微囊藻毒素生物合成基因及其功能研究进展

微囊藻毒素生物合成基因及其功能研究进展摘要：水体富营养化加剧，导致了蓝藻水华在世界范围内频发。

蓝藻产生的微裳藻毒素是最常见的一种藻毒素，对人类和动物造成了很大的危害甚至导致死亡。

微囊藻毒素经非核糖体合成途径由多肽合成酶合成。

对微囊藻毒素的结构与性质、微囊藻毒素合成基因的功能及其生物合成、微囊藻毒素的分子生物学检测技术进行了评述，对未来的研究方向进行了展望。

关键词：微囊藻毒素；蓝藻：基因；检测随着社会的发展，生活及工农业生产中大量含氮、磷的废污水未经有效处理被排入水体中，导致水体富营养化，蓝藻等藻类成为水体中的优势种群，大量繁殖形成水华，蓝藻水华暴发带来的微囊藻毒素（microcystin，MC）污染已经成为全球关注的环境问题。

微囊藻毒素造成了众多中毒事件，对人类和动物的健康造成了很大的威胁。

深入认识微囊藻毒素，了解微囊藻毒素的结构、编码基因及其合成，有助于对微囊藻毒素进行有效的监测，对微囊藻毒素的合成进行干预，从而在监测、控制和消除等方面有效解决微囊藻毒素的危害问题，对水体环境的保护具有重要的现实意义。

1微囊藻毒素的结构与性质微囊藻毒素是一种单环七肽肝毒素，一般结构为环（D-Ala-X-D-MeASp/D-Asp-Z-Adda—D-Glu-Mdha）（图1）。

分子结构1位上是D-丙氨酸（D-Ala）；2、4位上的X和Z分别代表不同的氨基酸；3位上是D-赤-β-甲基天冬氨酸（MeAsp）；5 位上是（2S，3S，8S，9S）-3-氨基—9—甲氧基一2，6，8-3甲基-10-苯基-4，6-_烯酸（Adda）；6位上是D一谷氨酸（D-Glu）；7位上是N一甲基脱氢丙氨酸（Mdha）。

其中.Adda是一种特殊氨基酸，是毒素活性表达所必需的基团，其结构改变会导致毒性减弱或丧失。

因为结构中存在可变氨基酸，所以微囊藻毒素有多种异构体，目前发现的已经超过90种。

其中最普遍、毒性较大的是MC-LR、RR和YR（L、R、Y分别代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸）。

微囊藻毒素对蛋门磷酸酶1和2A的活性具有抑制作用及多种毒效应。

肝脏是微囊藻毒素主要的靶器官，微囊藻毒素会引起肝脏炎症、肝损坏甚至坏死，另外其还与肿瘤促进作用有联系。

腹腔注射小鼠实验发现MC-LR半致死率（lethal dose 50% LD50）为50 μg/kg，MC-RR和MC-YR毒性相对较低。

世界卫生组织（WoI-ld Health Or-ganization，WHO）规定饮用水中微囊藻毒素的含量不得超过为1μg/L。

微囊藻毒素具有较好的水溶性，在水中的溶解度大于1g/L，另外还能溶解于丙酮和甲醇。

微囊藻毒素还具有很高的耐热性，加热煮沸都不能将其去除。

由于微囊藻毒素的这些性质，常规的水处理工艺不能将其有效去除，因此对微囊藻毒素的检测以及预防显得尤为重要。

2 微囊藻毒素的合成基因及基因功能微囊藻毒素由聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）和非核糖体合成酶（non-ribosomal peptidesynthetase，NRPS）等特殊的酶利用氨基酸或者化合物，绕开核糖体，通过非核糖体合成途径完成合成，微囊藻毒素合成基因（microcystin syn-thetase genes，mcy），是第一个被完全测序的蓝藻代谢物合成基因。

Tillett 等最先解析了微囊藻属（Microcystis）PCC7806的mcy基因，基因全长55kb，包含mcyA -C和mcyD -J两个操纵子，共有10个开放阅读框，主要编码PKS和NRPS。

mcyD-j操纵子，编码PKS、NRPS和PKS混合的杂交酶、剪裁酶、以及转运酶；mcyA -C操纵子，主要编码3个NRPS。

微囊藻毒素的主要产毒藻种为微囊藻、鱼腥藻（ANABAENA）和浮丝藻（Planktothrix），3个藻属的mcy基因均已测序和鉴定出来，各个藻属mcy基因的基因单元在结构上是相似的，但是在基因的排列上略有不同（图2）。

在基因单元方面，对比3个藻属可以发现，浮丝藻属无mcyF和mcyl基因，而多了mcyT 基因。

在基因排列上，微囊藻属和鱼腥藻属的两个操纵子呈相反方向排列，而浮丝藻属的操纵子呈单向排列（mcyT除外）。

下面以微囊藻PCC7806合成微囊藻毒素（MC-LR）为例，根据mcy基因参与合成的顺序详细介绍这10个基因以及它们在合成中的作用（图3）。

mcyG、mcyD和mcyE共同完成Adda的合成；mcyE还参与D—谷氨酸和L-丝氨酸的加入；mcyA参与Mdha的加入；mcyB参与L一亮氨酸和MeAsp的加入；mcyC 参与L-精氨酸的加入，并完成环化，最终完成MC-LR的合成。

2.1 mcyGAdda是微囊藻毒素毒性表达所必需的基团，根据相关酶的同源性和生物信息学的分析，Adda在，mcyG、mcyD、mcyE和mcyJ的共同作用下合成，mcyG 完成其第一步合成。

mcyG位于mcyF上游，全长7 896 bp，编码294 266 D的多肽，为PKS和NRPS。

mcyG氨基末端的NRPS模块含有氨酰基腺苷酰化结构域（amiinoacyl adenylation，A），利用ATp，活化苯丙素，活化的苯丙素被转移至硫醇化结构域（thiolation），之后进入PKS通路。

活化的苯丙素单元随后在丙二酰辅酶A （malonyl-CoA）的延伸作用以及mcyD、E、G的PKS通路的修饰下逐渐延伸。

PKS含有β一酮酯酰合成酶（β -keloacyl synthase，KS）、酰基转移酶（acyltransferase，AT）、C-甲基转移酶（C-methyltransferase，CM）、酮酯酰还原酶（β-ketoacyl reductase，KR）和酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP）结构域。

Moore等研究发现，AT结构域可能与丙二酰辅酶A的接收有关。

在AT 结构域的作用下，丙二酰辅酶A上的丙二酰基团被转移到ACP结构域上，依次经KS结构域进行脱羧缩合反应、CM结构域编码C-甲基转移酶对S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）进行甲基化作用、KR结构域进行州还原作用，完成第一个丙二酰辅酶A延伸，从而完成Adda的第一步合成。

2.9 mcyCmcyC使L-精氨酸加入合成链，并完成环化步骤。

mcyC位于mcyB下游，全长3 876 bp，编码147 781 D的多肽，具有NRPS功能，包含C、A和硫醇化结构域，另外在羧基末端还有mcyC所特有的约240个氨基酸的硫酯酶（thioesterase，TE）结构域。

A结构域活化L-精氨酸，C结构域将其最终连接到多肽链上。

最后在TE结构域作用下，进行缩合反应，完成最后环化的步骤，从而完成MC-LR的合成。

2.10 mcyHmcyH位于rncyG上游，全长1 617 bp，编码67 100 D的多肽，为跨膜蛋白，属于ABC转运蛋门家族。

mcyH的作用仍不明确，推测其可能在类囊体定位方面或者是在微囊藻毒素的的释放上起着重要作用。

微囊藻毒素合成基因以一定的顺序排列，每个基因由不同作用的结构域组成，通过一步步的反应，协同作用最终完成微囊藻毒素的合成。

微囊藻毒素的生物合成共需要48个反应，其中45个反应是由mcyA-E和mcyC完成的，另外的4个mcy基因也各自起着重要的作用。

其中mcyD-J操纵子主要完成毒性基团Adda的形成，而mcyA一C操纵子主要完成氨基酸的加入以及环化的步骤。

对微囊藻毒素合成基因以及基因功能的充分研究，为利用PCR技术检测微囊藻毒素奠定了坚实的基础。

3 微囊藻毒素的分子检测目前，微囊藻毒素的检测方法主要有HPLC和酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbentassay，ELISA），两者都能有效地检测出微囊藻毒素的情况，但是对设备、技术以及资金的要求较高。

随着聚合酶链式反应（polymerase chain reac-tion，PCR）技术的发展，同时微囊藻毒素的毒基因mcy也已经被研究分析得比较透彻，数据库中存在各个产毒藻属mcy基因的序列，为运用分子生物学的方法研究产毒蓝藻提供了很好的基础利用PCR技术检测微囊藻毒素的研究已经有很多，并取得了一定的成果。

该方法能够迅速、灵敏可靠的完成对微囊藻毒素的检测，相较于HPLC和ELISA方法，PCR方法更经济，且对技术的要求较低。

综合诸多优势，运用PCR技术榆洲微囊藻毒素具有良好的发展前景，但还需要更深入的研究。

3.1 普通PCR检测方法PCR技术是一种体外快速扩增特定DNA片段的方法，已经广泛运用于产毒蓝藻的检测中，相比于HPLC和ELISA等方法，该技术灵敏度更高，检测速度更快，还能够在毒素释放前进行预测。

通过对mcy基因片段设计特异性引物，运用PCR技术扩增目的片段，根据是否能够得到目的片段来定性检测蓝藻是否具有产毒能力。

运用PCR技术检测产毒蓝藻是从检测产毒微囊藻开始的，后运用到产毒鱼腥藻和产毒浮丝藻的检测，以及多种产毒蓝藻的同时检测。

Tillett等研究了微囊藻产毒和进化之间的关系，分别针对mcyA的NMT结构域、16S rRNA 和PC-IGS设计引物，对纯培养的37株微囊藻进行PCR扩增，发现其中18株包含产毒基因。

将NMT基因与l6S rRNA和PG-IGS基因扩增出的序列分别建树分析，发现产毒蓝藻和非产毒蓝藻无规律分布于树上。

Kurmayer等对澳大利亚Irrsee 和Mondsee湖分离纯培养的浮丝藻进行PCR扩增，发现49株红色浮丝藻（Planktothrix Rubescens）都包含mcy基因，而23株阿氏浮丝藻（Planktothrix agardhii）中，有的包含mcy基因，有的没有。

在PCR检测结果阳性的情况下，进行HPLC、MALDI-TOF质谱以及蛋白磷酸酶抑制实验，发现在两个藻种中都存在假阳性情况，即PCR检测阳性，而实际并未产生微囊藻毒素。

这种情况的出现可能是基因存在部分缺失，或者是环境因素对基因表达造成了抑制，从而无法完成微囊藻毒素的合成。

Hisbergues等针对mcyA的缩合结构域设计引物，对52株纯培养的蓝藻进行扩增，包含24株微囊藻、8株鱼腥藻、11株浮丝藻、2株念珠藻和7株节球藻。

结果发现11株微囊藻、6株鱼腥藻、8株浮丝藻和1株念珠藻，共26株蓝藻PCR检测结果为阳性，其方法适用于同时检测微囊藻属、鱼腥藻属以及浮丝藻属中的产毒情况。

在方法上，除了常规的PCR方法，还有多重PCR和全细胞PCR的方法运用到产毒蓝藻的检测上。

潘卉等针对mcyB设计引物.对30株纯培养的微囊藻进行全细胞PCR扩增.其中18例阳性，与HPLC 和ELISA检测结果一致。