清检查。

四、进一步的生化试验在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即：葡萄糖铵西蒙氏柠檬酸盐赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶 pH7.2尿素 KCN生长水杨苷和七叶苷的分解除宋内氏菌和鲍氏13型为乌氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。

必要时还应做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。

生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物,已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做 5%乳糖发酵甘露醇棉子糖甘油的发酵靛基质试验志贺氏菌属4个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。