(完整word版)细菌的生理生化鉴定方法
细菌的生理生化鉴定原理
细菌的生理生化鉴定原理细菌的生理生化鉴定原理是通过研究细菌在生理和生化特性上的表现来确定其种属和特征。
这种鉴定方法是通过对细菌的形态学、生长特性、代谢能力和化学成分进行综合分析来实现的。
细菌的形态学特征是鉴定的首要依据之一。
形态学特征包括细菌的大小、形状、结构和染色性质等方面。
比如，革兰氏染色能够将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两类，从而提供了重要的区分依据。
此外，细菌的胞外结构如菌落形态、胶囊、鞭毛和纤毛等也是鉴定的重要特征。
生长特性也是细菌鉴定的重要方面。
不同细菌对于温度、pH值、氧气需求和营养要求等环境条件的适应性不同，这些特征可以用来筛选并确认细菌的种属。
比如，某些细菌能够在高温环境下繁殖，而对于大多数细菌来说则无法生长。
此外，细菌在不同培养基上的生长特性也可以作为鉴定的参考依据。
代谢能力是细菌鉴定的重要标志之一。
不同细菌具有不同的代谢特点，通过研究其对特定底物的利用能力和生成产物的特征可以推断细菌的种属和特征。
鉴定方法包括对特定酶活性的检测以及特定代谢产物的分析等。
化学成分也为细菌的鉴定提供了重要线索。
细菌的化学成分主要包括细胞壁、细胞膜和核酸等。
比如，细菌的细胞壁成分可以通过特定染色方法进行检测，如革兰氏染色可以判断细菌是否具有胞壁，并进一步分析细菌的细胞壁组分。
此外，核酸序列分析技术如16S rRNA测序可以用于细菌鉴定，通过比对细菌的核酸序列与数据库中的已知细菌进行比对，可以确定细菌的种属和基因亲缘关系。
细菌的生理生化鉴定方法是综合分析多个指标和依据，通过不同特征之间的关联和差异来进行细菌的分类鉴定。
常用的鉴定方法包括传统的生理生化试验、分子生物学技术以及基于质谱和光谱的分析方法等。
这些方法在细菌鉴定研究中发挥了非常重要的作用，为医学、环境科学和生物工程等领域的研究提供了有效的工具和基础。
细菌鉴定中常用的生理生化反应
葡萄球菌可产生凝固酶，使血浆中的 纤维蛋白原转变为纤维蛋白，导致血 浆凝固。
其他细菌的分类和鉴定
氧化发酵试验
细菌对碳水化合物的代谢方式不同，可分为氧化型和发酵型。通过 观察细菌在氧化发酵培养基中的生长情况和颜色变化来判断结果。
硝酸盐还原试验
细菌可将硝酸盐还原为亚硝酸盐或氮气，通过观察培养基中硝酸盐 的颜色变化来判断结果。
细菌鉴定在医学、工业等领域的应用
细菌鉴定对于医学诊断、流行病学调查、食品卫生、环境监测等领域具有重要意 义，因此，掌握细菌鉴定的方法和技巧至关重要。
细菌鉴定的重要性
准确识别病原菌
通过细菌鉴定，可以准确识别 引起人类和动植物疾病的病原 菌，为疾病的预防和治疗提供
科学依据。
保障食品安全
细菌鉴定在食品工业中用于检 测食品中的有害菌和腐败菌， 确保食品的安全和质量。
细菌鉴定中生理生化反应的改进方向
自动化技术应用
通过自动化仪器和计算机技术，实现 生理生化反应的自动化操作和数据分 析，提高鉴定效率和准确性。
多项指标联合应用
将多个生理生化反应指标联合应用， 形成综合评价体系，提高细菌鉴定的 准确性和可靠性。
新型反应的开发
针对现有生理生化反应的不足，开发 新的反应类型和试剂盒，以满足更多 种类细菌的鉴定需求。
明胶液化试验
某些细菌可分泌明胶酶，将明胶分解为可溶性的多肽和氨基酸，通过 观察明胶的液化情况来判断结果。
05
细菌鉴定中生理生化反 应的优缺点及改进方向
生理生化反应的优缺点
准确性高
通过特定的生理生化反应，可以准确 地鉴定细菌种类。
操作简便
大多数生理生化反应的操作步骤相对 简单，易于掌握。
生理生化反应的优缺点
细菌常用生理生化鉴定
细菌鉴定中常用的生理生化反应录入时间:2009-8-13 15:12:12 来源：中国生命科技论坛1、实验原理（1）细菌生化试验各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。
用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。
（2）糖（醇）类发酵试验不同的细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。
其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。
酸的产生可利用指示剂来判定。
在配制培养基时预先加入溟甲酚紫［P HS . 2 （黄色）一6 . 8 （紫色）] ，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。
气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。
（3）甲基红（Methylred ）试验（该试验简称MR 试验）很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH 降低到4 . 2 以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。
因甲基红指示剂变色范围是pH4 . 4 （红色）一pH6 . 2 （黄色）。
若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱梭，转化成醇等物，则培养基的pH 仍在6 . 2 以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。
（4）大分子物质代谢实验．靛基质（口引睬）试验某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质（叫睬），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质（红色化合物）。
硫化氢试验某些细菌能分解含硫的氨基酸（肌氨酸、半肌氨酸等），产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。
为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。
明胶液化实验某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝固能力，呈现液体状态，是为阳性。
淀粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不做）细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶（淀粉酶）将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖（或麦芽糖），再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。
菌株生理生化鉴定实验方法
菌株生理生化鉴定实验方法1.接触酶实验用枪头取一个菌落放在载玻片上，加一滴3%的h2o2于菌落上，立即观察有无气泡出现。
2.淀粉水解实验（没透明化圈）淀粉酶活性鉴定培养基：lb培养基（0.5%酵提、1%蛋白胨、1%nacl），可溶性淀粉1%，琼脂2%挑实验菌株的单菌落在淀粉酶活性鉴别培养基中划线，30℃培育2天，构成显著菌落后，在平板上几滴加碘液，菌落周围如果存有透明化圈，则则表示淀粉水解为阳性；若仍为蓝黑色则为阴性3.脂酶活性的鉴定实验（有晕圈）脂酶活性鉴别培养基：lb培养基，tween801%，琼脂2%取实验菌株的单菌落在脂酶活性鉴定培养基中划线，30℃培养2天，菌落周围若有晕圈，则为脂酶活性阳性，反之则为阴性。
4．蛋白酶活性的鉴别实验酪明培养基（不可溶性）：lb培养基，0.3%酪蛋白（先碱化1g酪蛋白加1ml1mol/l 的naoh，加水加热溶解），0.5%明胶（加热溶解），2%琼脂（没有）牛奶双层板（可溶性）：上层lb培养基提2%琼脂，下层牛奶、琼脂（牛奶琼脂混合后的浓度都就是2%先把下层好像至平板中，等待下层加热后再好像上层（存有透明化圈）取实验菌株的单菌落在可溶性蛋白酶活性鉴定培养基及不溶性蛋白酶活性鉴定培养基上分别划线，30℃培养2天。
菌株若具有可溶性蛋白酶活性和不溶性蛋白酶活性，则会在菌落周围形成透明圈。
5.纤维素水解实验纤维素酶活性鉴定培养基：lb培养基，1%纤维素钠挑实验菌株的单菌落在纤维素酶活性鉴别培养基上划线，30℃培育5-7天，用0.1%刚果红染色液染色30min后，用蒸馏水冲洗，再用1mol/l的hcl复染30min后冲洗，观测与否存有透明化圈。
6．甲基红实验甲基红和v-p鉴定培养基：蛋白胨0.5%，k2hpo40.5%注射实验菌株于甲基白鉴别培养基中，每次两个重复，30℃培育2d、6d。
在培养液中重新加入一滴甲基白试剂，若为红色，则为甲基白实验阳性反应，反之则为阴性。
细菌的生理生化反应
呼吸酶类试验——细胞色素氧化酶试验
原理：细胞色素氧化酶是细胞色素呼吸酶系统旳最终呼吸 酶。具有氧化酶旳细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型 细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色旳醌类化合物
培养基：丙二酸盐培养基 措施：菌落法、滤纸法、试剂纸片法。前两者挥霍试剂， 后者节省 成果：10秒内呈深紫红色为阳性 意义：肠杆菌科细菌与假单胞菌旳区别，前者阴性，后者 多阳性奈瑟菌属、莫拉菌属也为阳性
糖酵解试验
大肠杆菌 伤寒杆菌 副伤寒杆菌
葡萄糖
+
乳糖
-
-
葡萄糖：
-
糖酵解试验
麦芽糖：
-
+
+
糖酵解试验
甘露醇：
鼠李糖：
-
+
+ -
碳水化合物的代谢试验——氧化-发酵试验（O/F）
原理：细菌分解葡萄糖旳过程中，必须有分子氧参加旳， 称为氧化型；能够进行无氧降解旳，称为发酵型；不分解葡萄 糖旳称为产碱型
成果：能分解糖（醇、苷）类产酸时，培养基中旳指示剂 呈酸性反应。若能产气时，培养基可出现开裂气泡等现象
意义：肠杆菌科尤为主要
糖酵解试验
根据细菌分解利用糖能力旳差别体现出是否产酸产气 作为鉴定菌种旳根据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加 入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2下列呈黄 色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂旳颜色变 化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小 管观察。
呼吸酶类试验——硝酸盐还原试验
意义：肠杆菌科为阳性；铜绿、嗜麦芽能 产生氮气；链球菌肠球菌阴性，葡萄球菌阳性
注意：若加入试剂后无反应，可能是①硝 酸盐没有被还原，试验阴性②硝酸盐被还原为 氨和氮等其他产物而致假阴性，此时要加入少 许锌粉，若出现红色则为阴性，不产生红色则 为假阴性，实际为阳性
细菌的生理生化鉴定
竭诚为您提供优质文档/双击可除细菌的生理生化鉴定篇一：细菌生理生化鉴定实验九细菌的生理生化试验[日期：20XX-5-30]来源：作者：孔庆学[字体：大中小]实验九细菌的生理生化试验1目的1.1了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理1.2掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法2原理各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。
由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，这种差异就表现的更加明显。
不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不相同，也就是说，不同微生物具有不同的酶系统。
即使在分子生物学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。
3材料3.1菌种大肠埃希氏菌（escherichiacoli）、产气肠杆菌（enterobacteraerogenes）、普通变形杆菌（proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）的斜面菌种3.2培养基葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）3.3试剂40％naoh溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示剂。
3.4器具超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管。
4流程糖发酵试验→V-p试验→甲基红试验→吲哚试验5步骤(一)糖类发酵试验1目的了解不同细菌分解利用糖的能力及实验原理，并掌握其操作方法．2原理可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。
是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即b.c.p指示剂，其ph在5.2以下呈黄色，ph在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。
是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。
3材料3.2菌种大肠埃希氏菌（escherichiacoli）、产气肠杆菌（enterobacteraerogenes）、普通变形杆菌（proteus vulgaris）的斜面菌种3.３培养基葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管４流程发酵液试管→标记→接种→培养→观察→记录5步骤5.1试管标记图9-1糖发酵产气取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管各Ａ不产气；Ｂ产气4支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。
实验五细菌的生理生化（范文大全）
实验五细菌的生理生化（范文大全）第一篇：实验五细菌的生理生化实验五细菌的生理、生化试验实验目的：初步学会细菌生理、生化试验的操作、结果分析。
仪器材料：蛋白胨水培养基、糖发酵培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、醋酸铅蛋白胨水培养基、柠檬酸盐琼脂斜面培养基等；甲基红（MR）试剂、维-培（V-P）试剂、靛基质试剂等；大肠杆菌、产气杆菌、沙门氏菌的24h纯培养物等。
微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。
因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一,微生物检验中常用的生化反应介绍如下：一、糖酵解试验不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。
可用指示剂及发酵管检验。
试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。
接种后，置36±1.0°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力，培养物可呈弥散生长。
本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。
一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和An-drade指示剂。
二、淀粉水解试验某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。
淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。
试验方法：以18~24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区接种，试验数种培养物）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1°C培养24~48h，或于20℃培养5天。
然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。
立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。
(完整word版)微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏实验
实验微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏一、实验目的和要求1。
了解微生物的分离纯化方法。
2.学习检测水中大肠菌群的方法。
3。
学习微生物的保藏及鉴定方法。
4。
熟悉革兰氏染二、实验原理多管发酵法多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管.乳糖能起选择作用,因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气.1.初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养,24小时内小套管中有气体形成,并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群,为阳性结果。
48小时后仍不产气的为阴性结果。
2。
平板分离初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂，平板上划线分离菌落。
3.复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落,经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
三、实验器材及试剂1。
水样污水样本2、培养基及试剂：二甲苯、苯酚、琼脂粉、香柏油、乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。
3、器材及耗材：双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布、吸耳球、产气管、培养皿、移液管等四、实验方法及步骤1。
第一天实验前的准备1）配制3支乳糖胆盐液体培养基，每支10mL,并加入产气管.配置营养琼脂培养基，灌装进2支试管中，配置200mL伊红美兰培养基150mL,于121℃高温高压灭菌20分钟，后放进恒温干燥箱。
2）包扎5套培养皿，包扎6根1mL、1根10mL移液管和3支滴管。
于121℃高压灭菌锅中灭菌20分钟。
3）称取一定量的液体石蜡,约为锥形瓶的三分之一。
于121℃高温高压灭菌20分钟。
细菌生理生化鉴定
细菌生理生化鉴定
细菌生理生化鉴定是通过对细菌在特定生理和生化条件下的反应进行观察和分析，以确定其种类和特性的过程。
这通常包括一系列实验，涉及对细菌代谢途径、酶活性、生长条件等方面的研究。
以下是细菌生理生化鉴定的一些常见方法和实验：
1.形态学观察：
形状：观察细菌的形状，可以是球形（球菌）、杆状（杆菌）、螺旋形等。
结构：使用显微镜检查是否有胞壁、胞膜、纤毛、鞭毛等结构。
2.生理特性：
生长条件：观察细菌在不同温度、pH值和氧气条件下的生长情况。
营养需求：测试细菌对不同营养物质（碳源、氮源、矿物质等）的利用能力。
3.生化反应：
大肠杆菌的IMViC测试：Indole（吲哚）测试、Methyl Red（甲基红）测试、V oges-Proskauer（V-P）测试、Citrate（柠檬酸）测试、
4．氧化还原反应：观察细菌对不同氧化还原指示剂（如甲基红、溴亚甲蓝）的反应，推断其对氧化还原条件的适应性。
5.酶活性测试：
氧化酶：使用氧敏感指示剂观察酶的活性。
淀粉酶：利用淀粉琼脂板，观察菌落周围是否发生淀粉分解带。
蛋白酶：使用明胶板检测细菌对蛋白质的分解能力。
6.抗生素敏感性测试：确定细菌对不同抗生素的敏感性，通过纸片扩散法或肉汤稀释法进行。
7.分子生物学方法：16S rRNA测序：通过测序菌株的16S rRNA基因，进行分子水平的种类鉴定。
8.培养基选择：利用特定培养基，如MacConkey琼脂培养大肠杆菌等，根据细菌在培养基上的生长情况进行初步鉴定。
生理生化鉴定
2.2.4.3 生理生化特征测定2.2.4.3.1 生长温度测定将待测菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，置于10 ℃、15 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃的培养箱中恒温培养，每隔12 h观察菌株的生长情况，确定菌株生长的最低及最高温度。
2.2.4.3.2 需氧性测定和运动性测定将待测菌株活化24 h后，穿刺接种到牛肉膏蛋白胨半固体培养基，30±1℃培养，3 d后观察生长状况。
2.2.4.3.3 pH 5.7培养基中生长状况观察取营养肉汤中培养的菌株接种在液体基础培养基(葡萄糖0.5 g、MgSO4·7H2O 0.02 g、NaC1 0.02 g、K2HPO4 0.02 g、CaSO4 0.01 g、酵母浸膏1.0 g、蒸馏水100 g)试管中，30±1 ℃培养1～7 d，观察菌株生长状况。
2.2.4.3.4 耐盐性试验采用PB培养基，分别加入2%、5%、7%、l0%的NaC1。
取幼龄菌种接种培养，30±1 ℃培养7 d，在第3 d、第7 d各观察一次，设未接菌的空白对照。
2.2.4.3.5 接触酶试验将待测菌株在牛肉膏蛋白胨斜面上30±1 ℃培养24 h，滴入3%的H2O2观察气泡的产生情况。
2.2.4.3.6 脲酶试验将待测菌株接种在牛肉膏蛋白胨斜面上，在第3 d和第7 d进行脲酶试验的测定。
方法参照东秀珠，蔡妙英等编著《常见细菌系统鉴定手册》[91]。
2.2.4.3.7 淀粉水解将培养基(肉汁胨中加0.2%的可溶性淀粉)倒成平板，倒置过夜后，接种新鲜菌种，30±1℃培养，待形成明显菌落后滴加卢哥氏碘液，观察菌落四周颜色变化。
2.2.4.3.8 明胶液化培养基：蛋白胨0.5 g、明胶10 g、蒸馏水100 mL、pH 7.2～7.4。
取斜面培养18～24 h菌体穿刺接种，并设未接种的空白对照，置于20±1 ℃培养箱中培养，第2、7、10、14和30 d观察明胶液化情况。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
方法2.3。
5 细菌的生理生化鉴定１、形态学观察采用插片法、埋片法, 对该拮抗细菌的菌落形态特征作镜检观察。
用革兰氏染色进行油镜观察。
① 革兰氏染色溶液和试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式碘液，95％乙醇，番红复染液等.试验步骤：（1) 涂片：取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不易过厚）、干燥和固定。
(2) 初染：滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位1～２min，用水冲洗至流出水无色。
（3）媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖１min，倾去碘液，水洗至流出水无色。
(4）脱色：在上述涂片上流加95％乙醇溶液（一般20~30s）,当脱色至流出液无色时立即用水洗去乙醇。
（5）复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min,水洗,用吸水纸吸去残水晾干。
(6）镜检：用油镜观察。
②芽孢染色（1）制片:按常规方法涂片、干燥及固定。
（2）加热染色：向载玻片滴加数滴5％孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持５min,加热时应注意补充染液，切勿让涂片干涸.脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色.(3）复染：用0.5％番红水溶液复染2min。
(4) 水洗:用缓流自来水冲洗至无色。
(5) 镜检：晾干载玻片后油镜镜检。
③鞭毛染色(硝酸银染色法）(1) 载玻片准备:将载玻片置于含洗衣粉或洗涤剂的水中煮沸 20min，然后用清水充分洗净,再置于 95%乙醇中浸泡，使用时取出在火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹。
(2) 菌液制备：用接种环挑取菌落边缘菌体，悬浮于1～2mL无菌水中制成菌悬液，不能剧烈震荡。
（3) 制片:取一滴菌悬液滴到载玻片一侧，倾斜玻片,使菌悬液流向另一边,用吸水纸吸取多余的菌悬液,自然干燥。
（4）染色：滴加硝酸银染色A液覆盖3～5min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴加B液染色约1 min，期间可用微火加热，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。
自然干燥后用油镜观察。
菌体呈深褐色,鞭毛显褐色。
（5）镜检：用油镜镜检观察。
A、B液需现用现配（4h内效果最佳，1d内可用):A：单宁酸5ｇ,三氯化铁1.5ｇ，蒸馏水100mL，加1%氢氧化钠1mL，15％甲醛2mL.B：硝酸银粉末2ｇ,水100mL，溶解匀均，取出10mL回滴用,往90mL溶液中加浓氨水到出现大量沉淀时再加浓氨水至溶液澄清。
加10mL回滴液回滴至出现薄雾。
２、糖类分解试验配方：蛋白胨 1。
0ｇ；NaCl 0。
5ｇ；0。
2％溴百里香酚兰 1。
2mL;葡萄糖 1.0ｇ；蒸馏水 100mL。
基本原理：糖类分解实验是常用的鉴别微生物的生化反应，鉴定细菌能否利用分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氨气、甲烷、二氧化碳等)。
当发酵产酸是，指示剂可有紫色(pH6。
8)转变为黄色（pH5。
2).气体的产生可由倒置的小管中有无气泡来证明。
试验步骤:用记号笔在试管外面分别标明发酵培养基名称和所接种的细菌的编号。
取盛有葡萄糖发酵培养基的试管，按编号接种细菌，每种细菌做两个平行,可留一个空白，作为对照。
在接种后要轻摇试管，防止倒置的小试管进入气泡.再将将上述已接种的和对照管置37℃温室中培养2～3d 。
观察颜色变化及小试管中有无气泡。
３、V —P 试验配方：蛋白胨 1.5g ；葡萄糖 1。
5g;K 2HPO 4 1。
5g ；蒸馏水300mL ；pH ：7。
4基本原理：此实验也是常用的检验细菌的生化反应之一。
某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇,后者在强碱环境再被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基生成红色化合物，称V —P 反应。
试验步骤：将被检菌接种于试验培养基中，培养2～7d 后，于培养物中加入1mL 10％ 的NaOH ，混匀，再加入3～4滴2% 氯化铁溶液.数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性.４、甲基红试验配方：与V-P 试验的配方相同基本原理：某些细菌在糖代谢过程中，会分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸还可进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基pH 将至4。
5以下，当加入甲基红试剂则呈红色,为甲基红试验阳性。
若细菌分解葡萄糖产酸量小，或者产生的酸进一步转化为其它物质（如醇、酮、醚、气体和水等），则培养基的酸度仍会在pH6。
2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色,为阴性。
试验步骤:接种细菌于培养基，在37℃培养2~7d 后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液（0。
1ｇ甲基经溶于300mL 95% 乙醇中,加蒸馏水至500 mL),如呈红色,表示阳性.５、柠檬酸盐利用试验配方：柠檬酸钠1ｇ;硫酸镁 0.2ｇ;NaCl 5ｇ；NH 4H 2PO 4 1ｇ;K 2HPO 4 1ｇ;琼脂 20ｇ；1%溴麝香草酚蓝酒精溶液 10mL ；蒸馏水 1000mL 。
基本原理：柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸盐能否被利用。
细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，是培养基的pH 升高，当加入1％溴麝香草酚蓝指示剂时,培养基就会有绿色转变为深蓝色。
溴麝香草酚蓝的指示范围为：pH 小于6。
0时呈黄色，pH 在6。
5～7.0时为绿色，pH 大于7.6时呈蓝色。
试验步骤：将被检菌接种到Simmons 固体柠檬酸盐培养基上，37℃下培养2～4d ，能利用柠檬酸盐的细菌表现为有细菌生长,培养基变为蓝色，不能利用柠檬酸盐的细菌不生长，培养基不变色。
６、硝酸盐还原试验配方：硝酸钾 0。
2ｇ；蛋白胨 5ｇ;蒸馏水1000mL；pH:7。
4。
甲液：４-苯胺磺酸(对氨基苯磺酸） 0.4ｇ；5mol/L冰醋酸 50mL。
乙液：α—萘胺 0。
25ｇ;5mol/L冰醋酸 50mL.基本原理：某些细菌能还原硝酸盐为亚硝酸盐,亚硝酸盐与醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的４-苯胺磺酸作用生成重氮基苯磺酸,后者与α-萘胺结合生成N—α萘胺偶苯磺酸。
试验步骤:将被检细菌接种于硝酸盐培养基中，37℃培养1~2d，每管中先加入甲试剂0.1mL，再加乙试剂数滴,如出现红色，表示阳性。
注：本试验阴性的原因有三:细菌不能还原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮；培养基不适于细菌的生长。
如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解，可再加入锌粉少许，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色。
７、淀粉水解试验配方：牛肉膏 0。
5ｇ；蛋白胨 1ｇ;氯化钠 0。
5ｇ；可溶性淀粉 0。
2ｇ；蒸馏水 100mL;琼脂 2ｇ;pH：7.0～7.2。
基本原理:有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。
淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝色.试验步骤:将细菌划线接种于平板上，37℃左右培养1～2d,生长后取出,在菌落处滴加革兰氏碘液少许,能水许解淀粉的细菌菌落周围有透明环，培养基会呈深蓝色。
８、吲哚（靛基质）试验配方:蛋白胨 1ｇ；NaCl 0.5ｇ；蒸馏水 1000mL；pH:7.6。
吲哚试剂自行配制：对二甲基氨基苯甲醛 0。
5g；乙醇(95%） 47。
5mL；浓盐酸 10mL.基本原理：有些细菌可以产生色氨酸酶,分解色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。
吲哚与二甲基氨基苯甲醛反应生成红色的玫瑰吲哚，因此可根据细菌能否分解色氨酸产生吲哚来鉴定菌种.试验步骤:将待检菌种接种于邓享氏蛋白质的胨溶液中，37℃培养1～2d.于培养液中加入戊醇或二甲苯2～3mL,摇匀，静置片刻后,沿管壁加入吲哚试剂2ml,如出现红色沉淀,表示为阳性。
９、接触酶试验配方:牛肉膏蛋白胨培养基基本原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。
试验步骤：将1ml 3％的H2O2倾注于生长物（菌落或菌苔）上，有气泡(O2）发生者为阳性。
也可于清洁小试管中加少量（30％），再用清洁无菌的细玻棒(或火焰封口的毛细管或镍铬做成的接种环）醮细菌少许,插入H2O2液面下，有气泡者为阳性.也可在玻片上滴一滴H2O2蘸取少许培养物，混合，有气泡者为阳性.2.3.6 确定菌种类型参考《伯杰氏细菌鉴定手册》（ Buchanan ＆ Gibbons，1984）和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英,1999) 确定菌种类型。
结果3.3 菌株的生理生化鉴定3.3。
1 菌落的特征分析通过显微镜观察菌落形态特征，结果见表3。
表3 拮抗细菌K1、K2与K3的菌落特征菌株K1K2K3形状椭圆状圆形杆状革兰氏染色阴性阴性阴性芽孢无无无菌落形态椭圆形圆形梅花形菌落颜色乳白浅黄棕黄菌落隆起度凸起凸起凸起K2菌落边缘形状 光滑 光滑 粗糙 菌落表面状态 光滑 光滑 光滑 菌落光泽 有光泽 有光泽 无光泽 菌落干湿程度 干燥 湿润 干燥 菌落透明程度不透明不透明不透明3。
3.2 菌株的生理生化鉴定糖类分解试验 V-P 试验 甲基红试验硝酸盐还原试验 淀粉水解试验吲哚（靛基质）试验 柠檬酸盐利用试验接触酶试验 图3 拮抗细菌K1、K2与K3的生理生化特征表４ 细菌的生理生化鉴定结果K1K2K1K1K1K1K1K1K1K2K2K2K2K2K2K2K3K3K3K3K3K3K3菌种K1 K2 K3糖类分解试验＋－＋V—P试验＋＋＋甲基红试验－－－硝酸盐还原试验＋＋＋淀粉水解试验＋＋＋吲哚（靛基质）试验＋＋＋柠檬酸盐利用试验－＋＋接触酶试验＋＋＋注：“＋”表示阳性，“－"表示阴性，由于糖类分解试验都没有产生气泡，所以这里显示的是能否产酸。
根据细菌的菌落形态及生理生化特征，再参照《伯杰细菌鉴定手册》，初步推测K1为土壤杆菌属，K2为固氮菌属，K3为动胶菌属.如若准确判断，还需进行16S rDNA序列测定。