抗荧光衰减封片剂
HER2基因扩增检测试剂盒说明书
HER2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）说明书【产品名称】通用名称：HER2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）英文名称：Zyto Light SPEC HER2/CEN17 Dual Color Probe Kit【包装规格】货号Z-2020-5：5测试/盒货号Z-2020-20：20测试/盒【预期用途】本试剂盒用于检测经10%中性缓冲福尔马林固定、石蜡包埋的乳腺癌组织切片中HER2基因的扩增状态。
本试剂盒尤其适用于免疫组织化学HER2（ERBB2）蛋白检测结果为不确定的标本的检测。
HER2基因扩增是确定靶向治疗适应症的重要指标，基于本试剂盒未与具体药物联合进行临床评价，临床医生应在本检测结果基础上结合患者病情、药物适应症、治疗反应及其他检测结果对患者的个体化治疗进行综合判断。
【检验原理】荧光原位杂交技术（Fluorescent In Situ Hybridization, FISH）是一种以荧光标记的核酸探针与组织中的特异核酸分子进行杂交的技术，其基本原理是利用荧光标记的核酸探针在变性后根据碱基互补配对原则准确识别待检样本中的靶核酸序列，经退火复性后形成靶DNA与核酸探针杂交体，通过荧光检测系统（荧光显微镜）直接观察和分析染色体或基因的数量或结构的状态。
本试剂盒内HER2/CEN17双色探针液（以下简称为探针）设计序列来源图见图1和图2。
将样本经福尔马林固定、石蜡包埋后制成4±1μm厚度的切片，固定于粘性玻片上。
切片经预处理后，将HER2/CEN 17双色探针液与待测样本DNA变性、杂交。
杂交完成后，通过一系列洗涤缓冲液洗去未结合探针，并用DAPI（4，6-二咪基-2-联苯基吲哚）对样本中的细胞核复染成蓝色。
DAPI是一种蓝色荧光素，为DNA特异性染色剂。
探针杂交信号可通过配置相应滤光片的荧光显微镜进行观察。
在显微镜下观察细胞核内的荧光信号，对HER2基因（绿色荧光染料ZyGreen：激发波503nm，发射波528nm，同FITC）和CEN17着丝粒（橙红色荧光染料ZyOrange：激发波546nm，发射波572nm，同罗丹明）信号进行计数，计算比值（HER2/CEN17），从而判断HER2基因状态。
DAPI-抗荧光淬灭封片剂
DAPI-抗荧光淬灭封片剂
产品编号：F-0045 规格：10ml
产品简介
DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，它能与DNA结合，在紫外光下可观察到蓝色荧光，最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm。
使用范围
本产品为即用型工作液，无须稀释，直接用于FISH、IF、TUNEL等细胞核的荧光染色。
储存条件
-20℃，避光
本产品需要严格避光，可放于铝饭盒中或用锡纸包裹。
本产品为淡黄色粘稠液体，由于其中的抗荧光淬灭成分会吸收光，使用时间长后，液体会慢慢变深，最终为变为深褐色时，请勿使用。
使用方法
FISH
杂交结束，标本经过洗液洗涤、再经梯度酒精脱水、干燥，直接在标本上滴加10～20μl DAPI，加上盖玻片，室温下，大约20分钟后可观察荧光。
IF
孵育二抗结束，PBS洗涤后，直接在标本上滴加10～20μl DAPI，加上盖玻片，避光，室温下，大约20分钟后可观察荧光。
注意：
本产品含有甘油、抗荧光淬灭剂，也具备封片作用，在细胞核染色后，无须清洗，可减缓荧光淬灭，在严格避光情况下，4℃保存一周，荧光仍不会淬灭。
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广州市外显子生物技术有限公司
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免疫荧光技术试验流程
免疫荧光技术试验流程免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。
它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
以荧光抗体方法较常用。
用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。
免疫细胞荧光试验流程：1、细胞爬片制备1）、将盖玻片放入培养瓶或多孔板中2）、细胞生长实现60％后取出盖玻片3）、用PBS清洗盖玻片3次4）、将盖玻片（细胞面朝上）浸入冷丙酮或4％多聚甲醛或中性福尔马林中10至20分钟（盖上盖子以防止蒸发）5）、用PBS清洗盖玻片3次6）、将盖玻片放在滤纸上（细胞朝上）7）、干燥8—10小时，放入—20°C保管8）、试验前解冻爬片，在室温下用中性PBS浸泡10—15分钟注意：使用多聚甲醛和福尔马林固定可能会导致绿色光谱中的自发荧光。
在这种情况下，可以试验红色或红外的荧光素。
2、破膜1）、0.1％Triton孵育10min2）、PBS洗涤3次，每次3分钟3、抗原修复1）、用滤纸擦干细胞爬片2）、在爬片上加入如胰蛋白酶或其它酶抗原修复液3）、在室温下孵育10分钟4）、用PBS洗涤3次，每次10分钟4、封闭1）、在爬片上加入5％BSA封闭液（种属与二抗来源相同）2）、37°C孵育30分钟3）、甩掉多余的液体并用滤纸擦干（不需要洗涤）5、一抗孵育1）、用抗体稀释液稀释一抗，实现抗体制造商介绍的浓度2）、将稀释的抗体（介绍浓度：0.4μg至2μg）加到爬片上，4°C孵育过夜3）、用PBS洗涤3次，每次15分钟6、二抗孵育1）、用抗体稀释液稀释生物素化的二抗2）、将稀释的抗体加到爬片上，37°C孵育30分钟3）、用PBS洗涤3次，每次8分钟7、染色1）、爬片上滴加稀释好的SABC—FITC或SABC—Cy3试剂2）、37°C孵育30分钟（避光）3）、用PBS洗涤2次4）、滴加DAPI染液，避光孵育10min5）、用PBS洗涤3次6）、用抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜下察看结果。
免疫组化,免疫检测
免疫组化,免疫检测北京华越洋生物-----------------------------------------------DMDC玻片硅化剂(2%) 100ml 免疫组化40% 室温,6个月玻片的硅化,包括盖玻片和载玻片主要由二甲二氯硅烷(DMDC)组成。
玻片硅化试剂盒(APES法) 3×100ml 免疫组化40% 4℃,6个月玻片的硅化,包括盖玻片和载玻片主要由APES、洗涤液、DEPC水组成。
玻片硅化试剂盒(APES法) 3×500ml 免疫组化40% 4℃,6个月玻片的硅化,包括盖玻片和载玻片主要由APES、洗涤液、DEPC水组成。
PBS-Triton去污剂100ml 免疫组化40% 室温,12个月去污主要由PBS、Triton-100组成。
Sorensen磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH5.3-8.04)500ml 免疫组化40% 4℃,6个月组织化学常用缓冲液主要由磷酸二氢盐(钠/钾)和磷酸氢二盐(钠/钾)溶液组成,按不同比例混合后获得对用PH值。
pH值可选5.3，5.6，5.91，6.24，6.47，6.64，6.81，6.98，7.17，7.73，8.04。
Sorensen磷酸缓冲液(1×,pH6.2) 500ml 免疫组化40% 4℃,6个月少量细胞趋化实验主要由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化镁、氯化钙组成,终浓度17mM。
Sorensen磷酸缓冲液(10×,pH6.2) 500ml 免疫组化40% 4℃,6个月少量细胞趋化实验主要由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化镁、氯化钙组成,终浓度170mM。
TBS缓冲液(0.02mol/L,pH8.2) 500ml 免疫组化40% 室温,6个月免疫金银染色缓冲液主要由Tris、氯化钠组成。
TBS缓冲液(0.05mol/L,pH7.4) 500ml 免疫组化40% 室温,6个月免疫金银染色缓冲液主要由Tris、氯化钠、叠氮钠、BSA组成。
成纤维细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光【原理】免疫细胞化学，是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。
免疫细胞化学有多种染色方式，免疫荧光法即为其中一种染色方式，其结合激光共聚焦扫描显微镜拍照技术，可提高检测分辨率，更精确地检测抗原的细胞定位和分布。
【材料】1、仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、酒精灯、正置荧光显微镜、高压灭菌锅；2、试剂：DMEM培养基、胎牛血清、乙醇、PBS、0.25%胰酶、4%多聚甲醛、SMN一抗、FITC荧光二抗、抗荧光衰减封片剂、TritonX-100；3、细胞株：成纤维细胞系。
【步骤】一、准备工作1、切片处理：将盖玻片置于浓酸浸泡过夜，自来水冲泡20遍，蒸馏水清洗5遍，高压灭菌，烘干备用；2、细胞悬液制备：胰酶消化的成纤维细胞，收集细胞沉淀，培养基重悬，制成单细胞悬液，计数后稀释至最佳浓度备用。
二、细胞爬片1、6孔板中央滴加100ul培养基，每孔放入一张盖玻片，恰好覆盖孔内培养基；2、每孔缓慢逐滴加入2ml稀释后的细胞悬液，轻柔混匀；3、将6孔板置于CO2孵箱，培养过夜。
三、免疫荧光1、取出6孔板，弃掉孔内培养基，PBS轻柔清洗3次，每次3min；2、每孔加入1ml预冷的4%多聚甲醛，4℃固定20min；3、PBS轻柔清洗3次，每次3min；4、每孔加入1ml含0.2%TritonX-100的PBS，冰上静置10min；5、PBS轻柔清洗3次，每次3min；6、每孔加入1ml含1%BSA的PBS，室温封闭1h；7、将一抗以1:100的比例稀释后，取出50ul滴加在封口膜上，从培养孔中取出盖玻片，用吸水纸吸去背面及细胞面边缘处的液体后，轻轻放在封口膜上，细胞面与抗体均匀接触，4℃孵育过夜；8、取下盖玻片，置于6孔板相应孔中，PBS轻柔清洗3次，每次3min；9、滴加荧光素二抗，37℃孵育30min；10、PBS轻柔清洗3次，每次3min；11、每孔加入500ul DAPI染色液，室温染色5min；12、PBS轻柔清洗3次，每次3min；13、取一张洁净载玻片，中心位置滴加50ul抗荧光淬灭封片剂，从6孔板中取出盖玻片，控干液体，贴有细胞的一面朝下，放置在封片液上，尽量避免气泡；14、显微镜下观察、拍照。
防止细胞荧光淬灭的方法
防止细胞荧光淬灭的方法
选择合适的荧光染料和荧光蛋白：使用与荧光显微镜的激发波长和发射波长相匹配的荧光染料和荧光蛋白进行细胞成像。
降低激发光的强度：尽可能降低激发光的强度，减少曝光时间。
避免长时间暴露：避免长时间将样品暴露在“无用”的光照条件下，例如在没有收集数据时在镜下长时间观察。
使用抗荧光淬灭封片剂：为尽量减少实验样品的光漂白，可以使用抗荧光淬灭封片剂，以提高活细胞和固定细胞样品中荧光染料的光稳定性。
使用荧光淬灭剂：荧光淬灭剂中的离子可通过碰撞方式，捕获自发荧光光源分子发出的电子，阻止该电子从激发态回归基态和能量释放，从而淬灭自发荧光。
使用Evan’s蓝或者台盼蓝：可以采用0.001%或至0.1%浓度的Evan’s蓝或者台盼蓝染色，这种物质会均匀分布到组织或者细胞上，它能够结合不必要的固有荧光物质或背景性荧光物质，显著减少自发荧光。
抗荧光衰减封片剂(含DAPI)说明书
抗荧光衰减封片剂（含DAPI）说明书货号：S2110规格：5ml/25ml保存：-20℃保存，一年有效。
产品简介：抗荧光衰减封片剂是一种用于减缓荧光衰减的封片试剂。
以甘油为基础，加入抗荧光衰减剂，有强烈的抗荧光衰减作用，用于对荧光组织和细胞样品的封片。
封片后，样品4℃或者-20℃避光可保存2-3周。
本试剂操作简单，在封片时用移液枪滴一滴抗荧光衰减封片液，盖上盖玻片就可以了。
抗荧光衰减封片剂内含DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用与荧光显微镜观测。
因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色，显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞。
DAPI和双链DNA结合后，最大激发波长为360nm，最大发射波长为460nm。
使用说明：使用前平衡至室温。
1.贴壁细胞样品：A.染色完毕后，吸尽液体。
B.滴一滴(20-50ul)抗荧光衰减封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。
C.随后即可通过荧光显微镜观察样品。
2.组织切片：A.染色完毕后，吸尽液体。
B.滴一滴(20-50ul)抗荧光衰减封片液于组织切片上，盖上盖玻片，让切片接触封片液，尽量避免气泡。
C.随后即可通过荧光显微镜观察样品。
3.其它样品：其它样品参考细胞样品或组织切片进行操作。
注意事项：1.荧光物质均易发生衰减，染色后的样品宜避光保存。
2.在使用抗衰减封片液的情况下可以减缓衰减，但仍宜尽量避光和尽早拍照。
3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
抗荧光淬灭封片剂配方
抗荧光淬灭封片剂配方一、简介抗荧光淬灭封片剂是一种用于荧光显微镜下观察细胞的试剂。
在荧光显微镜下，由于荧光分子的不可逆性猝灭作用，会导致样品中的荧光信号逐渐减弱或消失，影响观察效果。
抗荧光淬灭封片剂可以有效地减轻这种猝灭作用，提高样品中荧光信号的稳定性和持久性。
二、配方1. PVA（聚乙烯醇）：PVA是本试剂的主要成分之一，在封片剂中起到增稠、降低表面张力、防止气泡生成等作用。
常见的PVA型号有17-88和10-98两种，前者的粘度较低，后者较高。
2. Glycerol（甘油）：甘油是一种具有保湿性质的化合物，在本试剂中起到保持细胞膜完整性、减少蒸发和挥发等作用。
3. DABCO（1,4-二氨基环己烷）：DABCO是一种具有活性氮原子的化合物，在本试剂中起到抗荧光淬灭的作用。
它可以与氧气、水和其他有机分子形成复合物，从而减少荧光分子的不可逆性猝灭作用。
4. PBS（磷酸盐缓冲液）：PBS是一种缓冲液，可以调节试剂的pH 值，使其适合于细胞生长和显微镜观察。
5. DAPI（4',6-二氨基-2-苯基吡啶）：DAPI是一种DNA染料，在本试剂中起到标记细胞核的作用。
它可以与DNA结合，发出蓝色荧光。
6. Mounting medium（封片剂）：封片剂是一种用于固定细胞和显微镜观察的介质。
常见的封片剂有DABCO、Vectashield等。
三、制备方法1. 加入PVA：将适量的PVA加入PBS中，并在50℃下搅拌至完全溶解。
2. 加入甘油：将适量的甘油加入PVA溶液中，并搅拌至均匀混合。
3. 加入DABCO：将适量的DABCO加入甘油-PVA溶液中，并搅拌至均匀混合。
4. 加入DAPI：将适量的DAPI加入甘油-PVA-DABCO溶液中，并搅拌至均匀混合。
5. 制备封片：将制备好的样品滴在载玻片上，加入适量的封片剂，然后用盖玻片覆盖。
最后用胶水固定盖玻片。
四、注意事项1. 避免过度搅拌：过度搅拌会使PVA分子链断裂，导致溶液黏度降低。
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抗荧光衰减封片剂
Antifade Solution
货号：P070011
描述：在进行荧光显微镜观察时，用于对荧光组织和细胞样品的封片。
抗荧光衰减封片剂以高纯度甘油为介质，内含抗荧光淬灭剂，有强烈的抗荧光衰减作用。
样品封片后4℃或－20℃避光保存2-3周，可最大限度延长荧光持续时间和维持荧光发光强度，同时封片剂中的其它成分有助于保持组织抗原抗体处于结合状态。
适用于所有光谱范围的荧光如FITC，Cy2, Cy3, Rhodamine, Texas Red, Cy5, Cy7，DAPI, AMCA, R6G, Hoechst 33258 and 33342。
包装与保存：5 ml或10 ml包装，每一24 x 24 mm盖玻片用约20-40µl。
自然温度运输，收到后－20℃避光保存至少1年。
4℃保存3月。
适用：对所有光谱范围的荧光均有抗衰减作用，如FITC，Cy2, Cy3, Rhodamine, Texas Red, Cy5, Cy7，DAPI, AMCA, R6G, Hoechst 33258 and 33342。
适用于：1. 组织细胞免疫荧光组织化学染色样品封片；2. 染色体荧光观察封片；3. 核酸荧光原位杂交样品封片。
使用方法
1.吸去载玻片上的液体，略微晾干残留液体。
2.取20-40µl封片剂滴加在载玻片样品处。
也可直接加到细胞培养孔内观察。
3.盖上盖玻片。
盖玻片规格为24 x 24 mm或24 x 60 mm大小。
4.轻轻压盖玻片，用滤纸小心吸除盖玻片周围多余液体，室温放置数分钟。
5.直接进行荧光显微镜观察。
片子4℃或－20℃避光保存2周荧光无明显衰减。
6.如需永久封片可用市售指甲油封固盖玻片周围，但通常这样做并无必要。
注意事项
1.封片溶液成分无特殊毒性。
2.如盖玻片脱落或错位，可将玻片放入PBS中取出盖玻片，重新用封片剂封片。
3.也可将适量抗荧光衰减封片剂直接加到细胞培养孔内，进行荧光观察。