耐万古霉素肠球菌基因分型及耐药性分析

ＤＯＩ：１０．１３６０２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｃｌｓ．２０１９．０７．０６·临床实验研究·耐万古霉素肠球菌基因分型及耐药性分析程晨１，谭枝微１，刘颖梅２，纵帅３，姜飞３，谢硕硕１，顾兵１，３（１．徐州医科大学医学技术学院，江苏徐州２２１００４；２．北京中日友好医院临床微生物与感染实验室，北京１０００２９；３．徐州医科大学附属医院检验科，江苏徐州２２１００２）摘要：目的　明确万古霉素耐药肠球菌（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ，ＶＲＥ）耐药基因型别及耐药性，指导临床用药。

方法　收集北京中日友好医院２０１６年１０月至２０１７年１０月临床分离的１７株ＶＲＥ，Ｖｉｔｅｋ２Ｃｏｍｐａｃｔ全自动细菌鉴定及药敏分析系统检测其对临床常用１４种抗菌药物的敏感性，Ｅ ｔｅｓｔ法确证其对万古霉素和替考拉宁的药物敏感性；ＰＣＲ法检测１７株ＶＲＥ的耐药基因ｖａｎＡ、ｖａｎＢ、ｖａｎＣ１、ｖａｎＣ２／３，并经测序验证。

结果　１７株ＶＲＥ均为耐万古霉素屎肠球菌，均对环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、青霉素１００％耐药，对利奈唑胺、替加环素、奎奴普丁／达福普汀等敏感；其耐药基因型均为ｖａｎＡ型，其中有４株ｖａｎＢ表型－ｖａｎＡ基因型。

结论　所收集的ＶＲＥ均对万古霉素高水平耐药，耐药型均为ｖａｎＡ型，应加强临床分离株的耐药监控，合理使用抗菌药物。

关键词：万古霉素耐药肠球菌；Ｅ ｔｅｓｔ法；聚合酶链反应；耐药基因型中图分类号：Ｒ４４６．５ 文献标志码：ＡＧｅｎｏｔｙｐｅａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｆｏｒｖａｎｃｏｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉＣＨＥＮＧＣｈｅｎ１，ＴＡＮＺｈｉｗｅｉ１，ＬＩＵＹｉｎｇｍｅｉ２，ＺＯＮＧＳｈｕａｉ３，ＪＩＡＮＧＦｅｉ３，ＸＩＥＳｈｕｏｓｈｕｏ１，ＧＵＢｉｎｇ１，３（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＸｕｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｕｚｈｏｕ２２１００４，Ｊｉａｎｇｓｕ；２．ＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｎｆｅｃｔｉｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈｉｎａ ＪａｐａｎＦｒｉｅｎｄｓｈｉｐＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００２９；３．ＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｔｈｅＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＸｕｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｕｚｈｏｕ２２１００２，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉ ｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｇｅｎｏｔｙｐｅａｎｄｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｖａｎｃｏｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ（ＶＲＥ）ｆｏｒｇｕｉｄｉｎｇｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＳｅｖｅｎｔｅｅｎＶＲＥｓｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＣｈｉｎａ ＪａｐａｎＦｒｉｅｎｄｓｈｉｐＨｏｓｐｉｔａｌｆｒｏｍＯｃｔｏｂｅｒ２０１６ｔｏＯｃｔｏｂｅｒ２０１７ｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ，ａｎｄｔｈｅｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｉｅｓｔｏｆｏｕｒｔｅｅｎｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｒｕｇｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＶｉｔｅｋ２ＣｏｍｐａｃｔＡｕｔｏ ｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉａｌＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＤｒｕｇＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍ．ＴｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓｔｏｖａｎｃｏｍｙｃｉｎａｎｄｔｅｉｃｏｐｌａｎｉｎｗｅｒｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙＥ ｔｅｓｔ．ＴｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅｖａｎＡ，ｖａｎＢ，ｖａｎＣ１ａｎｄｖａｎＣ２／３ｉｎｔｈｅｓｅｖｅｎｔｅｅｎＶＲＥｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＰＣＲａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＡｌｌｔｈｅｓｅｖｅｎｔｅｅｎＶＲＥｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｃｏｎｆｏｒｍｅｄｔｏｂｅｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓａｎｄｃｏｍｐｌｅｔｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ｍｏｘｉｆｌｏｘａｃｉｎ，ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，ｂｕｔｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏｌｉｎａｚｏｌａｍｉｎｅ，ｔｅｇｉｃｙｃｌｉｎｅａｎｄｑｕｅｎｕｐｔｉｎｅ／ｄａｆｏｓ ｔｉｎｅ，ｅｔｃ．ＴｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｏｔｙｐｅｏｆｔｈｅｓｅｖｅｎｔｅｅｎｓｔｒａｉｎｓｗａｓａｌｌｖａｎＡ，ｏｆｗｈｉｃｈｆｏｕｒｗｅｒｅｖａｎＢｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｖａｎＡｇｅｎｏｔｙｐｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＴｈｅＶＲＥｓｔｒａｉｎｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗｅｒｅａｌｌｈｉｇｈｌｙｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ，ａｎｄｔｈｅｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｏｔｙｐｅｗａｓｖａｎＡ，ｓｏｔｈｅｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｆｏｒｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｃｌｉｎｉｃａｌｉｓｏｌａｔｅｓａｎｄｒａｔｉｏｎａｌｕｓｅｏｆａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｓｈｏｕｌｄｂｅｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ；Ｅ ｔｅｓｔｍｅｔｈｏｄ；ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ；ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｏｔｙｐｅ １９８８年英国首次报道万古霉素耐药肠球菌（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ，ＶＲＥ），随后１９９３年北美，１９９４年新加坡［１］均报道当地ＶＲＥ的出现，ＶＲＥ已经在全球范围内成为院内感染的重要病原菌之一。

ＶＲＥ还存在将万古霉素耐药性传递到金黄色葡葡球菌的危险，导致万古霉素耐药金黄色葡萄球菌（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ，ＶＲＳＡ）的出现［２］。

近年来，中国ＶＲＥ的流行率相比欧美较低，但在中国各地都有报道［３ ４］，需对ＶＲＥ进行密切监测并控制其播散。

此篇研究对分离出的ＶＲＥ菌株进行耐药表型和基因型研究，从而了解其流行情况，为临床治疗提供依据。

１　材料与方法１．１　菌株来源　１７株ＶＲＥ菌种均来自２０１６年１０月至２０１７年１０月北京中日友好医院临床微生物与感染实验室鉴定后的冷冻保存菌株，标本来源包括尿液１０株，全血２株，胆汁１株，腹水１株，血导管基金项目：国家自然科学基金（８１８７１７３４）；江苏省卫生计生委科研项目（Ｈ２０１６３１）。

作者简介：程晨，１９９６年生，男，硕士研究生，临床检验诊断学专业；谭枝微，１９８５年生，女，硕士研究生，主管技师，临床检验诊断学专业。

程晨撰写论文，参与实验；谭枝微参与实验，为共同第一作者。

通信作者：顾兵，博士，副研究员，Ｅ ｍａｉｌ：ｇｂ２００３１１２９＠１６３．ｃｏｍ。

头２株和伤口组织１株，其中存在同一患者但不同部位的分离株。

所有临床分离株经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦＭＳ）仪、Ｖｉｔｅｋ２Ｃｏｍｐａｃｔ全自动细菌分析仪与Ｅ ｔｅｓｔ法鉴定复核。

１．２　仪器与试剂　ＭＡＬＤＩ ＴＯＦＭＳ仪（德国布鲁克公司）；Ｖｉｔｅｋ２Ｃｏｍｐａｃｔ全自动细菌分析仪，万古霉素、替考拉宁Ｅ ｔｅｓｔ试条（法国生物梅里埃公司）；细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒（天根生物公司）；１０００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ、ＰｒｅｍｉｘＴａｑ（日本ＴａＫａＲａ公司）；ＰＣＲ扩增仪、凝胶成像仪（美国Ｂｉｏ Ｒａｄ公司）。

１．３　药物敏感性试验　用Ｖｉｔｅｋ２Ｃｏｍｐａｃｔ全自动微生物鉴定和药敏系统（ＧＰ６７药敏卡）测定细菌对１３种常用抗菌药物的耐药谱；用Ｅ ｔｅｓｔ条检测１７株ＶＲＥ对万古霉素和替考拉宁的耐药性，结果判定根据美国临床和实验室标准化协会（ＣＬＳＩ）２０１７推荐的标准，药敏试验质控菌株为粪肠球菌ＡＴＣＣ２９２１２（购自原卫生部临床检验中心）。

１．４　引物设计与合成　耐药基因ｖａｎＡ、ｖａｎＢ、ｖａｎＣ１、ｖａｎＣ２／３片段的引物序列参考文献［５］，用软件ＡｒｒａｙＤｅｓｉｇｎｅｒ设计，由上海生工生物工程公司合成。

引物序列见表１。

表１　万古霉素耐药基因ＰＣＲ检测所用引物基因引物序列（５′→３′）产物长度（ｂｐ）ｖａｎＡＦ：ＧＴＡＧＧＣＴＧＣＧＡＴＡＴＴＣＡＡＡＧＣ２３１Ｒ：ＣＧＡＴＴＣＡＡＴＴＧＣＧＴＡＧＴＣＣＡＡｖａｎＢＦ：ＧＴＡＧＧＣＴＧＣＧＡＴＡＴＴＣＡＡＡＧＣ３３０Ｒ：ＧＣＣＧＡＣＡＡＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＣＴＣｖａｎＣ１Ｆ：ＴＧＧＴＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＡＧＧＡＡＡＣＣ４４７Ｒ：ＡＧＡＴＴＧＧＡＧＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＴＣｖａｎＣ２／３Ｆ：ＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＡ５９７Ｒ：ＣＡＡＧＣＡＧＴＴＴＴＴＧＴＡＧＴＡＧＴＴＣ１．５　ＤＮＡ模板提取　将－８０℃冷冻干燥保存的肠球菌菌株用肉汤复苏并接种至血琼脂平板，３５℃培养２４ｈ后，再接种至ＬＢ液体培养基过夜增菌。

１２～１４ｈ后用细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒提取ＤＮＡ，参照试剂说明书操作，测定提取的ＤＮＡ的浓度和纯度，并于－２０℃保存备用。

１．６　耐药相关基因检测　用ＰＣＲ检测万古霉素耐药基因型。

ＰＣＲ反应体系共５０μＬ，包括ＰｒｅｍｉｘＴａｑ（ＥｘＴａｑ１．２５Ｕ，ｄＮＴＰ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ，ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ４ｍｍｏｌ／Ｌ）２５μＬ，ＤＮＡ模板２μＬ，２０μｍｏｌ／Ｌ上、下游引物各１μＬ，无菌去离子水２１μＬ。

反应条件为：９５℃预变性３ｍｉｎ；９５℃变性３０ｓ，５６℃退火３０ｓ，７２℃延伸４５ｓ，３５个循环；７２℃延伸５ｍｉｎ。

ＰＣＲ产物用１５ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳检测，在１００Ｖ电压下电泳５０ｍｉｎ后将琼脂糖凝胶置于透射紫外仪下观察并拍照，取阳性菌株条带测序鉴定。

测序工作均由上海生工生物工程公司完成。

２　结果２．１　菌种鉴定结果　通过ＭＡＬＤＩ ＴＯＦＭＳ和Ｖｉｔｅｋ２Ｃｏｍｐａｃｔ全自动细菌分析仪鉴定，１７株ＶＲＥ均为屎肠球菌。

２．２　药敏结果２．２．１　Ｖｉｔｅｋ２Ｃｏｍｐａｃｔ全自动细菌分析仪药敏结果　所有ＶＲＥ均对环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、青霉素耐药；但均对利奈唑胺、奎奴普丁／达福普汀、替加环素敏感，见表２。

表２　Ｖｉｔｅｋ２Ｃｏｍｐａｃｔ药敏检测结果抗菌药物耐药株数耐药率（％）环丙沙星１７１００左氧氟沙星１７１００利奈唑胺００莫西沙星１７１００氨苄西林１６９４．１青霉素１７１００奎奴普丁００四环素６３５．３万古霉素１７１００红霉素１１６４．７替加环素００高水平庆大霉素协同３１７．６高水平链霉素协同４２３．５２．２．２　Ｅ ｔｅｓｔ结果　１７株屎肠球菌均对万古霉素耐药，最低抑菌浓度（ＭＩＣ）均≥２５６μｇ／ｍＬ；其中，有４株对替考拉宁敏感（ＭＩＣ为２、４、２、８μｇ／ｍＬ），３株对替考拉宁中介（ＭＩＣ＝１６μｇ／ｍＬ）。