小鼠脾细胞分离+CFSE染色步骤
小鼠脾脏淋巴细胞分离与CFSE染色步骤
实验材料：小鼠1只、组织剪1把、镊子2把、75%酒精、小鼠固定板、1640培养液（10%FBS，1%双抗）、含0.1%FBS的PBS溶液（无菌）、PBS溶液（无菌）、ACK溶液（无菌）、移液管、枪头、组织研磨棒（无菌）、12孔细胞培养板、15mL离心管、300目尼龙网（无菌），细胞计数板，手术台布。
实验前准备工作：
做好上述实验器具的灭菌工作；将手术台布裹在小鼠固定板上，喷75%酒精，组织剪和镊子用75%酒精浸泡后置于生物安全柜中紫外照射30min；
实验步骤：
1. 取一只6-8周小鼠颈椎脱臼处死后，将其全部浸泡于75%酒精中5min。
2. 取出小鼠将其固定于固定板上，用组织剪和镊子沿小鼠腹白线剪开腹腔，拨开小肠在腹腔左上方紧贴小肠部位取褐红色长条型脾脏，用组织剪剪开筋膜同时不要把脾脏剪破，将取下的脾脏用PBS冲洗两遍，剪去脾脏上连接的结缔组织。
3. 将脾脏转移入组织研磨棒中，向其中加入2mLPBS溶液后研磨三下，尽量不残留较大组织块；再用3ml PBS冲洗研磨棒后，将脾脏研磨液经300目尼龙网过滤至15mL离心管中，再用2ml PBS冲洗研磨器内壁，同样过滤至15mL离心管中，离心500g，5min。
4. 弃上清后，加入2mL 常温ACK，轻微吹打，裂解红细胞1min后加入等体积（2mL）PBS 终止裂解，轻微吹打细胞混匀后离心500g，5min。
CFSE染色开始：
5. 弃上清，用4ml PBS（0.1%FBS）重新混匀细胞，反复吹打为单细胞悬液，再用300目尼龙网过滤。
取10μL细胞液于细胞计数板上计数，并将细胞浓度调至1.0×107/ml。
6. 提前将CFSE按照说明书配成5mM母液并2ul分装储存于-80冰箱备用，其工作浓度为0.5-25μM.
7. 分出一部分细胞加入24孔板中，用于做CFSE空白对照
8. 2μlCFSE + 6ml浓度1.0×107/ml的细胞，工作浓度约为1.67μM，37℃，10min，避光。
9. 加入等体积（ice-cold）含血清1640培养基（10%FBS）终止反应，混匀后冰上孵育5min，再离心：500g，5min；
10. 弃上清，用不含血清1640培养基洗细胞一次；
11. 用6ml不含血清培养基（混合TP5或者Tα1或TP5-Myr）重悬细胞沉淀，充分吹打成单细胞悬液，铺12孔板，每孔1ml，孵育2h后再加100ul FBS至终浓度为10%；
11. 37℃，5%CO2培养3-5天后用流式细胞仪分析细胞488nm激光器检查细胞增殖情况。
CFSE活染方法Protocol
制作细胞悬液，加入等体积 CFSE 工作液，于 37℃孵育 10 min，用 40%体积的冷 小牛血清立即终止标记 10min。 离心洗涤两次后，用适量的完全培养液重悬细 胞。
CFSE 的浓度国外报道从 0.5uM~20uM 都有，建议终浓度为 2.5-5uM。浓度太低， 细胞标记的荧光强度不够，太高了对细胞有毒性，且影响细胞增殖。标记孵育时 要经常摇匀。
试剂盒成分
• CellTrace™ CFSE (Component A), 10 瓶，每瓶 50 μ g • DMSO (Component B), 0.5 mL
使用浓度：
一般来说，长时间染色（超过三天）或快速分裂为 5～10uM，活力分析等短时间分析为 0.5～ 5uM。 荧光显微镜为 25uM。优化并使用尽可能低的浓度以保持细胞的正常生理状态。
5. 37 ℃，避光放置 10min。
6. 250g 室温离心 10 分钟。弃上清，加入含 10%FBS 的完全 1640 培养液洗 2 次。 最后用 1ml R10 培养基（见附录 3）重悬。
7. 将上述细胞悬液加入 24 孔培养板,每孔 1mL,分别加相应的多肽库或者阳性 刺激物 SEB（Sigma, Cat# ）刺激 ,终浓度 1ug/ml
1．1
重悬细胞于预温的 PBS/0.1%BSA，浓度 1×10 6 /ml。
注意：为保证标记均匀，样本需为单细胞悬液。细胞浓度为 10 5 ~10 6 ,依标记后细胞的培养
时间而定。若需传代培养，浓度增加为 1～5×10 7。
1．2
每 ml 细胞中加入 2ul CFSE 贮存液，终浓度为 10uM。注意：最适工作浓度需优化，
二、CFSE 配制
用 DMSO 溶解成 5 mmol/L 的储存液，于- 20 ℃避光保存。使用时，用无血清 DMEM 培养液稀释成 5μ mol/L 的工作液备用。CFSE 试剂盒内有一小瓶 CFSE（A 试剂） 标明 500ug ，另有一小瓶 DMSO（B 试剂），500ugCFSE 溶解于 180ulDMSO 即是 5mMstock solution。
CFSE染色方法
细胞悬液置于离心管底部。
离心管横放，将PBS滴加在靠近管口的管壁上。
再将CFSE加在PBS滴上。
维持离心管横向水平，拧上管盖，迅速垂直倒置离心管于涡旋器上涡旋。
（可参考JOVE网上的CFSE标记视频）
步骤：
1. 常规方法分离PBMC，细胞计数后300g离心10分钟。
弃上清，加入1%FBS/PBS液体重悬，洗涤一次，再用合适体积数目的1%FBS/PBS重悬，取出2×10^6l的细胞悬液，离心弃上清。
2. 用0.1%FBS/PBS稀释CFSE储存液(5000×,5mM)至1umol/L。
3. 用0.5ml上述CFSE稀释液重悬细胞，轻柔混匀。
4. 37 ℃放置10min。
5. 加入1ml冰冷的RPMI 1640 完全培养液，4℃，5分钟以中止染色。
6. 300g室温离心5分钟。
弃上清，加入冰冷的含10%FBS 的完全1640培养液洗2次。
最后用0.4ml 培养基重悬。
7. 将上述细胞悬液加入96孔培养板,每孔105个细胞,（阳性对照用PHA刺激（1ug/ml））
8. 37 ℃, 5％CO2 避光培养3天。
9. 吸出培养液，24小时内上机检测。
（7AAD排除死细胞）
17. 在FACScalibur流式细胞仪上检测,用Cell Quest软件获取数据,然后用软件分析。
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
正确抓取小鼠并处死
颈椎脱臼处死小鼠：用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉 ，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离
实验步骤：
（一）取小鼠脾脏： 小鼠颈椎脱位处死，置70%乙醇溶
液中浸泡3-5min； 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交
界处皮肤，取脾脏并尽量将去脂肪 及筋膜组织。
（二）制备单个核细胞悬液：
1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液(10ml)的平皿中，然后再 置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指 套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液置于15ml离心管中，再取5mlPBS冲 洗培养皿后移入15ml离心管。以1500rpm离心5min。弃 去上清，轻轻弹散细胞沉淀,加红细胞裂解液ACK至2-3ml ，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加 PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；
上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致 敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。
密度梯度离心法
Ficoll-Hypaque密度梯度离心法：人外周血单个核细 胞(peripheral blood mononuclear cell PBMC)包 括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细 胞不同，利用密度在1.077±0.001g/L之间近于等渗的 Ficoll-Hypaque混合溶液(称为淋巴细胞分层液)作密 度梯度离心时,•各种血液成分将按密度梯度重新分布聚 集。
当脾功能亢进时可破坏大量血小板及血细胞。脾有丰富 的血窦，可储存一定量（约200毫升）的血液，在机体 剧烈运动或爬山或突然失血时，脾的平滑肌收缩，放出 储存血液以补充机体的需要。
胸腺（thymus）
体内CTL方法
体内CTL方法
1．将1 mg CFSE（MW 557.46）溶解于358.77 ul DMSO中，制备成5mM的储存液，分装成20ul/管，置于－20℃保存；
2．取naïve 小鼠脾细胞，以含2％胎牛血清的Hank液将PBMC按2×107细胞/ml重悬，将脾细胞分成2等份，分别用等体积低浓度的CFSE（1.0uM）和高浓度的CFSE（10uM）染色，37℃避光轻摇染色10min；
（注：染色液迅速往细胞内加，使细胞同时染上色）
3．用等体积的胎牛血清终止反应，1000rpm离心5min，弃上清，用含2％胎牛血清的Hank液洗2次，计数；
4．以2×107/ml重悬于含2％胎牛血清的Hank液中，高浓度的CFSE（10uM）染色的细胞进行肽（1-10ug/ml）孵育，低浓度的CFSE（1.0uM）染色的细胞不进行肽孵育，37℃ 5％CO2培养4小时；
5．将细胞转入15ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，洗细胞2－3次；6．将低浓度和高浓度CFSE染色的靶细胞等体积混合，按每只小鼠1×107细胞/100ul由眼底毛细血管注射到实验小鼠体内，进行体内细胞杀伤反应；7．杀伤15小时（或更长时间，根据试验决定）后，处死实验小鼠，避光分离得到脾细胞，筛网过滤后转入FACS专用管中，准备进行仪器检测和分析；8．杀伤率＝【1－（试验组的比率/naïve的比率）】×100，
比率＝percentage CFSE high/percentage CFSE low。
1。
复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数
小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：实验地点：实验人：1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。
外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。
免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。
红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。
是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。
2实验材料：1)健康小鼠2)手术器械（剪刀、镊子）、解剖板3)70%乙醇4)PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）5)0.2%台盼蓝6)细胞计数板、计数器7)离心机8)显微镜3实验方法：3.1取小鼠脾脏●将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。
●用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。
3.2制备单个核细胞悬液●将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。
●吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min，弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min，以破坏红细胞。
然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。
●弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
3.3计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为324×104×10=3.24×107/ml3.4计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16个，计算细胞活力为：324-16/324×100%=95.1%在理论范围之内4实验结果4.1研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。
实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。
小鼠脾细胞分离+CFSE染色步骤
小鼠脾细胞分离+CFSE染色步骤小鼠脾脏淋巴细胞分离与CFSE染色步骤实验材料：小鼠1只、组织剪1把、镊子2把、75%酒精、小鼠固定板、1640培养液（10%FBS，1%双抗）、含0.1%FBS的PBS溶液（无菌）、PBS溶液（无菌）、ACK溶液（无菌）、移液管、枪头、组织研磨棒（无菌）、12孔细胞培养板、15mL离心管、300目尼龙网（无菌），细胞计数板，手术台布。
实验前准备工作：做好上述实验器具的灭菌工作；将手术台布裹在小鼠固定板上，喷75%酒精，组织剪和镊子用75%酒精浸泡后置于生物安全柜中紫外照射30min；实验步骤：1. 取一只6-8周小鼠颈椎脱臼处死后，将其全部浸泡于75%酒精中5min。
2. 取出小鼠将其固定于固定板上，用组织剪和镊子沿小鼠腹白线剪开腹腔，拨开小肠在腹腔左上方紧贴小肠部位取褐红色长条型脾脏，用组织剪剪开筋膜同时不要把脾脏剪破，将取下的脾脏用PBS冲洗两遍，剪去脾脏上连接的结缔组织。
3. 将脾脏转移入组织研磨棒中，向其中加入2mLPBS溶液后研磨三下，尽量不残留较大组织块；再用3ml PBS冲洗研磨棒后，将脾脏研磨液经300目尼龙网过滤至15mL离心管中，再用2ml PBS冲洗研磨器内壁，同样过滤至15mL离心管中，离心500g，5min。
4. 弃上清后，加入2mL 常温ACK，轻微吹打，裂解红细胞1min 后加入等体积（2mL）PBS 终止裂解，轻微吹打细胞混匀后离心500g，5min。
CFSE染色开始：5. 弃上清，用4ml PBS（0.1%FBS）重新混匀细胞，反复吹打为单细胞悬液，再用300目尼龙网过滤。
取10μL细胞液于细胞计数板上计数，并将细胞浓度调至1.0×107/ml。
6. 提前将CFSE按照说明书配成5mM母液并2ul分装储存于-80冰箱备用，其工作浓度为0.5-25μM.7. 分出一部分细胞加入24孔板中，用于做CFSE空白对照8. 2μlCFSE + 6ml浓度1.0×107/ml的细胞，工作浓度约为1.67μM，37℃，10min，避光。
CFSE细胞增殖实验
C F S E细胞增殖实验集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#准备：1.20ml 预冷5%FBS(HI)-PBS2.50ml 预冷MACS buffer3.70um滤网4. RBC lysis5.LS column6.50ml 37度预热PBS7.50ml 37度预热complete culture medium(RPMI 1640 +10% Heat InactivatedFBS+10 mM HEPES+1 mM penicilline streptomycin+ 50 mM 2-mercaptoethanol)（一）CD3抗体包被取96孔板每孔加入100ul 10ug/mlanti-CD3抗体（PBS）密封4度过夜。
（二）淋巴细胞获取1.小鼠的脾脏结摘取于10ml 冷5%FBS-PBS中。
2.于70um滤网研磨滤过，500g 4度 5min离心后弃上清。
3. RBC lysis裂红5 min，10ml 冷5% PBS终止。
4.500g 4度 5min 离心后弃上清，10mlMACS buffer重悬，计数。
留取105个细胞进行FACS。
（三）磁珠分选nave CD8a+ T细胞cell suspension at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.cell pellet in 400 μL of MACS buffer per 108 total cells.100 μL of Naive CD8a+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail per 108 total cells.well and incubate for 5 minutes in the refrigerator (28 °C).5.Add 200 μL of MACS buffer per 108 total cells.6.Add 200 μL of Anti-Biotin MicroBeads per 108total cells. Add 100 μL of CD44 MicroBeads per 108 total cells.7.Mix well and incubate for an additional 10 minutes in the refrigerator (28 °C).8.Wash cells by adding 10ml of MACS buffer per 108 cells and centrifuge at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.9.Resuspend up to 108cells in 500 μL of MACS buffer.10.Place LS column in the magnetic field of a suitable MACS Separator.11. Prepare column by rinsing with 3 mL of MACS buffer.12.Apply cell suspension onto the column. Collect flow-through containingunlabeled cells, representing the enriched naive CD8a+ T cell fraction. 13.Wash column with 3 mL of MACS buffer. Collect unlabeled cells that passthrough, representing the enriched naive CD8a+ T cells, and combine with the flow-through from step 3.14.Determine cell number. 留取105个细胞进行FACS。
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
NK细胞表面标志
人类细胞表面标志主要以 CD16、CD56来 认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴 细胞认定为NK细胞。
流式细胞术(FCM)
流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微 粒（如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光 与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新 技术结合，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4 ）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高 分子聚合体的固相微粒。
以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体 即可制成免疫磁性微珠。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。 基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠
胸腺功能： （1）产生T淋巴细胞 （2）产生和分泌胸腺素和激素类物质
免疫细胞分离方法
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FAC： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯 度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞 对低渗敏感
（二）制备单个核细胞悬液：
1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液(10ml)的平皿中，然后再 置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指 套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液置于15ml离心管中，再取5mlPBS冲 洗培养皿后移入15ml离心管。以1500rpm离心5min。弃 去上清，轻轻弹散细胞沉淀,加红细胞裂解液ACK至2-3ml ，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加 PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；
4 脾脏单个核细胞分离及流式细胞术染色(1)(1)
• 3．急性大失血法：用粗针头一次采取大量心脏血液，可使动物致死。 • 4．吸入麻醉致死法：应用乙醚吸入麻醉的方法处死。大、小鼠在20～30秒
3.清洗：加500ulPBS,吹打混匀后， 5000rpm， 4℃，5min
4.检测：小心用枪去除上清，再加入500ul PBS吹打混匀，置于冰上， 流式细胞仪检测
CD3： T cell CD4+ T cell； CD8+ T cell
补充知识
通常分离细胞是为了下一步实验。有些实验如需要对细 胞作进一步培养，则在分离细胞时一定要严格无菌操作。
在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他 细胞。
计数完毕后请立即清洗细胞计数板！
思考题
1.实验过程中注意问题有哪些？
实验小鼠处死方法
• 1．颈椎脱臼法：是大、小鼠最常用的处死方法。用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱日，造成脊髓 与脑髓断离，动物立即死亡。
实验四
小鼠脾脏单个核细胞分离及 流式细胞术染色
钱国军 邹本坤 2016-03-31
解剖图
小鼠脾脏位于上腹部左后侧， 体积较大，长条形，属于外 周免疫器官。外周血中淋巴 细胞可经再循环驻入脾脏等 外周免疫器官的特定区域， 所以富含各类免疫细胞。
实验原理
细胞计数
3mm
W1
W2
W3
脾细胞提取实验报告
一、实验目的1. 学习掌握脾细胞提取的基本原理和方法。
2. 熟悉无菌操作流程，提高实验操作技能。
3. 了解脾细胞在免疫学研究中的应用。
二、实验原理脾脏是人体重要的免疫器官，其中含有丰富的免疫细胞，如B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞等。
脾细胞提取实验旨在从脾脏中获取这些免疫细胞，为后续的免疫学研究和实验提供材料。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：成年小鼠、胰蛋白酶、Hanks平衡盐溶液（HBSS）、FBS、离心管、吸管、解剖显微镜、手术刀、镊子、剪刀、无菌操作台等。
2. 实验仪器：细胞培养箱、低温离心机、细胞计数仪、显微镜等。
四、实验步骤1. 小鼠麻醉与解剖- 将小鼠置于解剖显微镜下，用麻醉剂将其麻醉。
- 小心切开小鼠腹部皮肤，暴露脾脏。
- 使用手术刀将脾脏从体内取出。
2. 脾细胞制备- 将脾脏置于Hanks平衡盐溶液中，轻轻漂洗去除杂质。
- 使用剪刀将脾脏剪成小块，放入装有胰蛋白酶的离心管中。
- 将离心管置于37℃水浴中消化10-15分钟，期间轻轻摇动。
- 停止消化后，用吸管将消化后的脾细胞悬液转移至新的离心管中。
- 1000g离心5分钟，弃去上清液。
- 加入适量的FBS，重悬细胞，制成脾细胞悬液。
3. 细胞计数与纯度鉴定- 使用细胞计数仪对脾细胞悬液进行计数，计算细胞总数。
- 取少量脾细胞悬液，进行染色（如台盼蓝染色），在显微镜下观察细胞活力和纯度。
4. 细胞培养- 将脾细胞悬液接种于细胞培养瓶中，放入细胞培养箱中培养。
- 定期观察细胞生长情况，记录细胞生长曲线。
五、实验结果1. 脾细胞悬液经离心后，上清液清亮，细胞沉底。
2. 细胞计数仪显示细胞总数为1.5×10^7个。
3. 台盼蓝染色结果显示细胞活力约为90%。
4. 细胞培养过程中，细胞生长良好，呈典型的淋巴细胞形态。
六、实验讨论1. 脾细胞提取实验过程中，无菌操作至关重要，应严格遵循无菌操作规程。
2. 胰蛋白酶消化脾细胞时，消化时间不宜过长，以免损伤细胞。