嗜麦芽假单胞菌的碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

嗜碱芽孢杆菌PB92碱性蛋白酶基因启动子的克隆及应用

，
ａｄａ１５ｂｎｔｅｕｎｅｃｎｓｒｅａｉｆｎｔｎＡｄｉｏａｌ，ｅｒｓｎａｉｅＳｃｔｐｉｎｌｅｔｅｓｒｃｕｅｗａｎ０ｐｌｇｓｑｅｃａｅｖｓｓｕｃｏ．ｄｔｎｌａｒｐｅｅｔｔｅ — ｅｓｇａｐｉｔｕｔｒｓｅｈｈｔｉｉｙｖｙｐｄ
嗜碱芽孢杆菌Ｐ９碱性蛋白酶基因启动子的克隆及应用Ｂ２
陈坤，黎明，成垫，杜连祥，张同存，路福平
天津科技大学生物Ｔ程学院，天津市工业微生物重点实验室，天津３０５０４７
摘要：利用ＴＬＰＡＩ —ＣＲ方法从嗜碱白酶基因上游启动子活性片段，测序分析后登录ＧｅＢｎ（Ｕ１０８）此序列具有多个启动子特征区域且在一３～一３０ｂｎａｋＥ３６６。５８７ｐ和 …２５１８ｐ两个７２ｂ
ＣＨＥＮｎ，ｉ，ＫｕＬＩＭｎｇＣＨＥＮＧｎ，ＫｕＤＵａＸｉｎＺＨＡＮＧｎＣｕＬＵＬｉｎ— ａｇ，Ｔｏｇ— ｎ，Ｆｕ— ｎＰｉｇ
ＴｎｉｅａＩｄｓｉｌｃｏｉｌｇ，ｏｌｅｏＢｏｅｈｏｏｙＴａｊｎｖｒｉＳｉｃｎｃｎｌｇｉｊＫｙｂｏｎｕｔａｒｂｏｏｙＣｌｇｉｔｎｌｇ，ｉｉＵｉｓｙｏｃｎｅａｄＴｈｏｏｙａｎＬｆｒＭｉｅｆｃｎｎｅｔｆｅｅ
ＢａｉｕｌａｏｉｕＢ９ｅｏｙＴＬＰｃｌｓａｃｌｐｈｌｓＰ２ｇｎｍｅｂＡＩ — ＣＲ．ｅｕｎｅｎｎｌｚｄｒｖａｅｈｔｉｃｎａｎｅｅａｙｉａｒ — ｌｌＳｑｅｃｄａｄａａｙｅｅｅｌｄｔａｏｔｉｓｓｖｒｌｐｃｌｐｏｔｔｏｔｒｃａａｔｒｚｄｒｇｏｓＴｅｅｓｒｌｔｍｅｒｏａｅｎ５８一７ｐａ一７￣２ｐＤｅｅｉｒｏｅｈｒｃｅｉｅｅｉｎ．ｗｏｒｖｒｅｔａｓａｉｎｆａｓｗｅｅｌｃｔｄｉ一３－３０ｂｄ２５－１８ｂ．ｌｔｎｎｏｒｎｏａａｙｉｏｅｓｑｅｃｅｏｓａｅａ１ｐｔ１ｐｕｓｅｍｆｔｅＴＳｈｗｅｒｄｍｉａｔｒｍｏｅｃｖｔｎｓｓｆｔｅｕｎｅｄｍｎｔｔｄｔｔ４ｂｏ６９ｂｐｔａｏＳｓｏｄｐｅｏｎｎｏｌｈｒｈ４ｒｈｐｔｒａｔｉｉｙ

外源基因在大肠杆菌中表达简略实验步骤

目的基因在大肠杆菌中的诱导表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。

[主要试剂]1、LB培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）： IPTG溶于100ml ddH2O中,μm 滤膜抽滤，-20℃保存。

[操作步骤]1、通过PCR方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为BamHⅠ和HiindⅢ），PCR循环获得所需基因片段。

PCR反应体系为：。

PCR反应条件为：94℃变性3min；94℃变性3min、52℃复性40sec、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。

2、构建重组表达载体（1）载体酶切：将表达质粒pRSETA用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

（2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。

连接反应体系为：#3、获得含重组表达质粒的表达菌种（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。

否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

（3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21（DE3）的感受态细胞。

4、诱导表达1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。

2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含100mlLB培养基的300ml 培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌（最好，大约需3hr）。

3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM 作为实验组，两组继续于37℃、200rpm震荡培养3hr。

芽孢杆菌β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

芽孢杆菌β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达
王为先;张沁;申同健
【期刊名称】《遗传学报：英文版》
【年(卷),期】1993(20)4
【摘要】本工作采用新设计的营养缺陷型淘汰筛选法,从本实验室筛选的芽孢杆菌Bacillus R2中分离到能够水解生淀粉的β-淀粉酶基因。

该基因所在的DNA片段
为5.25kb,在大肠杆菌(E.coli)中的表达产物具有与供体菌相同的淀粉酶特性,实验
室条件下酶产量为500IU/ml以上,RDA值为57%,并且可以全部分泌到培养基中。

【总页数】7页(P374-380)
【关键词】β-淀粉酶;基因克隆;芽孢杆菌
【作者】王为先;张沁;申同健
【作者单位】中国科学院化工冶金研究所生化工程室;中国科学院生物物理研究所【正文语种】中文
【中图分类】Q939.110.3
【相关文献】
1.地衣芽孢杆菌α-耐高温淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 [J], 潘风光;宋德群;任洪林;艾永兴;柳增善
2.地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及其产物的分泌[J], 李金霞;蔡恒;路福平;杜连祥
3.地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达 [J], 蔡恒;陈忠军;
路福平;杜连祥
4.产β-淀粉酶菌株的筛选及β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达 [J], 李猛;陈利飞;杨建楼;马春玲
5.嗜热脂肪芽孢杆菌耐热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达 [J],
N.Tsukagoshi;李尔炀
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嗜麦芽假单胞菌酪氨酸酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

嗜麦芽假单胞菌酪氨酸酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达王戈林;沈萍;杨澜;彭珍荣【期刊名称】《遗传学报：英文版》【年(卷),期】1999(26)3【摘要】酪氨酸酶基因（mel）编码的酪氨酸酶是合成黑色素的关键酶。

用鸟枪法分离嗜麦芽假单胞菌（PseudomonasmaltophiliaAT18）的mel基因：以pUC18为载体，E．coliHB101为受体菌，在加有一定量的Amp和L－tyr的酪素平板上筛选到分泌可溶性黑色素的转化子，所含重组质粒pWSY约700bp的外源DNA片段上携有mel基因，该片段无BamHI、HindIII、EcoRI、BclI等酶的识别位点。

Southern杂交证实此片段确实来源于P．maltophilia。

克隆片段的核酸序列分析鉴定ORF504为酪氨酸酶编码序列，SDS－PAGE电泳也显示工程菌HB101／pWSY额外表达一分子量约为18kD的蛋白，因此证明了这一蛋白是重组子表达的酪氨酸酶。

【总页数】6页(P274-279)【关键词】mel基因;克隆;表达;酪氨酸酶基因【作者】王戈林;沈萍;杨澜;彭珍荣【作者单位】武汉大学生命科学学院【正文语种】中文【中图分类】Q78;Q933【相关文献】1.嗜麦芽假单胞菌的碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达 [J], 江盛梅;沈萍2.嗜麦芽假单胞菌酪氨酸酶基因在类产碱假单胞菌中的转移与表达 [J], 蔡信之;谢志雄;沈萍3.嗜麦芽窄食单胞菌角蛋白酶基因(KerF)的克隆及其在大肠杆菌中的表达 [J], 邹晓凤;岳寿松;宋爱荣;尤升波;游银伟;黄亦钧;朱友峰4.嗜麦芽假单胞菌热休克基因dnaK启动子的亚克隆及其在大肠杆菌中功能的研究[J], 王雅琴5.嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因在地衣芽孢杆菌中的异源表达 [J], 楼志华;刘翔;张劲楠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

GAPC2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

一
Ａｒｓｏｍｅｃ；其他常用试剂购于成都博瑞克生物公司。１２方法．１２１基因全长的扩增根据ＮＢ上已发表的ＧＰ２的基因序列．．ＣＩＡＣ设计特异性引物，引物序列如下：
—
因片段。
匕弓物为Ｆ：５一ＧＧＴＣＴＧＴＡＡＧＡＡＣＧ一 ’，游Ｉ ’ＣＧＡＣＡＧＣＧＣＡＡＧＴＡＡ３Ｆ弓物为Ｒ５一ＣｃＴＧｃＡＡｃＧＡＧＡＧＡＡＡＴＡＡ一 ’ 中设计的酶切位点为ＢｍＩＳｌ。以拟南芥ｃＮ为模板，加ａＨ和ａＩＤＡ
Ｌ１ａ的Ｂ三磷酸一油醛脱氢酶（ｌＣｒ１ｅｙｅ３Ｐ０ＰａｅＧＰ２化大肠杆菌Ｂ２感受态细胞中，在含有ＫｎＬ平板上甘ＧＹｅｅｄｈｄ一一ｈｈｔＡＣ转Ｓｄｈｄｏｅａｅｅｙｒｇｎｓ，忉是高等植物体内糖酵解和糖异生途径中培养过夜。挑取菌落进行ＰＲ定，０８的琼脂糖凝胶电泳检测Ｃ鉴．％的关键酶，能够催化３磷酸甘油醛转变为１３二磷酸甘油酸。一，一目的条带大小。．．位于细胞质中的是由４同种亚基个组成的多聚体，而１２４融合蛋白的诱导表达挑取单个含表达质粒的阳性菌落
１材料与方法
１１材料．
重悬沉淀。分别取２ｌ液重悬于ＳＳＰＧ上样缓冲液中，０菌ｕＤ —ＡＥｌ０煮沸３５ｉ０℃ －ｍｎ，冷却后准备上样。用微量注射器取２样０ｌｌＩ品上样，进行ＳＳＰＧ电泳。考马斯亮蓝Ｒ２０色ｌ，脱色至Ｄ—ＡＥ一５染ｈ胶上出现清晰条带。

嗜麦芽窄食单胞菌S.maltophilia YHJ-1角蛋白酶基因的克隆表达及活性鉴定

摘要：从长期堆积废弃羽毛的土壤中分离得到一株高效降解羽毛的菌株ＹＪｌ经Ｈ — ，１ＳｒＮ６Ａ序列分析鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌，Ｄ命名为嗜麦芽窄食单胞茵ＳｍｈｐｉＨ．ａｏｈｉＹＪｌａ
一
１以菌株ＹＪ基因组为模板，过ＰＲ方法克隆了该茵的角蛋白酶基因（ｅＢｎ。Ｈ一１５１）命名为ｋｒ。将其编码区插入到表达载体ｐＴ８（中，ｅＤＥ２ａ＋）转化大肠杆菌（ｓｅｃｉｃｌＬ１Ｄ３，Ｅｃｒｈｏ）Ｂ２（Ｅ）筛选获得重组菌。通过对重组茵破碎上清液酶活测定和ｈｉａｉＳＳＰＧ分析，实该酶在大肠杆菌中获得了高效表达，Ｄ —Ａ证但酶活较低，最高酶活为１．Ｕ０５／ｍ。酶学性质研究结果表明，Ｌ该酶的最适反应温度为５ ℃ ，０最适反应ｐＨ值为７８为中性．，酶。实验结果为嗜麦芽窄食单胞菌角蛋白酶的基础理论和应用研究奠定了基础。关键词：嗜麦芽窄食单胞菌；角蛋白酶基因；克隆；表达；酶学性质
ｋｒｅＤ、ｓｎｃｔｅｎｒｔｄｔａｈｎｙｓｅｐｅｓｄｉｃｌＢＬ１ａｌｗｋｒｔｎｅａ－ｏｉａｅｄｍｏｓａｅｈｔｔｅｅｚｍｅｗａｘｒｓｅｎＥ．ｏｉ２ｔｏｅａｉｓｃａ
ｓｒｃｅｒｃｍｂｎｎｘｒｓｉｎｐａｍｉＥ２ — ｋｒｒｎｆｒｄｉｔｃｅｉｈａｃｌＢ２ｔｔｔｅｏｉａｔｅｐｅｓｌｓｄｐＴ８ — ｅＤｔｓｍｅｎｏＥｓｈｒｃｉｏｉＬｕｈｏａｏ１

实验 7 外源基因在大肠杆菌中的表达(或诱导表达)和检测 (1)

原核（大肠杆菌）表达系统
特点：表达质粒独立运转表达基因重组速度快，生产工艺简单，成本低，表达量较高，重组蛋白翻译后修饰较差。
1978年，人胰岛素insulin 基因首次表达目前仍是一个重要的表达系统
应用：活性要求不高的蛋白质如抗原制备
原核表达系统－E.coli:
transformation
The metal binding domain of the fusion peptide allows simple purification of recombinant proteins by Immobilized Metal Affinity Chromatography with Invitrogen’s ProBond. resin (available in bulk, see page v). The enterokinase cleavage recognition site in the fusion peptide located between the metal binding domain and the recombinant protein allows for subsequent removal of this N-terminal fusion peptide from thepurified recombinant protein.
OD600 = 0.4-0.6
37℃ overnight
IPTG
诱导表达4-6小时，time-course expression
SDS-PAGE分析
Invitrogen
T7 promoter: bases 20-39 Ribosome binding site: bases 84-90 6xHis tag: bases 112-129 T7 gene 10 leader: bases 133-162 Anti-XpressTM epitope: bases 169-192 Multiple cloning site: bases 202-248 pRSET reverse priming site: bases 295-314 T7 transcription terminator: bases 256-385 f1 origin: bases 456-911 bla promoter: bases 943-1047 Ampicillin (bla) resistance gene (ORF): bases 1042-1902 pUC origin: bases 916-2852 (C)

嗜碱细菌NTT36嗜碱基因的亚克隆及其在大肠杆菌和农杆菌中的表达

嗜碱细菌NTT36嗜碱基因的亚克隆及其在大肠杆菌和农杆菌中的表达刘同明;曹军卫;王玲燕;刘阳;俞雁寻【期刊名称】《氨基酸和生物资源》【年(卷),期】1999(21)2【摘要】将大肠杆菌ＨＢ１０１嗜碱转化子中质粒ｐＧＣＡ所携带的嗜碱基因亚克隆至双元载体ｐＢＩ１２１质粒中，构建了植物表达载体ｐＬＧＣ重组质粒。

用其转化大肠杆菌ＨＢ１０１获得了能在碱性和卡那霉素抗性平板上生长的转化子，再通过三亲交配法将亚克隆质粒ｐＬＧＣ转化进农杆菌ＬＢＡ４４０４，又获得能在碱性平板和卡那霉素及利福平双抗平板上生长的转化子，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明ＨＢ１０１转化子亚克隆质粒ｐＬＧＣ是由来自于嗜碱芽孢杆菌ＮＴＴ３６染色体ＤＮＡ和双元载体ｐＢＩ１２１组成，且农杆菌ＬＢＡ４４０４转化子含有来自大肠杆菌亚克隆转化子的ｐＬＧＣ质粒。

【总页数】4页(P37-40)【关键词】嗜碱芽孢杆菌;农杆菌;亚克隆;植物表达载体【作者】刘同明;曹军卫;王玲燕;刘阳;俞雁寻【作者单位】武汉大学生命科学学院【正文语种】中文【中图分类】Q939.124;Q943【相关文献】1.嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶基因aldC的克隆及组氨酸融合酶蛋白的表达 [J], 郑雪妮;高秀峰;李永生2.嗜碱芽孢杆菌 cotA 基因克隆表达及部分性质研究 [J], 刘友勋;闫明阳;耿园园;黄娟3.中度嗜盐细菌Halomonas sp.BYS-1甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和表达 [J], 洪青;何健;刘智;李顺鹏4.嗜热脂肪芽孢杆菌耐热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达 [J],N.Tsukagoshi;李尔炀5.嗜盐嗜碱芽孢杆菌NTT76启动子和信号肽序列的克隆及表达 [J], 陈建军;曹军卫;苏莉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

嗜碱芽孢杆菌 cotA 基因克隆表达及部分性质研究

嗜碱芽孢杆菌 cotA 基因克隆表达及部分性质研究刘友勋;闫明阳;耿园园;黄娟【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2016(032)008【摘要】In order to obtain a multi-copper oxidase with unusual features,a cotA gene from alkalophilic Bacillus clausii KSM-K16 was cloned and expressed in Escherichia coli. According to the CotA sequence from B. clausii KSM-K16 and the codon preference in E. coli, the gene of full-length sequence was designed,synthesized,and cloned into the expression vector of pET28a. Then the pET28a-cotA was transformed to E. coli BL21(DE3)that was induced to express recombinant protein,which was subsequently purified and biochemically characterized. The purified recombinant CotA was about 62 kD,showed the blue green and had the characteristic absorption peak of Cu2+ at 609 nm. Also the recombinant CotA oxidized the substrates such as ABTS,SGZ and bilirubin. When SGZ as substrate,the optimal temperature and pH was 90℃ and 7.5,respectively. CotA maintained more than 70% of its original activity after incubating at 80℃ for 2 h. Furthermore,it was quite stable over pH ranging 4.0-11.0,more than 90% of its original activity after incubating at 37℃ for 1 h still remained. The results showed that the CotA from alkalophilic B. clausii was a typical multi-copper oxidase with the activities of laccase and bilirubin oxidase,and presented strong acidic-,alkali-,and thermo-stability.%为了获得具有高性能的多铜离子氧化酶，从极端微生物嗜碱芽孢杆菌（Bacillus clausii KSM-K16）中克隆表达了其芽孢外衣蛋白 CotA。

基因克隆及在大肠杆菌中的表达

KGF-2基因克隆及在大肠杆菌中的表达1引言角质形成细胞生长因子-2 ( Keratinocyte Growth Factor-2，KGF-2)，又称为成纤维细胞生长因子-10 (Fibroblast Growth Factor-10，FGF-10)，是FGFs超家族中角质细胞生长因子家族的一员。

1.1 KGF-2的来源和基因结构KGF-2主要是由成纤维细胞及其他间充质来源的细胞分泌，如成纤维细胞、损伤修复中的肉芽组织以及上皮组织周围的γδT细胞均可分泌KGF-2。

此外，上皮组织的损伤还可上调KGF-2的表达。

人kgf-2基因位于染色体的5p12-p13区域，其基因为单拷贝，由3个外显子和2个内含子组成。

1997年，Emoto等[1]克隆了人的kgf-2的cDNA，其编码的蛋白质由208个氨基酸组成，N端有39个氨基酸组成的疏水信号肽，成熟蛋白含169个氨基酸，其中4个半胱氨酸形成2对二硫键，另一个折叠在肽中。

理论相对分子质量为19.3KD，对肝素具有较强的亲和作用。

Kgf-2的立体结构与其它FGF家族成员相似，为β三叶草型。

1.2 KGF-2的功能KGF-2通过与上皮细胞细胞膜上受体作用特异性促进上皮细胞的增殖、分化和迁移，是胚胎器官发育中重要的多功能信号分子。

KGF-2能够通过刺激表皮细胞的增殖、迁移和分化直接促进伤口的愈合，在组织的重塑过程中起趋化作用[2]。

KGF-2通过与损伤位点黏膜的表皮细胞上的受体结合，引起细胞向受伤处迁移，保护角质细胞免受ROS诱导的细胞凋亡，由此来加快伤口的愈合。

此外，KGF-2同时也能通过刺激其它在组织修复和再生过程中有着非常重要作用的细胞因子(如血小板衍生生长因子，转化生长因子和成纤维细胞生长因子)的表达来间接作用于组织的重塑[3]。

KGF-2有两种细胞膜表面受体：FGFR1Ⅲb和FGFR2Ⅲb。

KGF-2与FGFR2Ⅲb的亲和力高，是其特异性配体。

KGF-2与受体结合后，促使受体处于细胞内的Ｃ端酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的受体具有酪氨酸蛋白激酶活性，并与一系列靶蛋白发生作用，引发信号级联反应，发挥生物学功能[4,5]。