蛋白纯化原则和技术介绍
蛋白质分离纯化的注意事项
蛋白质分离纯化的注意事项蛋白质分离纯化是生物学和生物化学研究中常用的一个步骤，它用于将混合的蛋白质溶液中的目标蛋白质分离出来并去除杂质。
蛋白质分离纯化的注意事项有很多，下面将详细介绍。
1. 样品的制备：蛋白质的分离纯化前，首先需要对样品进行合适的制备。
采集样品时要避免污染、破坏或降解蛋白质。
样品的pH、温度和离心速度等因素对蛋白质的稳定性有重要影响，因此需要根据实验需要进行适当的处理。
2. 分离纯化方法的选择：根据不同的蛋白质性质和研究目的，选择合适的分离纯化方法。
常用的方法包括离心法、沉淀法、过滤法、电泳法、层析法等。
在选择方法时要考虑到分离纯化的效果、时间、成本、操作难度等因素。
3. 分离纯化条件的优化：在选择分离纯化方法后，需要对实验条件进行优化。
例如，选择合适的缓冲液和pH，优化温度和离心速度，调整柱层析的流速和梯度，以及优化电泳条件等。
优化条件可以提高蛋白质的分离纯化效果。
4. 对蛋白质的保存和稳定性需小心处理：蛋白质容易受到温度、pH、氧化和降解等因素的影响而失活。
因此，在整个分离纯化的过程中，要注意进行低温处理，避免酶的降解和氧化反应的发生。
此外，还可以使用蛋白质稳定剂，如甘油、蔗糖或明胶等，来延长蛋白质的保存时间。
5. 删除杂质的步骤：蛋白质分离纯化的一个重要目标是去除杂质。
去除杂质的方法包括胶体沉淀、盐析、有机溶剂沉淀、离心沉淀等。
选择适当的去除杂质的方法，能够提高分离纯化的纯度。
6. 纯化后的保存：在完成蛋白质的分离纯化后，必须妥善保存纯化蛋白质。
纯化蛋白质容易受到冻融循环、氧化和结构变化等因素的影响，因此需要在低温下保存，并加入适当的保护剂以避免降解。
7. 纯度和活性的鉴定：对于蛋白质分离纯化后的样品，需要进行纯度和活性的鉴定。
常用的鉴定方法包括SDS-PAGE凝胶电泳、Western blotting、质谱分析、酶活分析等。
这些鉴定方法能够确定纯化蛋白质的纯度和活性，从而确定分离纯化的效果是否达到预期目标。
蛋白质纯化知识详解
蛋白质纯化知识详解一、蛋白纯化原则蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。
每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。
蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。
一般蛋白纯化采用的方法为树脂法。
粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速、颗粒大、粒径分布宽，并可以迅速将蛋白与污染物分开，必要时可加入相应的保护剂（例如蛋白酶抑制剂），防止目的蛋白被降解。
精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些分子量大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。
选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。
仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。
二、纯化程序分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步。
1、前处理分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。
为此，动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免受单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。
然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。
动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。
植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。
细菌细胞的破碎比较麻烦，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。
蛋白质分离和纯化的方法和技术
蛋白质分离和纯化的方法和技术蛋白质是生命体中极其重要的一种物质，它是细胞的基本组成单位，参与了多种生物学过程。
研究蛋白质在细胞中的功能与结构，需要对蛋白质进行高效、可靠的分离和纯化。
本文将介绍常用的蛋白质分离和纯化的方法和技术。
一、离子交换层析离子交换层析是分离蛋白质最常用、最成熟的方法之一。
其原理是利用蛋白质的电荷性质与离子交换树脂的对应性质，进行蛋白质的分离。
离子交换树脂可分为正离子交换树脂和负离子交换树脂两种类型。
正离子交换树脂的功能基团有负电荷，故可吸附具有正电荷的物质，例如氨基酸、多肽或蛋白质N端等；负离子交换树脂的功能基团有正电荷，故可吸附具有负电荷的物质，例如天冬氨酸、谷氨酸、磷酸基或蛋白质C端等。
根据目标蛋白质的电荷性质，选择合适的离子交换树脂进行分离。
离子交换层析速度较快，可分离多种电荷性质的蛋白质，但对样品的盐浓度要求较高，易受pH和盐浓度的影响，操作时需谨慎。
二、凝胶过滤层析凝胶过滤层析是利用孔径大小对蛋白质进行分离的方法。
凝胶过滤层析常用的凝胶有玻璃纤维、纤维素等。
玻璃纤维凝胶一般有不同的颗粒大小，大的颗粒孔径大，小的颗粒孔径小。
蛋白质分子较小，可通过大孔径的颗粒进入凝胶孔隙，而较大的物质被挡在颗粒外部无法穿过凝胶。
因此，蛋白质经过凝胶时易出现分子量排阻效应，使得小分子在大分子之前流出，从而实现了蛋白质的分离。
凝胶过滤层析操作简单，无需特殊设备或条件，但分离程度相对较低，不适宜纯化目标蛋白质。
三、亲和层析亲和层析是利用蛋白质与亲和柱中特定配体发生特异性结合，从而对蛋白质进行分离的方法。
亲和层析适用于具有特定结构、功能或序列的蛋白质，例如抗体、标签化蛋白、细胞受体等。
常见的亲和柱配体有融合蛋白、金属离子、细胞色素C等。
蛋白质样品在亲和柱上进行结合，待不结合蛋白质被洗脱后对结合蛋白质进行洗脱。
亲和层析具有选择性强、纯化程度高等优点，但亲和柱的制备成本较高，操作上也需注意其特异性。
简述选择蛋白质纯化方法的基本原则
简述选择蛋白质纯化方法的基本原则一、蛋白质纯化的基本原则大家都知道，蛋白质是细胞的“工人”，负责完成各种重要的生理任务，但它们也像一群小孩子，在大千世界里四处乱跑。
我们要从细胞中把它们一一“捞”出来，放到一个舒适的环境里，好好研究它们的“工作能力”。
但怎么抓住它们呢？这就得靠蛋白质纯化技术啦。
说白了，蛋白质纯化就是把目标蛋白从一堆杂乱的物质中“挑出来”，这种操作听起来有点像在一大堆杂乱无章的衣服里找你最爱的那件T恤，要讲究技巧才能不“踩雷”。
1.选择性：咱们得有个明确的目标。
纯化蛋白质可不是瞎胡闹，必须知道你要的是哪一只“鱼”。
就像你去市场挑水果，肯定是先看清楚你想买的是苹果还是橙子。
不同的蛋白质有不同的特性，比如大小、形状、电荷等等。
你得知道这些特性，才能选择合适的纯化方法。
你不能拿着一个过大的网去捞小鱼啊，这样肯定白费劲。
2.避免损坏蛋白质：要小心，蛋白质这玩意儿很娇贵！它们就像一位脆弱的小公主，稍微用力一捏，可能就会变形、失去功能。
所以纯化过程中，温度和pH值都得控制得恰到好处。
就像你不能把冰淇淋放在烈日下暴晒，那蛋白质也不能在高温或者强酸强碱的环境中待太久，要给它们营造一个舒适的“生活环境”。
3.高效性：纯化蛋白质可不是什么轻松的活儿，很多时候你需要用一招制敌，一招进击！纯化方法不仅要有效，还得迅速。
你不可能让蛋白质在某个环节等上几天，真搞不好，那你就等于错过了收成的时机。
好比你去钓鱼，不可能一直等着鱼儿上钩，等到鱼都跑光了，你再去翻水也没用了。
所以要用最合适的方法，迅速“捕捉”蛋白质。
二、常用的蛋白质纯化方法既然知道了基本原则，那接下来就来说说具体的纯化方法了。
其实呢，蛋白质纯化方法就像做菜一样，种类繁多，关键是看你要做什么菜，选对调料和火候才是王道。
最常见的几种方法，就是靠它们将蛋白质从混合物中“挑出来”。
1.离心法：你想想吧，就像是洗衣服，细小的杂质会被甩出去，而目标蛋白质则沉到底部。
常用的蛋白质纯化方法和原理
常用的蛋白质纯化方法和原理蛋白质的纯化是生物化学研究中非常重要的一步，纯化蛋白质可以用于结构解析、功能研究、动态过程研究等各种生物学实验。
常用的蛋白质纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换色谱法、亲和色谱法、逆渗透法和层析法等。
下面将对这些方法的原理和步骤进行详细阐述。
1. 盐析法盐析法是根据蛋白质在溶液中的溶解性随盐浓度的变化而变化的原理进行蛋白质的纯化。
该方法是利用蛋白质在高盐浓度下与水结合能力降低，使其从溶液中沉淀出来。
应用盐析法时，需要先调节溶液的盐浓度使蛋白质溶解，然后逐渐加入盐使其过饱和，蛋白质便会析出。
最后通过离心将蛋白质的沉淀物分离，得到纯化的蛋白质。
2. 凝胶过滤法凝胶过滤法是利用凝胶的pores 来分离蛋白质的一种方法。
凝胶通常是聚丙烯酰胺（也称作Polyacrylamide）或琼脂糖。
研究者将蛋白质样品加入到过滤膜上，较小的蛋白质能够通过pores，较大的分子则被排出。
通过选择不同大小的凝胶孔径，可以根据蛋白质的大小来选择合适数目的过滤膜。
凝胶过滤法需要进行缓冲液体积的连续换流，将蛋白质与其他杂质分离开来。
3. 离子交换色谱法离子交换色谱法是利用蛋白质与离子交换基质之间静电吸引力的不同而分离的方法。
离子交换基质通常是富含正离子或负离子的高分子材料。
在离子交换色谱法中，样品溶液在特定的pH 下流经离子交换基质，带有不同电荷的蛋白质能够与基质发生反应，吸附在基质上。
为了获得纯化蛋白质，需要通过梯度洗脱，逐渐改变缓冲液pH 或离子浓度，使吸附在离子交换基质上的蛋白质逐渐释放出来。
4. 亲和色谱法亲和色谱法是利用蛋白质与特定的配体相互作用特异性进行分离的方法。
配体可以是天然物质，如金属离子、辅酶或抗体，也可以是人工合成的结构。
在亲和色谱法中，样品溶液经过含有配体的固定相，与配体发生特异性相互作用，蛋白质与其它组分分离。
然后可以通过改变某些条件（如pH、温度或离子浓度）来洗脱纯化的蛋白质。
蛋白质的纯化的方法及原理
蛋白质的纯化的方法及原理蛋白质的纯化是从其来源中去除其他有机物和无机物，使其成为纯净的蛋白质样品的过程。
蛋白质纯化的方法可以根据需要选择，其中常用的方法包括盐析、凝胶过滤、电泳、金属柱层析、亲和层析、离子交换层析、逆相高效液相色谱等。
下面将详细介绍这些方法及其原理。
一、盐析盐析是利用不同浓度的盐溶液对蛋白质溶液进行逐渐稀释，从而使蛋白质发生沉淀的过程。
纯化蛋白质的关键是利用蛋白质与溶剂中离子之间的相互作用来控制蛋白质的溶解和沉淀过程。
在盐析中，通过选择离子强度和种类可以调整蛋白质溶液中所需溶剂化离子的浓度，达到沉淀和纯化蛋白质的目的。
二、凝胶过滤凝胶过滤是一种分子筛分离方法，利用不同孔径的凝胶进行分离。
凝胶的孔径能够排除较大分子，如核酸和细胞碎片，而较小分子，如蛋白质则能通过孔隙，实现纯化。
该方法简单易行，不需要任何特殊设备，适用于中小分子量的蛋白质纯化。
三、电泳电泳是利用蛋白质在电场中的移动性差异进行分离和纯化的方法。
常用的电泳方法有平板电泳、SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）和Western blotting （免疫印迹法）等。
电泳能够根据蛋白质的电荷、分子大小和不同的电场力，在凝胶中分离蛋白质，使其形成带状。
通过切割所需蛋白质的带状区域，可以实现对目标蛋白质的纯化。
四、金属柱层析金属柱层析是利用金属离子与蛋白质之间的亲和性进行分离的方法。
金属柱通常被配制成金属离子亲和基质，并固定在柱子上。
目标蛋白质通过与金属离子发生亲和作用而被保留在柱中，其他杂质则从柱中流出。
通过调节洗脱缓冲液的离子浓度和pH值，可实现对目标蛋白质的纯化。
五、亲和层析亲和层析是利用配体与其特异性结合的蛋白质进行分离和纯化的方法。
通常将配体固定在柱子上，待蛋白质样品通过柱子时，目标蛋白质与配体结合，其他杂质则流失。
通过改变洗脱缓冲液的条件，如离子浓度、pH值和络合剂的添加，可以实现目标蛋白质的纯化。
六、离子交换层析离子交换层析是一种利用蛋白质与离子交换基质之间的相互作用进行分离和纯化的方法。
蛋白纯化相关原理及方法
蛋白纯化相关原理及方法蛋白纯化是一种分离和提纯蛋白质的方法，可以用于研究蛋白质的结构和功能，以及生产纯净的蛋白质制剂。
蛋白纯化的原理是根据蛋白质的特性，利用不同的物理、化学或生物学方法将目标蛋白质与其他成分分离开来。
本文将介绍蛋白纯化的常用方法和原理。
蛋白纯化的方法多种多样，常用的包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、逆流电泳、凝胶电泳等。
离子交换层析是一种基于蛋白质与离子交换树脂之间相互作用的方法。
树脂通常具有正或负电荷，当蛋白质溶液通过含有相反电荷的树脂时，蛋白质会与树脂发生静电相互作用，从而实现分离纯化。
凝胶过滤层析是一种基于蛋白质的分子大小差异的方法。
通过选择合适的孔径大小的凝胶过滤材料，可以将大分子蛋白质从小分子物质分离出来。
亲和层析是一种基于蛋白质与亲和基质之间特异相互作用的方法。
亲和基质可以是特定的抗体、金属离子、亲和标签等，与目标蛋白质发生高度特异性结合，从而实现其分离纯化。
逆流电泳是利用电场驱动蛋白质从一端向另一端移动的方法，根据蛋白质的电荷大小和形状来分离纯化。
凝胶电泳是一种基于蛋白质的电荷和分子大小差异的方法。
通过在凝胶中施加电场，蛋白质会被分离成多个带电荷的条带，从而实现分离纯化。
蛋白纯化的原理是根据蛋白质的特性选择合适的纯化方法。
蛋白质的特性包括分子大小、电荷、结构、亲和性等。
根据这些特性，可以选择合适的纯化方法进行分离纯化。
例如，对于大分子蛋白质，可以选择凝胶过滤层析；对于带有特定标签的蛋白质，可以选择亲和层析；对于具有特定电荷的蛋白质，可以选择离子交换层析。
此外，还可以根据蛋白质的稳定性、溶解度、含量等因素进行选择。
蛋白纯化的过程通常包括样品制备、纯化步骤和纯化评价。
样品制备是指将待纯化的蛋白质从生物样品中提取出来，并进行初步的处理，如细胞破碎、去除杂质等。
纯化步骤是指根据不同的纯化方法，对样品进行多次处理和分离，逐步提高目标蛋白质的纯度。
每一步骤都需要进行适当的优化和调节，以达到最佳的纯化效果。
蛋白纯化相关原理及方法
蛋白纯化相关原理及方法蛋白纯化是生物科学研究中常用的一项技术，它可以分离纯化出目标蛋白质，从而方便后续的研究和应用。
本文将介绍蛋白纯化的原理和方法。
一、蛋白纯化的原理蛋白纯化的原理是基于不同蛋白质的特性差异，通过采用不同的分离技术，将目标蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且使其达到纯度较高的状态。
蛋白质的特性差异主要包括以下几个方面：1. 分子质量：蛋白质的分子质量不同，可以通过分子大小的差异进行分离。
常用的方法包括凝胶过滤层析和超速离心。
2. 电荷性质：蛋白质具有不同的电荷性质，可以通过离子交换层析、电泳等方法进行分离。
离子交换层析是利用蛋白质与固定在固相上的离子交换基团之间的相互作用进行分离。
3. 亲和性：蛋白质与其他分子之间可能存在特异的结合，可以通过亲和层析进行分离。
亲和层析是利用蛋白质与特定配体之间的结合进行分离。
4. 疏水性：蛋白质的疏水性不同，可以通过逆向相层析等方法进行分离。
逆向相层析是利用溶剂的极性进行分离，疏水性较高的蛋白质会更早洗脱。
二、蛋白纯化的方法1. 直接纯化法：直接从生物样品中纯化目标蛋白质，可以通过分离离心、沉淀和过滤等简单的操作步骤进行。
这种方法适用于目标蛋白质含量较高的样品。
2. 柱层析法：柱层析是一种常用的蛋白纯化方法，可以根据目标蛋白质的特性选择不同的层析柱进行分离。
常用的柱层析方法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。
3. 电泳法：电泳是利用蛋白质的电荷性质进行分离的方法，常用的电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和等电聚焦电泳（IEF）等。
4. 超滤法：超滤是利用膜的孔径大小对蛋白质进行分离的方法，常用的超滤方法包括凝胶过滤和离心浓缩等。
5. 亲和纯化法：亲和纯化是利用蛋白质与特定配体之间的结合进行分离的方法，常用的亲和纯化方法包括亲和层析、亲和吸附、亲和沉淀等。
6. 水相两相法：水相两相法是利用两相体系的差异进行蛋白质的分离，常用的方法包括聚乙二醇硫酸铵法和聚乙二醇聚丙烯酰胺法等。
蛋白纯化方法
蛋白纯化方法蛋白质是生物体内重要的功能分子，对于研究蛋白质的结构和功能具有重要意义。
蛋白纯化是从混合物中分离出目标蛋白质并去除杂质的过程，是蛋白质研究中不可或缺的步骤。
本文将介绍常见的蛋白纯化方法，帮助读者了解蛋白纯化的原理和操作步骤。
1. 溶液制备。
在进行蛋白纯化之前，首先需要准备好合适的溶液。
常用的溶液包括缓冲液、洗脱液、吸附液等。
缓冲液用于维持溶液的pH值，洗脱液用于洗脱目标蛋白质，吸附液用于吸附目标蛋白质。
在制备溶液时，需要注意溶液的配制浓度、pH值以及消毒方式，确保溶液的质量符合实验要求。
2. 亲和层析。
亲和层析是一种常用的蛋白纯化方法，利用靶蛋白与特定配体之间的特异性相互作用来实现目标蛋白的分离纯化。
常见的亲和层析包括金属螯合层析、免疫亲和层析等。
在进行亲和层析时，需要选择合适的配体，并对层析柱进行填充和平衡，然后将样品加入层析柱进行分离。
3. 凝胶过滤层析。
凝胶过滤层析是一种根据蛋白质大小分离的方法，利用凝胶的孔隙大小来实现不同大小蛋白质的分离。
在进行凝胶过滤层析时，需要选择合适的凝胶柱和流动相，并进行层析柱的平衡和样品的加载，然后根据蛋白质的大小进行分离纯化。
4. 离子交换层析。
离子交换层析是根据蛋白质的电荷性质进行分离的方法，利用离子交换树脂与蛋白质之间的静电作用来实现分离纯化。
在进行离子交换层析时，需要选择合适的离子交换树脂和流动相，并进行层析柱的平衡和样品的加载，然后根据蛋白质的电荷性质进行分离纯化。
5. 透析。
透析是一种常用的蛋白质浓缩和去除盐类等小分子杂质的方法，利用半透膜对溶液中的小分子进行分离。
在进行透析时，需要选择合适的透析袋和透析缓冲液，并进行透析过程的控制和监测，确保目标蛋白质的浓缩和纯化。
6. 结晶。
结晶是一种常用的蛋白质纯化方法，利用蛋白质在溶液中的饱和度来实现蛋白质的分离纯化。
在进行结晶时，需要选择合适的结晶条件和结晶试剂，并进行结晶过程的控制和监测，最终得到纯净的蛋白质结晶体。
蛋白质分离纯化的一般原则
蛋白质分离纯化的一般原则蛋白质是生物体内重要的功能分子，它们在细胞的结构和功能中扮演着重要角色。
蛋白质的纯化和分离是研究蛋白质结构和功能的基础。
本文将介绍蛋白质分离纯化的一般原则和方法。
蛋白质分离纯化的一般原则是根据蛋白质的物理化学性质进行选择性分离。
蛋白质具有不同的分子量、电荷、溶解性、亲疏水性等特性，可以通过这些特性来实现蛋白质的分离纯化。
蛋白质分离纯化的第一步是提取蛋白质。
提取蛋白质的方法有多种，常见的包括机械破碎、超声波破碎、溶剂提取等。
提取蛋白质的目的是将其从细胞或组织中释放出来，为后续的分离纯化步骤做准备。
蛋白质的分离纯化可以通过多种方法来实现。
其中最常用的方法是色谱技术。
色谱技术基于蛋白质的物理化学性质，将混合溶液中的蛋白质分离开来。
常见的色谱技术包括凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和色谱、逆相色谱等。
凝胶过滤色谱是一种基于蛋白质分子量的分离方法。
其原理是通过孔径大小选择性地分离不同分子量的蛋白质。
凝胶过滤色谱常用于蛋白质的初步分离和浓缩。
离子交换色谱是一种基于蛋白质电荷的分离方法。
其原理是通过蛋白质与离子交换基质之间的相互作用来实现分离。
离子交换色谱可以根据蛋白质的电荷性质选择性地分离不同电荷的蛋白质。
亲和色谱是一种基于蛋白质与亲和基质之间的特异性相互作用来实现分离的方法。
亲和色谱可以利用蛋白质与亲和基质之间的特异性结合，选择性地分离目标蛋白质。
逆相色谱是一种基于蛋白质亲疏水性的分离方法。
其原理是利用蛋白质与逆相基质之间的亲疏水作用来实现分离。
逆相色谱可以根据蛋白质的亲疏水性选择性地分离不同性质的蛋白质。
还有一些其他的蛋白质分离纯化方法，如电泳、超高速离心、超滤等。
这些方法在特定的实验条件下可以实现蛋白质的分离纯化。
蛋白质分离纯化的一般原则是根据蛋白质的物理化学性质进行选择性分离。
通过选择合适的分离纯化方法，可以有效地分离出目标蛋白质，并去除其他杂质。
蛋白质的纯化程度越高，其质量和活性也就越好，对于后续的研究和应用具有重要意义。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蛋白纯化原则和技术概览
无论是蛋白研究还是应用，通常需要将蛋白利用不同的生物系统表达出来，然后进行分离和纯化。
研究实验室通常需要纯化微克或毫克级别的蛋白质，而工业上需要纯化数千克甚至数吨的蛋白质。
因此，蛋白纯化非常重要。
纯化过程中，主要需要考虑宿主污染、样品的可溶性、蛋白结构的完整性和生物活性。
蛋白的纯化可大致分为样品捕获、中度纯化阶段和精细纯化阶段3个阶段。
✓样品捕获：分离、浓缩和稳定化处理；
✓中度纯化：去除核酸等其他细胞成分，可使用硫酸铵沉淀法；
✓精细纯化：将靶蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来，常用方法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。
蛋白纯化指导原则
1. 明确目标，避免过度纯化或者纯化不够；
表1. 对蛋白样本纯度要求的例子。
2、明确样本特性和主要的杂质，选择合适的纯化方法；
可以通过检测蛋白稳定性窗口（如pH值、离子强度）和蛋白基础数据（如蛋白大小、等电点pl、疏水性、可溶性等）快速确定纯化技术组合。
3、能够快速检测蛋白的回收率、活性和杂质情况；
4、尽量减少步骤，从而避免样本损失过多和活性降低过多；
5、尽早除去蛋白酶等对样品有损害的杂质；
6、尽量少使用添加剂，否则可能需要额外的步骤去除添加剂。
蛋白纯化方法
由于样品和蛋白的性质各异，所含杂质也不尽相同，因此需要采用不同的蛋白纯化策略。
目前主要有六种蛋白纯化方法：凝胶过滤层析、离子交换层析、标签纯化、亲和层析、疏水作用层析、电泳等。
其他方法也可用于蛋白纯化，比如利用蛋白的热稳定性、蛋白酶解稳定性、溶解度等特性纯化蛋白。
1 凝胶过滤层析
凝胶过滤层析是一种高效的蛋白分离纯化方法，根据分子大小的差异分离蛋白质混合物。
在蛋白溶液通过含有填充颗粒的凝胶过滤层析柱时，由于不同蛋白的分子大小不同，扩散进入特定大小孔径颗粒的能力也因此各不相同，大分子蛋白率先被洗脱出来，分子量越小，洗脱越晚，从而达到蛋白分离和纯化的目的。
一般来说，越细、越长的凝胶过滤层析柱的纯化效果越好。
该技术具有诸多优点：温和，样本不易变性，几乎不会和蛋白质发生任何作用，重复性好，不使用有机溶剂，回收率高等。
该方法可用于蛋白纯化、分子量及其分布范围测定，更换缓冲液、脱盐等。
2 离子交换层析
离子交换层析是基于蛋白表面所带电荷种类、数量和分布的不同进行蛋白分离纯化的技术，在特定条件下，点电荷的蛋白可与阳/阴离子交换柱结合，并呈现出结合强度上的差异。
该结合是可逆的，在离子交换色谱时按结合力由弱到强的顺序被逐渐洗脱下来，实现蛋白的分离纯化。
该技术具有分辨率高、蛋白交换容量高、应用灵活、分离原理明确、操作简单易行等优点，适合实验室和工业规模应用，而凝胶过滤很难实现工业规模应用。
图1. 离子交换层析。
3 亲和层析
亲和层析是利用生物大分子与配基的专一性可逆吸附进行蛋白分离纯化。
该方法具有特异性
高、条件温和、速度快、效率高等优点，适合从复杂样本、杂质含量高的样本中提纯靶蛋白。
可利用目标蛋白与配基的特异性吸附，也可通过加入标签，再利用标签与配基的特异性结合，实现蛋白分离纯化（即下面的标签纯化）。
图2. 利用蛋白A、G、L进行亲和层析的原理示意图。
4 标签纯化
标签纯化利用基因重组技术在蛋白的氨基端或者羧基端加入几个额外氨基酸，作为标签，利于分离纯化。
常见的标签包括GST、His、MBP、Strep-tag™ II等。
GST标签：在蛋白质序列中加入谷胱甘肽S转移酶（GST），再利用Glutathione Sepharose 4B 作亲和纯化，用凝血酶或因子Xa切开。
该方法条件温和，能保留靶蛋白的抗原性和功能。
His标签：组氨酸（His）是最常见的标签之一，因为组氨酸很小，几乎不影响靶蛋白的功能、活性和结构。
在氨基酸加上6-10个组氨酸，在变性条件下，由于他能与Ni2+螯合柱紧密结合，再用咪唑洗脱，实现蛋白分离纯化。
5 疏水作用层析
疏水作用层析的原理是：在高离子强度下，盐-水体系中的蛋白质部分去溶剂化，内部疏水基团暴露出来，这些残基可与介质中的疏水官能团发生可逆的疏水相互作用。
当降低离子浓度时，蛋白的疏水基团隐藏起来，作用消失，完成洗脱。
由于不同蛋白与介质中疏水性配基间的疏水作用力不同，实现蛋白的分离纯化。
该方法成本低，能保留蛋白的生物活性，使用广泛。
图3. 疏水作用层析。
6 电泳
电泳分离纯化蛋白的原理是，在电场作用下，带点胶体颗粒朝电性相反的电极运动，并且分
子越大，运动速度越慢。
SDS-PAGE可用于蛋白质的分离纯化，通过染色剂，可对蛋白进行显色。
优点是易操作、经济、直观；缺点是不能大规模运用。
图4. SDS-PAGE。
蛋白质纯度的评价
通常使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶（SDS-PAGE）、毛细管电泳、反相色谱法和质谱法对靶蛋白的纯度进行评价。
Lowry（Folin-酚试剂法）或者Bradford（考马斯亮蓝法）分析方法经常用于总蛋白质含量的测定。
Bradford法的灵敏度更高，非常适合分析脂类含量高的样品，脂类杂质可能会干扰Lowry法的灵敏性。
参考资料：
Caroline Ritchie. An in-depth review of column chromatography for protein purification and survey result from 305 formal publications. 2012, h ttp:///10.13070/.2.134。