3-4、溶菌酶的制备实验
实验方法
原料处理 吸附 去杂蛋白 洗脱
沉淀
干燥
盐析Leabharlann 透析方法步骤1）制备蛋清：将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞， 使蛋清流出（鸡蛋清pH值不得小于8），轻轻搅拌5分钟， 使鸡蛋清的稠度均匀，用铜筛过滤除去脐带块等其他杂质， 量体积约为100mL。 2）吸附：温度降至5 ℃左右，边搅拌边加入处理好的724 树脂50g（湿重），使树脂全部悬浮于蛋清中。保持0-5摄 氏度，搅拌吸附5h，将蛋清在0-5 ℃静置过夜。 3）去除杂蛋白：把上层清液渐渐倒出，下层树脂用清水洗 去吸附的蛋白质，反复4次，将树脂抽滤去水分。
实验目的
掌握从蛋清中分离提取溶菌酶的工艺和方法； 了解溶菌酶的物理化学性质；
主要仪器设备和药品
（1）耗材：pH试纸、500mL烧杯、100mL 烧杯、玻璃棒、60-80目筛子、200mL量 筒、滤纸、布氏漏斗、抽滤瓶、透析袋、 pH试纸碱性、pH试纸酸性、50mL离心管 （2）试剂：鸡蛋5个、724树脂50g、磷酸二 氢钾、氢氧化钠固体、硫酸铵、浓盐酸、固 体氯化钠、丙酮、磷酸二氢钾 （3）仪器设备：电动搅拌器、冰箱、真空泵、 真空干燥箱
6）盐析：向澄清透析液中慢慢滴加1mol/L氢氧化 钠，同时不断搅拌，pH上升到8.5-9时，如有白色 沉淀，立即离心除去。在搅拌中加入3mol/L盐酸， 使溶液pH达到3.5，按体积缓缓加入5%固体氯化 钠，即有白色沉淀析出。在0-5℃放置48h，离心 或过滤得溶菌酶沉淀。 7）干燥：沉淀加入10倍量(冷至0℃)的无水丙酮， 不断搅拌，冷处静置数小时，用漏斗滤去丙酮，将 沉淀置于真空干燥箱（室温）干燥，称重，计算溶 菌酶得率。
溶菌酶的制备（3-4）8学时
溶菌酶的性质
（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰 胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase）， 是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。 是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳 香族氨，酸的比例较高，酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸。 白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮， pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。稳定性：酸性介质中可稳定存 在，碱性介质中易失活；96℃， pH值为3条件下，15min后活 力保持87%。抑制剂有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十 二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。1%水溶液在 281.5nm处的吸光系数为26.4。
思考题
1.讨论影响溶菌酶得率的因素？ 2.试分析提取溶菌酶所需要树脂的选择原则？ 3.树脂724是阴离子还是阳离子交换树脂？是酸性 还是碱性？ 4.溶菌酶的化学性质？ 5.溶菌酶的特点（优点）？ 6.溶菌酶的作用机理？
溶菌酶的特点（优点）
（1）溶菌酶是很稳定的蛋白质，有较强的抗热性。蛋清溶菌酶是C型，是 已知的最耐热的酶； （2）溶菌酶不会因为有机溶剂的处理而失活，当转移到水溶液中时，溶菌 酶的活力可全部恢复； （3）溶菌酶可被冷冻或干燥处理，且活力稳定； （4）溶菌酶适宜pH5.3~6.4，可用于低酸性食品防腐； （5）溶菌酶生产成本较低； （6）溶菌酶的抗菌谱较广，不仅局限于G+ 菌，对部分G-菌也有抑制效果； （7）溶菌酶作为防腐剂安全性高。溶菌酶是一种天然蛋白质，1992年 FAO/WTO 的食品添加剂协会已经认定溶菌酶在食品中应用是安全的。
溶菌酶的用途
用于生化研究，临床上用于急慢性咽喉炎、扁平苔癣、扁平疣等疾病 的治疗。 直接破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，而达到杀菌的作用，这主要是因为革兰氏 阳性细菌的细胞壁主要是由胞壁质和磷酸质组成，其中胞壁质是由杂多糖和 多肽组成的糖蛋白，这种多糖正是由N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间 的β-1，4键联结的。 对某些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶 的破坏。 溶菌酶是母乳中能保护婴儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能通过消化道 而保持其活性状态，溶菌酶还可以使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆 菌的增加，还可以促进蛋白质的消化吸收
生产方法
以蛋清为原料，在pH6.5条件下，用 弱酸性阳离子交换树脂732（724）吸附后，再 用硫酸铵洗脱，经透析后冷冻干燥得产品。 从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个 氨基酸残基构成的单一肽链。
溶菌酶的作用机理
溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，它主要作 用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间 的β-1，4键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，从 而破坏细菌的细胞壁，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌 溶解，失去对细胞的保护作用，最终使细菌溶解死亡。 溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、 脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、 消炎、抗病毒等作用。 通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌， ： 菌悬浮液═ 溶菌并澄清。
4）洗脱：取0.15mol/L（pH6.5）磷酸缓冲液150mL， 分3次加入树脂中，搅拌约为15min，每次搅拌后减压抽 滤去水分；用10%硫酸铵200mL，分4次洗脱溶菌酶， 每次搅拌30min，过滤抽干，合并洗脱液，按总体积加 入32%（质量体积比）固体硫酸铵使含量达到40%，有 白色沉淀产生。冷却放置过夜，弃上清，沉淀离心分离 （或抽滤），得粗制品。 5）透析：将粗制品溶解于50ml蒸馏水，装入透析袋， 0-5 ℃透析24-36h。
（4）溶液配制： 1）0.15mol/L（pH6.5）磷酸缓冲液：取磷酸二氢钾6.8g,加 0.1mol/L氢氧化钠溶液152mL，用水至1定容到1L，即得； 每组150mL。 2）0.1mol/L氢氧化钠溶液：4g氢氧化钠固体放入烧杯中,用 800mL左右蒸馏水溶解，冷却后用蒸馏水定容至1L，即得； 每组160mL。 3）10%硫酸铵溶液：称取无水硫酸氨100g，用800mL水溶 解，用蒸馏水定容至1L，即得；每组200mL。 5）1mol/L氢氧化钠溶液：40g氢氧化钠固体放入烧杯中,用 800mL左右蒸馏水溶解，冷却后用蒸馏水定容至1L，即得。 6）3mol/L盐酸溶液：量取100mL浓盐酸加入300mL水中， 混合均匀即得。
溶菌酶实验 实验报告 第七组
溶菌酶的提取和系列性质测定实验报告学院：生物科学与工程学院班级：姓名：学号：组别：第七组组员：一、实验内容：溶菌酶的提取和系列性质测定在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。
酶的提纯工作往往要求多种方法交替应用，才能得到较为满意的效果。
常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。
酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离提纯效果。
溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
溶菌酶相对分子质量约为1.44×104，是一种强碱性蛋白质，等电点在10.0以上，并对温度和酸不敏感。
在自然界中，普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中，植物卷心菜、萝卜、木瓜等，以蛋清含量最丰富，约为0.3%。
本实验用鸡蛋为原理，通过阳离子交换层析，硫酸铵沉淀，分子筛层析等步骤提取溶菌酶。
二、实验原理：1蛋白质提取分离技术以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。
一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。
溶菌酶的制备
溶菌酶的制备[适用对象]生物工程专业[实验学时]18学时一、实验目的1、掌握：用阳离子交换树脂724树脂层析分离溶菌酶；透析的操作和盐析的操作。
2、了解：溶菌酶的制备的基本过程和溶菌酶的应用与溶菌酶的活性检测方法。
二、实验原理溶菌酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清里，蛋清溶菌酶含量丰富，溶菌酶是一种碱性球蛋白，在pH6.5时，带正电荷，可与阳离子交换剂进行离子交换，进行粗分离，蛋白质溶液可以盐析沉淀，蛋白质不能透过半透膜，可用透析除盐进行精纯。
三、仪器设备离心机、冷冻干燥机、低温冰箱、透析代、层析柱等。
四、相关知识点多课程知识点：蛋白质化学特点，生化提取方法：蛋白质分解方法，离子交换原理与方法。
本课程知识点综合：蛋白质制备方法。
五、实验步骤（一）724树脂的预处理1、水浸泡，浮洗市售724树脂200g用蒸馏水500ml浸泡30分钟，搅拌稍静置，将细小颗粒浮洗掉。
2、泡酸4%盐酸处理浸泡1小时，水洗中性。
3、泡碱4%氢氧化钠处理浸泡1小时，水洗中性，再用pH6.5 PBS浸泡平衡，得钠型724树脂。
（二）原料处理1、取蛋清每组打新鲜鸡蛋20个取蛋清约200ML于2000ML烧杯中。
2、除杂质新鲜蛋清除去脐带、弹壳碎片等杂质。
3、预冷新鲜蛋清置于4℃冰箱预冷。
（三）粗纯1、吸附处理的新鲜蛋清用处理好的724树脂100g ，在5-10℃搅拌吸附2小时。
2、洗涤吸附完毕，树脂用蒸馏水洗涤3次，再用0.15M, pH6.5 PBS洗涤树脂，滤干树脂，除去洗涤液。
3、洗脱洗涤完后树脂装入层析柱，用2/3体积的10%硫酸铵洗脱2次，收集洗脱液。
4、沉淀10%硫酸铵洗脱液加固体硫酸铵至总液含40%硫酸铵进行盐析沉淀，沉淀滤干得溶菌酶粗品。
（四）精纯1、溶解溶菌酶粗品用一倍量蒸馏水溶解成溶菌酶粗品液。
2、透析膜前处理市售透析膜，用蒸馏水浸泡，煮沸。
冷却，取出，用橡皮筋系紧一端。
试试漏不漏水。
3、透析溶菌酶粗品液装入透析袋，系紧于装有蒸馏水的烧杯中透析8小时，透析2-3次，即换水2-3次。
溶菌酶的提纯结晶和活力测定.实验报告doc
一方面如流行感冒和腺病毒,可能它的蛋白质外壳具有溶菌酶的作用点,现已证明,腺病毒在人体内引起呼吸道炎症,在实验动物中引起肿瘤。因此,用溶菌酶可以治疗呼吸道疾患,抗动物肿瘤。另一方面溶菌酶作用的细菌产物可诱发产生干扰素,而干扰素主要功能是抗病毒。
(3)提高抗菌素疗效
因为抗菌素是微生物合成的代谢产物,通过抑制细菌细胞壁肤聚糖及核酸和蛋白质的合成,影响细胞膜,因而具有抑制或致死其他微生物的作用。而溶菌酶也作用于细胞膜,与抗菌素合用可提高疗效。
（3）本实验的酶活力单位定义为：每分钟A450nm下降0.001为一个活力单位（25℃，pH6.2）
P=(A0-A1)/m ×1000
式中 P：每毫克酶的活力单位（U/mg）；
A0：零时450nm处的吸光度；
A1：1min时450nm处的吸光度；
m：样品的质量（mg）；
1000：0.001的倒数，即相当于除以0.001。
(4)组织修复
一方面酞胺类溶菌酶已证明对细胞的生长、分裂起直接作用.另一方面溶菌酶作用的微生物细胞壁是含氮的多糖(叫粘多糖),它在组织生长和再生过程中起重要作用。日本学者在各种类型伤口的实验鼠中证明了溶菌酶的组织修复和临床治疗作用。
(5)促进血凝
实验证明:糖昔酶作用于鱼(节肢动物甲壳类),其分解产物一脂多糖具有凝胶化作用,通过激活凝血酶原,促进血凝,在人类临床上已用于牙科和泌尿科等小手术止血。
(6)微生物分类上的作用
如果两种不同的微生物细胞壁都能受同一种酶的作用,就说明这两种微生物细胞壁有相同成分,可以此作为微生物分类的依据。
(7)肤聚糖的免疫生物学活性
免疫是机体抵抗一切抗原异物的能力,已知作用于革兰氏阳性细菌上有三种酶:糖昔酶、肤链内切酶和酞胺酶,这些酶在体内或游离在玻璃容器内的检出体外用,会产生不同的免疫效应,其中肤链内切酶产生的胞壁酞二缩氨酸的作用尤为突出。最近日本学者研究发现溶菌酶可作为潜在检测金属免疫毒性的生物标志剂。
溶菌酶的提取分离和纯化实验报告
生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定实验报告集班级生工1411学号组别7姓名实验室学生守则一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员的指导。
二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。
三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。
凡不按教师的指导擅自操作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。
四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。
未经允许不得随便挪动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室外。
五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和吃东西。
六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管理人员报告。
七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。
预习报告（手写，可自行续页）实验报告溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定一、目的对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定二、原理鸡蛋是溶菌酶的主要来源，等电点约为10.5~11，最适温度50℃，最适pH为6~7左右。
1、溶菌酶分离纯化原理：（1）等电点法利用溶菌酶等电点较高，在酸性条件下除去一些杂蛋白（2）阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白2、溶菌酶鉴定分析（1）考马斯亮蓝法测蛋白含量（2）分光光度法测定酶活性（3）使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度三、实验材料与方法1、实验材料与试剂鸡蛋清，PBS缓冲液，40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋，考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸，溶菌酶标准品、底物微球菌粉，蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等2、实验仪器低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计，玻璃层析柱，Bio-Rad垂直电泳系统，移液枪、移液管，培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。
溶菌酶的提取分离和纯化实验报告
溶菌酶的提取分离和纯化实验报告生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定实验报告集班级生工1411学号组别7姓名实验室学生守则一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员的指导。
二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。
三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。
凡不按教师的指导擅自操作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。
四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。
未经允许不得随便挪动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室外。
五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和吃东西。
六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管理人员报告。
七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。
预习报告（手写，可自行续页）溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定名称实验目的和要求：实验材料：主要仪器：主要步骤：教师签名：时间：实验报告溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定一、目的对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定二、原理鸡蛋是溶菌酶的主要来源，等电点约为10.5~11，最适温度50℃，最适pH为6~7左右。
1、溶菌酶分离纯化原理：（1）等电点法利用溶菌酶等电点较高，在酸性条件下除去一些杂蛋白（2）阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白2、溶菌酶鉴定分析（1）考马斯亮蓝法测蛋白含量（2）分光光度法测定酶活性（3）使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度三、实验材料与方法1、实验材料与试剂鸡蛋清，PBS缓冲液，40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋，考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸，溶菌酶标准品、底物微球菌粉，蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等2、实验仪器低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计，玻璃层析柱，Bio-Rad垂直电泳系统，移液枪、移液管，培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。
实验3 溶菌酶分离提纯
【实验原理】 实验原理】
溶菌酶(lysozyme) 溶菌酶 又称胞壁质酶， 又称胞壁质酶，或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶 乙酰胞壁质聚糖水解酶 相对分子量为14600Da，由129个氨基酸残基组成 ， 相对分子量为 个氨基酸残基组成 等电点在11.0附近 附近 等电点在 最适pH 6-7，最适温度为 ℃ 最适 ，最适温度为50℃ 切断细菌细胞壁多糖中NAM和NAG之间的 1,4糖 和 之间的β- 糖 切断细菌细胞壁多糖中 之间的 苷键
【思考题】 思考题】
1. 离子交换层析法分离纯化蛋白质具有哪些优缺点？ 离子交换层析法分离纯化蛋白质具有哪些优缺点？ 2. 概述蛋白质分离提纯的基本原理和一般流程。 概述蛋白质分离提纯的基本原理和一般流程。
CM Sepharose FF（快速羧甲基琼脂糖凝胶） （快速羧甲基琼脂糖凝胶）
弱酸性阳离子交换剂 物理化学性质稳定、交换容量大、流速快、 物理化学性质稳定、交换容量大、流速快、洗脱条件温和
琼脂糖凝胶— 琼脂糖凝胶 O—CH2COO+
琼脂糖凝胶— 琼脂糖凝胶 O—CH2COONaCl
+
+
琼脂糖凝胶— 琼脂糖凝胶 O—CH2COO- Na+
实验原理溶菌酶lysozyme又称胞壁质酶或n乙酰胞壁质聚糖水解酶最适ph67最适温度为50切断细菌细胞壁多糖中nam和nag之间的14糖等电点在110附近实验原理实验原理溶菌酶的粗提溶菌酶耐热性较高而其它杂蛋白在高温下变性沉淀鸡蛋清液酸性条件85溶菌酶带正电荷与酸根负离子生成可溶性盐使溶菌酶与其他蛋白质分开得到溶菌酶的粗提液离心离子交换层析iec是基于待分离物质的酸碱性极性等差异它们与离子交换剂的亲和力不同通过离子之间的吸附和脱吸附而将各组分依次从层析柱中洗脱下来从而达到分离目的
溶菌酶的制备实验报告
一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取、分离和纯化方法。
2. 掌握酶活性测定和蛋白质浓度测定技术。
3. 了解溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定方法。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种胞壁质酶，具有破坏细菌细胞壁的能力。
本实验采用鸡蛋清为原料，通过提取、分离和纯化等步骤，制备高纯度的溶菌酶。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鸡蛋清- 酶活性测定试剂盒- 蛋白质浓度测定试剂盒- 溶菌酶纯度鉴定试剂盒- 分子量测定试剂盒2. 实验仪器：- 低温高速离心机- 酶标仪- 荧光分光光度计- 凝胶电泳仪- 凝胶成像系统四、实验方法1. 溶菌酶粗提取（1）取一定量的鸡蛋清，加入适量的生理盐水，搅拌均匀。
（2）将混合液用低温高速离心机以4,000 rpm离心10分钟，取上清液。
（3）用酶活性测定试剂盒检测上清液中的溶菌酶活性。
2. 溶菌酶分离纯化（1）取上清液，加入适量的硫酸铵，使蛋白质沉淀。
（2）将混合液用低温高速离心机以4,000 rpm离心10分钟，取沉淀。
（3）将沉淀用生理盐水溶解，加入适量的G-25凝胶柱，进行凝胶过滤。
（4）收集洗脱液，用酶活性测定试剂盒检测洗脱液中的溶菌酶活性。
3. 溶菌酶纯度鉴定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入溶菌酶纯度鉴定试剂盒，进行电泳分析。
（2）观察电泳图谱，鉴定溶菌酶的纯度。
4. 溶菌酶分子量测定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入分子量测定试剂盒，进行SDS-PAGE电泳分析。
（2）观察电泳图谱，计算溶菌酶的分子量。
5. 溶菌酶活性测定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入酶活性测定试剂盒，进行酶活性测定。
（2）记录酶活性值。
6. 溶菌酶蛋白浓度测定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入蛋白质浓度测定试剂盒，进行蛋白浓度测定。
（2）记录蛋白浓度值。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶粗提取上清液中溶菌酶活性为XX单位/mL。
2. 溶菌酶分离纯化洗脱液中溶菌酶活性为XX单位/mL。
3. 溶菌酶纯度鉴定电泳图谱显示，溶菌酶的纯度为XX%。
溶菌酶自组装实验报告
溶菌酶自组装实验报告引言溶菌酶是一种具有抗菌作用的酶类物质，广泛存在于许多生物体中，如人类、植物和细菌中。
溶菌酶能够通过水解细菌细胞壁上的β-（1，4）-N-乙酰葡萄糖胺键而引起细菌的溶解。
近年来，研究者们发现溶菌酶不仅具有杀菌作用，还能够通过自组装形成各种纳米结构，为纳米技术和生物医学研究提供了新的途径。
本实验旨在通过自组装方法制备溶菌酶纳米颗粒，并对其形貌和结构进行表征。
实验方法材料准备- 溶菌酶粉末- 磷酸盐缓冲液（PBS）- 无水乙醇- 离心管- 紫外可见分光光度计实验步骤1. 将一定量的溶菌酶粉末称取到离心管中。
2. 加入适量的PBS溶液，并用震荡仪将其均匀悬浮。
3. 把悬浮液置于40恒温水浴中，保持一定时间。
4. 向悬浮液中加入一定浓度的无水乙醇。
5. 用紫外可见分光光度计测量悬浮液的吸光度，记录下其数值。
结果与分析根据实验步骤，我们制备了不同浓度的溶菌酶纳米颗粒溶液，并对其进行了表征。
在实验中，我们发现随着乙醇浓度的增加，溶菌酶纳米颗粒的形貌和结构发生了明显的变化。
首先，当未加入乙醇的悬浮液经过自组装反应后，观察到溶菌酶纳米颗粒的分布较为均匀，颗粒大小均匀。
这说明溶菌酶在PBS溶液中能够自发地形成纳米级的聚集体。
然而，当加入一定浓度的乙醇后，我们观察到溶菌酶纳米颗粒的直径明显增大，而且形状变得不规则。
这可能是由于乙醇的存在改变了溶菌酶分子之间的相互作用，使其形成了更大的聚集结构。
同时，乙醇的加入也导致了纳米颗粒的聚集程度加剧，颗粒之间的空隙减少。
另外，我们通过测量纳米颗粒溶液的吸光度来评估溶菌酶纳米颗粒的质量。
实验结果显示，在乙醇浓度为10%时，纳米颗粒的吸光度最高，说明其质量最优。
然而，随着乙醇浓度继续增加，纳米颗粒的吸光度逐渐下降，可能是由于过高的乙醇浓度导致纳米颗粒的聚集不稳定。
结论通过溶菌酶自组装实验，我们成功制备了溶菌酶纳米颗粒。
实验结果表明，乙醇的加入对溶菌酶纳米颗粒的形貌和结构产生了明显影响。
溶菌酶
⑷ 洗脱：用柱平衡液洗脱杂蛋白，在收集洗脱液的
过程中，逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱 情况，当基线开始走平后，改用含1.0mol/L NaCl的 pH值6.5，浓度为0.02 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱，收 集洗脱液。 ⑸ 聚乙二醇浓缩：将上述洗脱液合并装入透析袋内，
使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去脐带 块，量体积约为100ml。
2.鸡蛋清粗分离
按过滤好的蛋清量边缓慢搅拌边加入等体积的去 离子水，均匀后在不断搅拌下用1mol/L HCl调pH 值至7左右，用脱脂棉过滤收滤液。
3.D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析 ⑴ D152树脂处理：将D152树脂先用蒸馏水洗 去杂物，滤出，用1mol/L NAOH 搅拌浸泡并搅 拌4～8小时，抽滤干, 用蒸馏水洗至近pH7.5, 抽滤干, 再用1mol/L HCl按上述方法处理树脂， 直到全部转变成氢型，抽滤干HCL, 用蒸馏水 洗致近pH5.5，保持过夜，如果pH之不低于5.0， 抽滤干HCL,用2mol/L NAOH 处理树脂使之转变 为钠型，pH值不小于6.5。吸干溶液，加pH6.5 0.02mol/L的磷酸盐缓冲液平衡树脂。
聚糖的多层网状结构，作为细胞壁的骨架，上述结构中的任何化学 键断裂，皆能导致细菌细胞壁的损伤。对于G+细菌与G-细菌，其 细胞壁中肽聚糖含量不同，G+细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成， 而G-细菌只有内壁层为肽聚糖，因此，溶菌酶对G+细菌的作用优 于对G-细菌的作用。
1.2 人及哺乳动物溶 菌酶：人溶菌酶存在于眼泪、唾液、 鼻粘液、乳汁等分泌液以及淋巴腺和白血球中， 1ml眼泪 中含7mg溶菌酶，1ml乳汁中含0.1～0.5mg。人溶菌酶由 130个氨基酸残基组成，有4个S-S键，分子量为14600， 其溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高3倍。对于哺乳动物溶菌酶， 目前仅从牛、马、羊等动物的乳汁中分离出溶菌酶，其化
实验3溶菌酶分离提纯
02
实验条件控制不当
实验条件如温度、pH值等未能在 适宜范围内，影响了实验结果。
04
数据分析错误
对实验数据进行分析时，可能存 在误判或遗漏，导致结论不准确
。
对实验的改进建议
加强操作培训
严格控制实验条件
对实验操作人员进行培训，提高其操作技 能和实验水平。
确保实验条件如温度、pH值等在适宜范围 内，以提高实验结果的可靠性。
加强试剂管理
完善数据分析方法
建立试剂管理制度，确保试剂质量可靠、 使用有效。
对数据分析方法进行完善，确保能够准确 解读实验结果。
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溶菌酶的浓缩和结晶
浓缩
将溶菌酶溶液进行浓缩，以降低溶剂的体积。
结晶生长
将诱导后的溶液放置在恒温条件下，让结晶 慢慢生长。
结晶诱导
向浓缩后的溶菌酶溶液中加入适量的盐或有 机溶剂，以诱导结晶的形成。
离心收集结晶
将结晶离心分离出来，并用适量的水或缓冲 液洗涤。
04 结果分析
分离效果的分析
分离效果
通过实验结果，我们可以观察到溶菌 酶的分离效果。通过色谱图或电泳图， 可以直观地看到目标蛋白与杂质蛋白 的分离情况。
掌握实验操作技能
01
通过本实验，学生将掌握溶菌酶 分离提纯的基本实验操作技能， 包括调节溶液pH值、沉淀、萃取 、吸附等。
02
学生将学会使用离心机、分光光 度计等实验仪器，了解实验数据 的处理和分析方法。
02 实验原理
溶菌酶的分子结构和性质
01
溶菌酶是一种碱性蛋白，分子量约为14000-18000 道尔顿，由约129个氨基酸组成。