异硫氰酸荧光素FITC
FITC-右旋糖酐内化实验
FITC-右旋糖酐内化实验FITC-右旋糖酐从嵌入细胞的纤维蛋白水凝胶中释放纤维蛋白水凝胶是组织工程和药物输送应用中的重要生物材料。
这样，纤维蛋白通常与靶向再生组织的细胞和生物分子结合。
先前的实验研究分析了纤维蛋白水凝胶中不同分子的释放。
但是，嵌入式细胞对释放曲线的影响尚待定量研究。
实验的重点是在48小时的观察期内从纤维蛋白水凝胶中释放250 kDa的异硫氰酸荧光素（FITC）-右旋糖酐（FD），该纤维蛋白水凝胶中含有不同浓度的成纤维细胞或内皮细胞。
与无细胞凝胶相比，在纤维蛋白凝胶中添加细胞可使总释放量降低一小部分（成纤维细胞降低7–15％，内皮细胞降低6–8％）。
释放曲线显示受多种细胞活动的调节，包括凝胶降解和扩散的物理阻碍。
未发现细胞产生的力和基质变形（即致密化和纤维排列）对释放曲线有显着影响。
通过启用预测和调节各种生物分子释放曲线的方法，预期该知识将改善纤维蛋白在组织工程和药物递送应用中的整合。
小分子右旋糖酐制剂（脉通注射液）连续注射可发生较严重蓄积症，特点为间歇性弛张高热。
蓄积主要在淋巴结，其次为肺、肝、蓄积和代谢是缓慢进行的，可长达一年左右。
连续给药总量在300克以上易产生蓄积症。
据本文推断蓄积症的间歇性弛张高热发病机理可能由于迟发超敏型变态反应，每一次发热则为一次速发型，故属于混合型变态反应性疾病。
右旋糖酐的蓄积部位有选择性，脾脏病变不明显原因尚不清楚。
医药上右旋糖酐的应用很普遍。
右旋糖酐胶体液具有扩充血容量、维持血压的功效供出血及外伤休克时急救用。
右旋糖酐在人体内水解后会转变成较低分子量的化合物与血浆具有相同的胶体特性，会迅速代谢成葡萄糖，可作为血浆代用品。
中分子量右旋糖酐的排出较慢，作用时间可达6h，是外伤、大量失血时急救用药；小分子及低分子右旋糖酐还能改善微循环，消除血管内红细胞聚集防止血栓形成及渗透利尿的作用，可用于治疗急性失血性休克、心肌梗塞、脑血栓、脑供血不足、周围血管病及防止弥散性血管内濒血和肾功能衰竭等功效。
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
一、酶标记1、辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。
为了防止HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/LNaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。
(3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml)，混匀。
(4)称取SephadexG25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。
(5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403×0.4IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。
异硫氰酸荧光素标记亲和素使用说明
异硫氰酸荧光素标记亲和素使用说明
FITC-Avidin
货号：SF065
规格：0.5ml
保存：-20℃避光保存，有效期12个月。
产品组成：
1ml FITC-Avidin产品中含1mg高度亲和纯化Avidin，F/P==3/1；
缓冲剂成分：0.01M PBS,防腐剂。
其中Avidin经化学修饰，等电点由pH10降为pH6.5。
标记方法：
FITC标记采用Hijmans,W.,et al.所研究的方法。
（参考文献：Hijmans,W.,et al.Clin.Exp.Immunol.,4,457(1969)
使用说明：
FITC标记试剂稀释液：PBS或TBS缓冲液，加入试剂级BSA至1%。
使用上述稀释液，免疫荧光法按1：10-1:100稀释，具体的稀释度须自己预先确定。
稀释后溶液应于当天使用，未用完的应弃置。
若产品存在微量沉淀，可离心后使用。
相关试剂：
SP2-10兔IgG免疫球蛋白抗原
SPA8-1羊抗小鼠IgG(纯化)
SF8-0.3羊抗兔IgG-FITC
SE16-0.1兔抗猪IgG-HRP
A1820HRP标记的抗体稀释液。
荧光素FITC标记抗体的原理和操作方法
荧光素FITC标记抗体的原理和操作方法中文名称：异硫氰酸荧光素酯中文别名：荧光素-5-异氰酸酯; 异硫氰酸荧光酯异构体; 异硫氰酸荧光橙红; 异硫氰酸荧光红; 异硫氰酸荧光黄; 异硫氰酸荧光素（同分异构体I）; 荧光素5-异硫氰酸盐,异构体1,95%; 异硫氰酸荧光素异构体1.95+%; 异硫氰酸荧光素英文名称：Fluorescein isothiocyanate isomer I英文别名：Fluorescein isothiocyanate, isomer 1; 5-FITC;5-Isothiocyanato fluorescein; FITC; FITC-CELITE(R); FITC ISOMER; FITC 'ISOMER I'; FITC, ISOMER I; FLUORESCEIN ISOMER I ISOTHIOCYANATE;2-(6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)-5-isothiocyanatobe nzoic acidCAS号：3326-32-7 EINECS号：222-042-0 分子式：C21H11NO5S分子量：389.3807InChI：InChI=1/C21H11NO5S/c23-12-2-5-15-18(8-12)27-19-9-13(24 )3-6-16(19)20(15)14-4-1-11(22-10-28)7-17(14)21(25)26/h 1-9,23H,(H,25,26)分子结构：密度： 1.46g/cm3熔点：360℃沸点：735.6°C at 760 mmHg闪点：398.7°C水溶性：practically insoluble蒸汽压： 1.02E-22mmHg at 25°C【FITC标记原理】当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。
异硫氰酸荧光素标记的方法
异硫氰酸荧光素标记的方法
异硫氰酸荧光素（FITC）标记的方法主要有两种：
1. 直接标记法：将待标记的抗体或蛋白与FITC溶液混合，按照一定的比例（通常是抗体/蛋白质：FITC=1mg:150μg）在4℃下反应8小时。
反应结束后，可以通过加入终止液来停止反应，并将标记物进行纯化。
2. 间接标记法：先将FITC与某种中间分子（如半乳糖、葡聚糖等）连接，再将中间分子与待标记的抗体或蛋白连接。
这种方法通常用于标记大分子物质，如细胞或组织切片。
需要注意的是，FITC标记过程中要保持避光，以避免荧光淬灭。
此外，标记反应的时间、温度和pH值等因素也会影响标记效果，需要进行优化和控制。
BSA-FITC
牛血清白蛋白（BSA）-FITC
Albumin Bovine Serum-FITC
【产品材料】
1、异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate，FITC）
异构体I（IsomerI），Sigma F-7295，M.W：389.4
发射光谱（吸收光谱）493nm，荧光光谱550nm
2、牛血清白蛋白（BSA），Japan（分装），M.W：68000，纯度98%。
（Albumin Bovine Serum）
3、标记缓冲液：0.5MpH9.5C.B，洗脱液：0.01MpH7.2PBS
【标记方法】
直接标记法，RT2.5~3.0hs，离心后过Sephadex G-50，0.01MpH7.2PBS洗柱，洗脱液为0.01MpH7.2PBS。
【质量分析】
溶液为0.01MpH7.2PBS，蛋白浓度为 5.12mg/ml左右，FITC浓度为30~45ug/ml，含有2~5/万NaN3防腐，每支0.5ML。
【保存温度】
-20℃冻存一年以上。
【应用范围】
1、用于细菌、病毒、梅毒螺旋体、钩端螺旋体等微生物的抗原或抗体检查。
2、用于临床自身免疫病的多种自身抗体荧光检查，如抗核抗体，抗心肌抗体等。
3、细胞因子等检查的荧光流式细胞仪测定。
4、白细胞分型抗原的免疫荧光染色。
5、免疫组织及免疫病理中抗原，抗体检查，如各种肿瘤抗原检查。
FITC标记胰岛素的合成、纯化及表征
FITC标记胰岛素的合成、纯化及表征李铮;褚丽芸;郑爱萍【摘要】目的以异硫氰酸荧光素(FITC)标记胰岛素(INS)制备荧光探针FITC-INS,并对FITC-INS进行纯化,结构鉴定及活性分析.方法 FITC通过共价结合标记INS分子,投料比为3:1,采用Sephadex G-25凝胶滤过色谱柱分离和纯化FITC-INS,质谱法进行结构鉴定,通过测定血糖值评价FITC-INS的生物活性.结果荧光标志物FITC-INS纯度较高,与游离INS相比,FITC-INS降血糖效果无显著性差异,保留了INS的生物活性.结论本研究所制备的荧光探针FITC-INS纯度高且生物活性良好.【期刊名称】《中国医药指南》【年(卷),期】2011(009)016【总页数】3页(P8-10)【关键词】胰岛素;异硫氰酸荧光素;荧光标记【作者】李铮;褚丽芸;郑爱萍【作者单位】北京市药品审评中心,北京,100053;邯邢冶金矿山局总医院,河北,邯郸,056005;军事医学科学院毒物药物研究所,北京,100850【正文语种】中文【中图分类】R927胰岛素（insulin，INS）是一种由51个氨基酸组成的蛋白多肽类药物，是目前临床治疗糖尿病最主要、最有效的药物。
但由于胃酸的破坏、消化酶的降解以及难以跨越生物膜的机械屏障作用等使得该类药物口服无效，只能以注射的形式给药，且往往需要长期反复地频繁给药，为患者带来极大的不便，因此近十几年来开发口服给药系统的胰岛素纳米粒制剂已引起国内外药学工作者的广泛关注[1-3]。
INS相对分子质量大（相对分子质量约5800），并且由于强亲水性而使其难以跨越脂质膜吸收，为了改善和提高水溶性药物的口服吸收利用度，口服吸收机制的研究非常重要，其中以Caco-2细胞为模型，结合激光共聚焦技术和流式细胞技术，开展药物口服吸收机制的研究是一种常用的途径[4-8]。
本研究以异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）作为荧光探针设计合成了荧光标记的INS （FITC-INS），此标志物可用于激光共聚焦显微镜的观察或流式细胞仪的检测，以探讨INS跨膜转运的吸收机制。
FITC标记多糖的研究进展
FITC标记多糖的研究进展孙檬檬;郝鲁江【摘要】多糖具有抗肿瘤、提高免疫力等多种生物学活性,是国内外研究的重要药物来源.由于多糖没有光吸收的基团,无法直接通过荧光分光光度计等设备检测,因而将多糖进行荧光标记成为检测多糖的重要方法.荧光标记技术分析多糖能够具有较高的灵敏度和选择性,其中异硫氰酸荧光素(FITC)在生化研究中应用较为广泛.目前关于FITC标记多糖的研究颇为丰富,本文对相关研究进展进行了综述.【期刊名称】《山东轻工业学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(032)005【总页数】5页(P22-26)【关键词】异硫氰酸荧光素;多糖;标记【作者】孙檬檬;郝鲁江【作者单位】齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物基材料与绿色造纸国家重点实验室,济南250353;齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物基材料与绿色造纸国家重点实验室,济南250353【正文语种】中文【中图分类】Q946多糖是高分子化合物,包括同多糖和杂多糖,多由10个以上单糖构成的糖单位重复组成。
多糖除了具有生活功能(如淀粉),还有免疫调节[1]、抗肿瘤[2]、抗衰老[3]、降血糖[4]、降血脂[5]等功能。
为了便于在研究过程中使用荧光分光光度计、流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜等设备的检测,将不携带光吸收基团的多糖进行荧光标记成为检测多糖的首要、关键技术难点。
荧光探针技术分析多糖灵敏度高、选择好,在化学和生物的研究分析中广泛应用[6-7],目前已逐渐代替了放射性同位素标记方法。
荧光素类、罗丹明类、氰染料等是较为常见的荧光染料。
其中,荧光素类染料又包括异硫氰酸荧光素、羟基荧光素(FAM)等。
这些染料可以与—OH、—SH、—NH2等基团结合,用于荧光探针检测和分析多糖。
荧光素类染料标记的方法较稳定、效率高；罗丹明类染料的活性部位可与待标记物的—NH2结合,常用的染料包括羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、四乙基罗丹明(RB200)等,其稳定性更好、标记效率更高；氰染料在光照下不稳定,但标记效率较高、光谱范围广,主要包括香豆素类、哌洛宁类等染料。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)
FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。
有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。
FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。
其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
FITC是一种常用的绿色荧光探针。
FITC的吸收(激发)和发射峰参见下表。
Fluorophore Absorption Peak(nm) Emission Peak(nm)
FITC 492 520
当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。
一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→FITC-NS-C-N-H2-蛋白质
常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。
1．Marsshall法
(1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或3．0的0．01mol ／LPBS等。
(2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。
②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。
a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。
b．总蛋白量(AXB)＝Crag。
c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20) d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。
e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。
f．PBS量D-(B+F)=Gml。
注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。
③结合(或标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完)，加完后，继续避光搅拌12h左右。
结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故需将烧杯和搅拌器一起移人4℃冰箱中。
④透析结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心(2500r／min)20rain，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用pH8．0缓冲盐水透析(0～4~C)过夜。
⑤过柱取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。
洗脱液：0．01mol／L磷酸盐缓冲液(pH7．2)；过滤量：12ml标记全球蛋
白液(过滤前未透析)；收集量：20ml(稀释1．7倍左右)。
2．Chadwick法
(1)试剂和材料抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%碳酸钠水溶液、0．01mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、离心机及离心管、烧杯（25ml）搅拌器、无菌吸管，无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500ml）透析袋等。
(2)方法及步骤①抗体准备用o～4~C的pH8。
0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30～40mg／ml，置入25ml烧杯内，放于冰槽中。
②荧光色素准备按每毫克免疫球蛋白加入荧光素0．01rug计算，称取所需的荧光素，用3％碳酸钠水溶液溶解。
③将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在o～4~C冰箱中结合(最好在磁力搅拌机上持续搅拌)18～24h。
④透析和柱层析方法同Marsshall法。
3．改良法
(1)试剂和材料①0．01mol／L(pH7．2)PBS配法中，校定pH至7．2。
NaCi 18g、Na2HP04 1．15g，溶于2000ml蒸馏水
②0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液配法取0．5mol／LNazCOs(5．3％)10ml加入0．5mol／LNaHC03(4．2％)90ml，混合后，校定pH至9．0。
③3％碳酸钠水溶液配法称L 5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。
④其他试剂和材料l％叠氮化钠、离心机及离心管、烧杯(25m1)、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500m1)透析袋等。
(2)方法及步骤①取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水(0．15mol／LNaCl)及缓冲液(0．5mol／LNaHC03—Na2C03，pH9．0)稀释使每毫升内含蛋白质lOmg，缓冲液为总量的10％，降温至4℃。
②加入异硫氰酸盐(FITC)荧光素[蛋白：荧光素＝(50—80)mg‘lmg]，在0～4~C
下电磁搅拌12～14h。
③然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵(用Nessler试剂测验，至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。
④将制备好的荧光抗体加叠氮化钠o．01％，分装在lml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上，一20~C保存可达2年以上。
4．透析标记法
此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。
(1)试剂和材料试剂和材料同改良法。
(2)方法及步骤①用0．025mol／L碳酸盐缓冲液pH9．0，将欲标记免疫球蛋白稀释成1％浓度，装入透析袋中。
②用同一缓冲液将FITC配成0．1mg／ml的溶液，按10mg／ml球蛋白溶液体积的10倍，将FITC 稀释液盛于圆柱形容器内，并使透析袋浸没于FITC液中。
③容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在4~C电磁搅拌下透析标记24h。
取出透析袋中标记液，即刻用SephadexG50凝胶过滤，去除游离荧光素，分装，贮存于4℃中。