牛尾菜组织培养中外植体褐变现象控制研究

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植物组织培养中外植体发生褐变的原因及防止措施

１褐变原因及其危害
褐变是指植物组织培养诱导脱分化或再分化
化物质．当温度升高或继代保存时间过长，会发也生此类现象．但这种褐变若采取适当措施或者愈伤
组织适应了胁迫环境就不再发生了．
２２酶促褐变．
的过程中，外植体组织从表面向培养基释放褐色物
４１合理取材．
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变较为严重．以，所幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严
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（西师范高等专科学校，定甘肃定西７３０）４００摘要：通过对植物组织培养中外植体发生褐变的情况，分析了发生褐变的可能原因，并提出了相应的防止措
施．
关键词：植物组织培养；褐变Ｉ夕植体；防止措施中图分类号：９４６Ｑ４．文献标识码：Ａ文章编号：０６４２２１）３０４－１０－３ＸＩ０１０－０４０３
４６・
喀什师范学院学报

关于园林植物组织培养过程中褐化问题的探讨

关于园林植物组织培养过程中褐化问题的探讨作者：严棋栋来源：《现代园艺》2013年第06期摘要：褐化现象是园林植物进行组织培养过程中常见的问题之一，其与过度含水化、菌类污染等另外两项内容被称为植物组织培养中的三大难题。

因此，在现实生活中，加强对园林植物组织培养过程中褐化问题的研究，是当前摆在人们面前的一项重大而又紧迫的任务。

关键词：园林植物；组织培养；褐化问题；控制措施；研究随着时代的发展与社会的进步，褐化问题作为园林植物进行组织培养中的常见问题越来越受到人们的关注。

蝴蝶兰、非洲菊、大花茉莉、风铃草、玫瑰等植物在组织培养的过程中褐化现象较为严重。

本文将从园林植物在组织培养中存在褐化问题的角度出发，对相应的控制措施进行有效性研究。

1.针对园林植物组织培养过程中存在褐化问题的研究1.1关于褐化机理的研究园林植物在组织培养过程中出现褐化问题的机理是植物外植体在再分化或诱导脱分化的过程中，外植体组织从表面逐步向培养基中释放褐色的物质成分，最终导致培养基液体变成褐色。

培养基液体出现褐化问题和外植体自身含有的酚类化合物或者多酚氧化酶的活性具有息息相关的联系，比如说木本植物中的银杏与枣。

多酚氧化酶与酚类化合物接触培养基液体并经催化后，可迅速地氧化成为褐色的水与醌类物质，醌类物质在酪氨酸酶的作用下和外植体中的蛋白质聚合，使得组织切面快速转变成暗褐色或棕褐色，当褐色物质被释放到培养基中，会抑制外植体的再分化、脱分化、阻止苗的健康成长。

1.2关于影响园林植物在组织培养过程中出现褐化问题因素的研究1.2.1培养基对褐化现象的影响。

即在初次进行组织培养时，当培养基液体中的元机盐浓度超标时可能会导致酚类分泌物被大量释放，进而引起外植体的褐变。

当培养基液体中的丝氨酸、糖、硼含量过高时，会加剧褐变的程度。

1.2.2不同植物外植体对褐变的影响。

即在冬天获取植物外植体进行组织培养时，外植体的褐化死亡率较低，这是因为植物体中所含有的多酚氧化酶活性与酚类化合物的含量在冬季较好。

植物组织培养外植体褐变的研究进展分析

5BIOTECHWORLD 生物技术世界近年来组培技术在农作物栽培、花卉生产幼苗以及脱毒苗当中的应用日趋广泛,使得植物种植日益规模化以及自动化,避免受自然条件的影响。

组织培养方面的理论研究已经较为成熟,不过在试验生产的过程当中往往出现外植体褐变的问题[1]。

褐化产物一方面导致外植体以及培养基褐变,另一方面也会抑制外植体的正常生理反应,从而影响外植体生长,甚至诱发外植体的死亡。

因此加强外植体褐变方面的研究有着重要作用。

1 植物组织培养外植体褐变的影响因素1.1 外植体材料一方面是生理状态的影响。

材料自身生理状态的不同,在接种后的褐变程度往往也有所区别,原因推测是不同生理状态材料,其中酚类物质含量以及PPO的活性各不相同,褐变则随母株的年龄以及组织的木质化程度而呈现出上升的趋势。

有学者使用桑树基部幼芽作为外植体,比桑树上部的枝条壮芽外植体褐化程度轻并且褐化率低[2]。

另一方面是取材部位以及时期的影响。

研究人员通过对葡萄进行研究,发现侧生蔓切取茎尖要比延长蔓更加容易成活,分析发现前者的酚类物质含量要比后者低。

使用苹果进行研究结果表明顶芽要比侧芽更加容易成活,并且褐变的程度也更轻。

1.2 培养条件研究人员发现卡特兰在10～20℃的时候褐变程度要比超过20℃的时候轻。

苹果等植物茎尖的外植体加以遮光处理之后,其褐变的程度显著降低,同时取自然光照条件下的植株枝条,在接种后则容易出现褐变问题。

推测其中的原因可能是酚类物质合成醌类物质时候需要光诱导酶。

1.3 培养基培养基的成分过高导致无机盐的浓度上升,可以诱发柚棕出现褐变。

同时培养基的pH值变化能够导致酚类以及酚氧化酶的结合部位发生改变。

实验显示,石井的培养基pH在3.0～4.0的时候,外植体排出较多的褐化物,而pH为5.0的时候排出的褐化物显著减少。

除此之外,培养基的状态对褐化也有相应的影响。

通常情况下,液体培养的时候外植体的毒害物质能够很快扩散,这样一来对外植体的影响就比较轻微。

植物组织培养褐变产生的因素及对策

植物组织培养褐变产生的因素及对策褐变在许多植物组织培养过程中，常遇到褐变问题。

褐变主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生。

褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。

本文探讨植物组织培养中褐变现象的影响因素、机理及防范措施，对我们进行科学研究或工厂生产，包括植物组织的培养原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养都有着十分重要的现实意义。

1、褐变的危害褐变是指外植体在培养过程中，自身组织从表面培养基释放褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。

褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物数量多少及多酚氧化酶活性有直接关系。

很多植物，尤其是木本植物都含有较高的酚类化合物，这些酚类化合物在完整的组织和细胞中与多酚氧化酶分隔存在，因而比较稳定。

在切割外植体时，切口附近的细胞受到伤害，其分割状态被打破，酚类化合物外溢。

对于外植体本身来讲，酚类物质从外植体切口向外溢出是一种自我保护性反应，可诱导植保素或无物理屏障的形成，以防止微生物浸染组织。

但酚类很不稳定，在溢出过程中与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类物质又会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活。

从而导致组织代谢活动紊乱，生长停滞，最终衰老死亡。

此外，由于组织的老化病变也会使多酚氧化酶激活而引起褐变。

2、褐变产生的机理2.1 非酶促褐变非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。

将生长正常的愈伤组织转移到含NaCl 的培养基中，组织周围尤其是接触培养基部分发生褐变，但培养基中没有看到扩散的褐化物质。

当温度升高时继代保存时间过长，也会发生此类现象但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生了2.2 酶促褐变目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起的，培养材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起的。

外植体褐变及解决措施

外植体褐变及解决措施外植体褐变及其解决措施褐变是植物组织培养过程中常见的问题。

它与真菌污染和玻璃化冷冻一起被称为植物组织培养的三大难题。

本文针对褐变问题，结合相关数据，对影响褐变的因素进行了综合分析，并针对这些因素提出了相应的解决方案。

褐变是指外植体在培养过程中，自身组织向表面培养基释放褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。

一、褐变机理1非酶褐变非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。

徐振彪等将生长正常的愈伤组织转移到含nacl的培养基中，组织周围尤其是接触培养基部分发生褐变，但培养基中没有看到扩散的褐化物质。

当温度升高时继代保存时间过长，也会发生此类现象。

但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生了。

2.酶促褐变目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起的，培养材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起的。

酶促褐变如同一般的酶促反应，其发生必须具备三个条件，即酶、底物和氧。

引起褐变的酶有多酚氧化酶(ppo)、过氧化物酶(pod)、苯丙氨酸解氨酶等。

从初次培养和继代培养过程中试管苗的褐变程度和ppo的活性来看，表明ppo活性的高低是引起培养材料褐变的关键。

引起褐变的酶的底物主要是酚类化合物，按其组成可分成3类:苯基羧酸（包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等），第三类是黄烷衍生物（包括花青素、黄酮、芸香苷等），但并非所有的酚类物质都是ppo的底物。

在正常植物组织中，底物、氧和PPO同时存在而不褐变，因为在正常组织细胞中，多酚分布在液泡中，而PPO分布在各种质体或细胞质中。

这种区域分布使基质和PPO无法接触。

当细胞膜结构发生变化和破坏时，它为酶与PPO接触创造了条件。

在氧气存在下，苯酚被氧化成醌，并进行一系列脱水和聚合反应。

植物组织培养中褐变的发生机制与防治方法

植物组织培养中褐变的发生机制与防治方法刘悦（西北师范大学生命科学学院甘肃·兰州730070）摘要褐变是植物组织培养中的普遍存在的现象，已经成为影响组织培养成功的重要因素，并且已成为组织培养中的一大难题。

本文揭示了褐变的发生机制及控制机理、影响褐变的因素，并于此提出了防治褐变的措施，以期为解决褐变问题提供理论依据。

关键词植物组织褐变机制防治中图分类号：Q943.1文献标识码：A褐变在植物组织培养过程中普遍存在，国内学者普遍认为褐变能否得到有效控制是植物组织培养能否成功的关键所在，并且证明了褐变度与总酚含量以及PPO活性之间的关系因品种而异。

而国外学者Mayer和Harel则注意到正常果实组织中虽然存在有酚类物质和PPO，却并不发生褐变，指出果实中酚类物质和PPO在细胞中可能是区域化状态分布。

1褐变的发生机制关于褐变的发生机制，目前认为褐变分为两种：即酶促褐变和非酶促褐变。

但诸多研究认为引起褐变发生的主要是酶促褐变。

醌类化合物在酪氨酸酶的作用下与培养材料组织中的蛋白质发生聚合，引起其他酶系统失活，导致代谢紊乱，生长受阻。

当细胞膜的结构发生变化和破坏时，则为底物创造了与PPO接触的条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，再进行一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而才引起褐变。

2影响褐变的因素不同的材料、环境条件、因素或操作手段都会严重影响褐变发生的程度,不同的褐变程度也跟实验结果、研究目的息息相关。

在外植物体材料的基因型与生理状态确定的情况下，外植物体的种类和大小、培养条件是影响褐变的主要因素。

2.1外植体的种类和大小一般认为，木本植物比草本植物的外植体在培养中更易发生褐变。

外植体小的材料，因为切口所占比例较大而较易发生褐变。

切口越大，酚类被氧化的面积就越大，褐变现象越严重。

2.2培养条件培养室的温度控制在15℃~20℃，可有效地防止褐变的发生。

高温一方面不利于伤口的愈合，另一方面会增强多酚氧化酶的生物活性，从而加速氧化过程，使植物材料的褐变更为严重。

植物组织培养过程中外植体褐变及处理方法

植物组织培养过程中外植体褐变及处理方法发布日期：2010-12-31 浏览次数：1231 褐变的原因：①植物品种研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。

由于多酚氧化酶活性上的差异，因此，有些花卉品种的外植体在接种后较容易褐变，而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。

因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。

②生理状态由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。

一般来说，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。

一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。

③培养基成分浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。

④培养条件不当如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。

2 褐变的防止措施为了提高组织培养的成苗率，必须对外植体的褐变现象加以控制。

可以采用以下措施防止、减轻褐变现象的发生。

①选择合适的外植体一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。

②合适的培养条件无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。

③使用抗氧化剂在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。

另外使用0.1％～0.5％的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。

④连续转移对容易褐变的材料可间隔12-24h的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-lOd后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。

组织培养中植物外植体及愈伤组织褐变的研究进展

裂而最终坏死 [大。褐变主要发生在外植体培养、愈
伤组织继代培养、悬浮细胞培养、原生质体分离与培
养等过程，其不仅影响植物组织诱导、继代培养、再化和生，可使植体组织、细胞和培养基
变，从而抑制外植体的正常生理生化反应，影响外植体生长与分化而致其死亡。所以，防止和减少褐变是植物组织培养成功的关键。为此，笔者对引起植物组织褐变的机理、类型、因素及其防治方法等进行归纳总结，以期为植物组织培养技术的进一步完善和研究提供参考。
Keywords：callus；browning mechanism；polyphenol oxidase (PPO) ；peroxidase (POD) ；phenylala nine ammonialyase (P A L ) ；browning inhibitor
植物组织培养是在人工控制和无菌环境条件
过合适培养基和培养条件对其不同部位组织器官、
细胞及原生质体进行培养形成愈伤组织，进而经分
裂、分化、脱分化形成完整植株。因此，组织培养技
术的应用越来越普遍，但在愈伤组织培养过程中，组
织褐变、水质化 (玻璃化）和污染一直是困扰植物组织培养的 3 大难题[1]。组织褐变是指外植体在培养
过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质致

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广西农业科学
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２１，１１）１６ — ２５００４（２：２２１６
ＧｕｎｘａｇｉＡｃｌｒｌＳｉｎｅｕｔａｃｅｃｓｕ
牛尾菜组织培养中外植体褐变现象控制研究
庾韦花，蒙平，张向军，颖南，陈少珍，素梅，唐军潘黄
本培养基，以有效控制牛尾菜的褐化，可提高诱导率。
关键词：牛尾菜；外植体；褐化；控制
中图分类号：９９９Ｑ４．５文献标识码：Ａ文章编号：０２８６（００１ — ２２０１０ — １１２１）２１６ — ４
ＣｏｔｏｆｅｐａｔｂｏｎｕｉｇｔｅｔｓｕｕｔｒｆＳｉｘｎｒｌｘｌｎｒｗｉｇｄｒｎｈｉｓｅｃｌｕｅｏｍｌｏａｒｐｒａＡ．ＪａＪ．ｉｉＡＤＣ
随着６Ｂ一Ａ和ＮＡＡ浓度的提高，外植体发生褐化时间呈现提前的趋势，以ＭＳ６Ｂ．ｍ／＋Ａ．ｍｇ￣养基中的＋一Ａ２ｇＮＡ０２／０ＬＩ
外植体诱导率最高，３％。外，对于基本培养基ＭＳ１Ｍ，低无机盐离子浓度ＷＰ本培养基中，植体褐为６．此４相、／Ｓ在２Ｍ基外化的时间有所推迟，可减缓外植体褐化程度。因此，宜的外植体、毒时间、氧化剂、褐化剂、素组合配比和基适消抗抗激
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Ａｂｓｒｔｔａｃ：Ｔｈｅｐｅｅｘｒｍｅｔｗａｏｄｔｄｔｔｄｙｔｆｅｔｆｄｉｅｅｎｘｐａｓｔｒｌｚｔｏｉ，ａｔｏｉｒｓｎｔｅｐｅｉｎｓｃｎｕｃｅｏｓｕｈｅｅｆｃｓｏｆｒｔｅｌｎｔ，ｓｅｉａｉｎｔｍｅｎｉｘ－ｉ
ＹｉｈａＭＥＧＰｎ，ＨＮｉｎ－ｕ，ＡｉｇｎｎＣＮＳａ— ｈｎＵＷｅ— ｕ，ＮｉｇＺＡＧＸａｇｊｎＰＮＹｎ－ａ，ＨＥｈｏｚｅ，
ＨＵＡＮＧｕｍｅ．ＴＳ — ｉＡＮＧＪｎｕ
（西农业科学院生物技术研究所，南宁广５００）３０７
摘要：以幼嫩叶片、顶芽及茎段为外植体，研究不同外植体、消毒时间、氧化剂预处理、抗褐化剂以及不同培养基组合等对外植体褐变控制的效果。结果表明，嫩叶、顶芽及茎段的褐化率均随着０１．％升汞溶液消毒时间的延长而升
高，而诱导率和污染率不断降低，佳外植体为顶芽，最消毒时间为１ｎ诱导率达７．％。用３抗氧化剂预处理２０ｍｉ，００采种０ｍｉ，可抑制顶芽褐化，弱表现为ＰＰＶ＞ａＶ溶液可以加快侧芽的萌动及生长。３抗褐化剂对茎段褐化ｎ均强Ｖ＞ｃＮ：Ｏ，ｃＳ种均有不同程度的抑制效果，．％Ａ抗褐化效果最佳，段未发生褐化，芽生长最好。在不同激素配比培养基中，以０３Ｃ茎侧