核桃外植体褐化影响因素及增殖培养研究
组织培养褐化原因以及防止措施
褐化原因及防止措施褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象。
在组织培养中，褐变是普遍存在的，这种现象与菌类污染和玻璃化并称为植物组织培养的三大难题。
而控制褐变比控制污染和玻璃化更加困难。
因此，能否有效地控制褐变是某些植物能否组培成功的关键。
(一)褐变的原因影响褐变的因素极其复杂，随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同，褐变的程度也有所不同。
1.与基因型有关不同植物与品种之间褐变现象是不同的，有人把此归结为基因型的不同。
一般来说植物材料中单宁类和多种羟酚类化合物的含量高，易引起外植体材料的严重褐化。
多数木本植物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐化。
2.与取样外植体的年龄有关通常幼龄部位产生褐化较轻，随着组织的老龄化含醌类物质增多而褐化加重。
因此，在外植体接种时常需要剥去鳞片和大叶片，尤其是以切取幼嫩的芽尖或切取顶芽分生组织(或带少量叶原基)接种更为理想。
3.与外植体取材时间有关一般在春夏季，尤其是春季采取生长旺盛的外植体产生褐化较轻，已木栓化或木质化的枝条和处于休眠状态的芽作为外植体时褐化严重。
即分生部位接种后形成醌类物质少，而分化的部位则形成醌类物质较多。
4.与培养基有关过高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体酚的氧化，低盐培养基，尤其是Mn2+和 Cu2+离子浓度较低时，外植体的褐化程度较轻。
例如油棕用MS无机盐培养容易引起外植体的褐变，而用降低了无机盐浓度的改良MS培养基时则可减轻褐变，而且获得愈伤组织和胚状体。
植物生长调节物质使用不当时，材料也容易褐变，细胞分裂素BA有刺激多酚氧化酶活性提高的作用，这一现象在甘蔗的组织培养中十分明显。
培养基的PH值较低时常有利于减轻外植体的褐化。
核桃外植体的组织培养
18 18 18 18 18 18 18 18 18
无菌数 No bacillus number
个
7 8 10 11 12 11 12 13 11
无菌率 No bacillus efficiency
%
38． 9 44． 4 55． 6 61． 1 66． 7 61． 1 66． 7 72． 2 61． 1
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39（28） ：17156 － 17157
责任编辑 宋平 责任校对 况玲玲
核桃外植体的组织培养
杨海波1 ，王 娟1 ，周鹏程1 ，孟利峰1 ，高 涛2
（ 1． 山西省农业科学院果树研究所，山西太谷 030815； 2． 山西农业大学园艺学院，山西太谷 030801）
时间 Time min
3 4 6 3 4 6 3 4 6
表 2 不同浓度 HgCl2 处理对外植体 b 灭菌效果的影响 Table 2 Effect of different concentration HgCl2 on explant b sterilization
接种数 Inoculation number
摘要 ［目的］研究核桃组织培养与快速繁殖的方法。［方法］以“金薄香”1 号带腋芽的茎段为外植体进行试管繁殖。［结果］腋芽萌生 最佳培养基： DKW + BA 1． 5 mg / L； 分化及继代最佳培养基： DKW + BA 0． 4 mg / L + IBA 0． 01 mg / L； 生根最佳培养基： 1 /2DKW + IBA 1． 0 mg /L，不过生根率只有 23． 3% ，效果不太理想； 二步生根法效果不错，生根率可达到 36． 7%。［结论］该研究筛选获得适宜“金薄香”1 号 核桃快繁的最佳培养条件，为建立核桃快繁体系、扩大核桃苗繁育规模奠定基础。 关键词 核桃； 外植体； 组织培养 中图分类号 S 664． 1 文献标识码 A 文章编号 0517 － 6611（ 2011） 28 － 17156 － 02
植物组织培养中褐变机理和防治措施
植物组织培养中褐变机理和防治措施摘要：褐变现象是指组织培养诱导脱分化或再分化的过程中，外植体组织从表面向培养基释放褐色物质而使得培养基逐渐变成褐色，外植体随之褐变死亡的现象，褐变现象又称酚污染，在植物组织培养过程中经常出现。
对诱导外植体的脱分化和培再分化过程的影响非常大，甚至是影响某些植物组织培养成功与否的关键。
褐变主要发生在外植体、愈伤组织的继代、悬浮细胞培养、原生质体的分离与培养等。
褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。
本文对褐变的影响因素和对策进行了研究。
关键词：组织培养，褐变，影响因素1. 影响褐变的因素因子是复杂的，随植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等的不同，褐变的程度也有所不同。
1.1褐变类型及基因型物种及其基因型对褐化的影响。
植物组织培养过程中外植体的褐化主要由多酚氧化酶作用于酚类物质而引起的。
不同植物品种、同种植物的不同类型因为外植体材料的基因型不同，在组织培养中褐化发生的频率和程度都存在着较大的差异[4]。
由于酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素的合成前体，木本植物、单宁含量或色素含量高的植物酚类物质含量也很高，木质素、单宁或色素形成多，其组织培养就容易发生褐变。
因此，组织培养过程中，木本植物一般比草本植物易发生褐变。
目前报道发生褐变的植物中多数是木本植物[5]。
在木本植物中，核桃、板栗由于单宁含量很高，进行组织培养难度很大，不仅在接种后的初代培养期容易发生褐变，而且在形成愈伤组织以后也会因为褐变而引起死亡。
红豆杉愈伤组织的诱导及继代培养过程中，常常发生培养细胞褐变现象，轻者影响细胞生长和繁殖，重者导致细胞死亡。
豆科植物和芸苔属植物原生质体培养中容易褐化也是一个普遍的问题，橡胶的花药培养中，海垦2号花药的褐变较少，因而愈伤组织的诱导容易；而有些品系花药容易褐变，因而愈伤组织的诱导困难。
在组织培养中，有些品种、品系难以成功，而有些则容易成功。
植物组织培养中的褐化现象
植物组织培养中的褐化现象植物组织培养中所说的褐化现象是指在外植体诱导初分化或再分化过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质以至培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。
褐化现象主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代培养、悬浮细胞培养、花药培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生。
褐化产物不仅使外植体、细胞、培养基褐变，而且对许多酶有抑制作用，影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致材料死亡。
褐化、污染和玻璃化并称为植物组织培养的三大难题，且控制褐化比控制污染和玻璃化更加困难，因此，有人认为，褐化能否得到有效控制是植物组织培养能否成功的关键所在。
褐化现象的机理在自然条件下，细胞中的酚和醌之间保持一种动态平衡，醌类物质水平较低。
当细胞受伤或衰老时，酚氧化酶释放或合成，在合适的PH、温度等条件下，酚氧化酶、酚类物质(底物)和氧气聚合发生氧化反应，形成有毒的醌类物质。
当外植体组织被切割和接种时，损伤切面细胞中酚类物质被氧化成醌，切面迅速变成棕褐色或暗褐色，这些褐色物质会逐渐扩散到培养基中，抑制其它酶的活性，毒害整个外植体组织。
影响褐化现象的因素植物组织培养过程中的褐化现象，引起植物材料褐变的因子是复杂的，往往是多种因素共同作用的结果。
培养材料或外植体种类与品种或基因型褐化与植物本身的内在因素有关，不同种类植物、同种植物的不同类型和品种在组织培养中褐变程度有很大差别。
一般来说，多年生木本植物比草本植物容易发生褐变，因为木本植物的单宁或色素含量较高，而酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素的合成前体，所以易褐变。
外植体的生理状态在组织培养中，培养材料或外植体的褐变是导致培养失败的主要原因，材料本身的生理状态不同，接种后褐变程度也不同。
木质化程度高的外植体会促进褐化的发生。
大量实验表明，材料在培养过程中的褐化程度与多酚氧化酶活性及酚含量有关。
外植体的取材有关植物组织培养中褐变现象的研究已经很多，大量实验表明组织培养中褐变的发生及褐化的严重程度和外植体取材的时期、取材的部位、类型及外植体取材的大小和取材前的预处理有关。
植物组织培养褐化问题的研究进展
从而加剧褐化的发生。张卫芳ｆ 均 等发现 ， 随着培养基 该假说认为褐化过程主要是通过 Ｐ Ｏ及其底物进行作用的。 的氧化能力， Ｐ － Ａ浓度的升高 ， 组织的褐化率增加， 一年生薄壳核桃的茎尖 Ｐ Ｏ作为普遍存在于植物体内的一类末端氧化酶， Ｐ 能够催化酚类 中 ６ Ｂ
物 质形 成醌 和水 ，醌经 过非酶 促聚 合作 用形成 深 色物 质并 对外 植 培养中褐化反应时间也随之缩短 ； 添加 ２ ４ Ｄ、 的组合 ， ，－ Ｉ 从 褐化
生 机制 分为酶 促 褐化与 非酶 促褐化 。多数 研 究认为 外植 体的 褐化 龄材料含量较高 因此培养过程中幼年型材料发生的褐变程度轻 ， 属于 酶促 褐化 ， 理可 通过 酚 一酚 酶的 区域 性 分布 与 组织 褐 变和 于成 年型 材料 。王异 星 荔枝 无 菌 苗不 同组 织 的诱 导 实验 中 发 机 在 酚 一酚酶 假说 两种假 说来 诠释 日 。 １１ 一 酚酶 的 区域 性 分布 与组 织褐 变假 说 ．酚
现， 根部极大部分基本不能诱导愈伤组织 ， 即使诱导出愈伤组织也 全部褐变； 多数叶片较难诱导愈伤组织， 诱导出的愈伤组织多出现 ２２ ．培养基成分对褐化的影响 ２ ．无机盐浓度对褐化的影响。初代培养时 ， ．１ ２ 培养基中无机 盐浓度影响酚类分泌物的产生。邱璐 等发现 ， 云桑组织培养过程
体材料产生毒害作用， 使之死亡。褐化过程必须具备酶 ， 底物和氧 反应稍有推迟 ； 较低浓度 ６ Ｂ － Ａ适宜茎尖分化生长 ， 褐化反应慢 ，
条件 。 ２影 响 外植 体 褐 化 的 因素 ．
部分培养基无明显褐化现象。 加入 Ｂ Ｋ Ａ， Ｔ后甘蔗组织培养㈣ 褐变
更加明显。 此外 ， 生长调节物质的浓度也会影响植物组织培养的褐
植物组织培养中的褐变现象及其防止措施
04
褐变现象的研究进展
褐变与基因表达的关系
总结词
褐变与基因表达之间存在密切关系，一些关 键基因在褐变过程中被激活或抑制，影响植 物组织的褐变程度。
详细描述
在植物组织培养过程中，褐变通常与某些基 因的表达水平有关。这些基因可能涉及到酚 类物质的合成、代谢和运输等过程。通过深 入研究这些基因的表达模式，可以更好地理 解褐变现象的分子机制，并寻找有效的防止 措施。
添加抗氧化剂
总结词
在培养基中添加抗氧化剂可以有效防止褐变。
详细描述
抗氧化剂可以抑制酚类物质氧化，从而减少褐变的发生。常用的抗氧化剂包括 抗坏血酸、柠檬酸、硫代硫酸钠等。在培养基中加入适量的抗氧化剂，可以有 效降低酚类物质的氧化程度，从而防止褐变。
调节光照和温度
总结词
调节光照和温度也是防止褐变的措施之一。
详细描述
光照和温度对植物组织培养中的褐变也有影响。适当降低光照强度或缩短光照时间可以减少酚类物质 的氧化，从而降低褐变发生率。同时，保持恒定的培养温度也有助于防止褐变的发生。
优化培养条件
总结词
优化培养条件是防止褐变的综合性措施 。
VS
详细描述
除了选择适当的培养基和外植体、添加抗 氧化剂、调节光照和温度等措施外，优化 培养条件也是防止褐变的重要措施。这包 括控制培养室的湿度、定期更换新鲜的培 养基、及时转移生长过快或过慢的植株等 措施。通过综合运用这些措施，可以有效 降低植物组织培养中的褐变发生率。
05
结论与展望
研究成果总结
褐变现象的机制
植物组织培养中的褐变现象是由多种因素引起的，包括酚类物质氧化、酶促反应和非酶 促反应等。这些反应导致培养基颜色变深，影响植物的正常生长和发育。
植物组织培养中外植体发生褐变的原因及防止措施
１ 褐 变 原 因及 其危 害
褐 变是 指植 物 组织 培养 诱 导脱 分化 或 再分 化
化物 质． 当温 度升 高或 继 代保 存 时 间过长 ， 会发 也 生此类 现象 ． 但这种 褐变若采 取适 当措施或 者愈伤
组织 适应 了胁迫环境 就不再 发生 了．
２ ２ 酶促褐 变 ．
的过程 中 ， 外植体 组织从 表面 向培养基 释放褐 色物
４ １ 合理取 材 ．
植 株采 收 的外植 体 ， 于含 酚类 物 质较 多 ， 由 因此 褐
变较为严 重． 以 ， 所 幼嫩 的组 织 在接 种 后褐 变 程 度 并 不 明显 ， 而老 熟 的组 织在 接种后 褐变程 度较 为严
重．
在适 当的 时间 ， 选择 幼 年植 株 ， 在植 株 的一 并
外 植体 的大 小对 褐 变 的发生 及褐 变 程 度有 一 定影 响 ¨ Ｂ ｎａ 为 外 植 体越 小 ， 面 与体 积 的 ． ｏｇ 认 切 比率越 大 ， 伤害及 褐 化 的程 度 就越 大 ； 对 大 的材 相
料褐变 的程度 较轻 ¨ 除 了机 械 伤害外 ， 种 时各 ． 接
・
刘玲 玲
（ 西师 范高等专科学校 ， 定 甘肃 定西 ７ ３０ ） ４ ００ 摘 要： 通过对植物组织培养 中外植体 发生 褐变的情况 ， 分析 了发生褐变 的可能原 因 ， 并提 出 了相应 的防止措
施．
关键词 ： 植物组织培养 ； 褐变 Ｉ 夕 植体 ； 防止措施 中图分类号 ：９ ４ ６ Ｑ ４ ． 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ：０６４ ２ ２ １ ） ３０４ － １０ －３ ＸＩ０ １ ０ －０ ４０ ３
４ ６・
喀什 师范学院学报
植物组织培养中褐变的影响因素及防止措施
植物组织培养中褐变的影响因素及防止措施作者：周亚辉来源：《现代农业科技》2016年第05期摘要褐变问题在植物组织培养过程中普遍存在，严重影响了外植体的生长与分化，结合国内外研究褐变的相关报道，综述了植物组织培养中褐变的影响因素和防止措施。
关键词植物组织培养；褐变；影响因素；防止措施中图分类号 Q813.1+2 文献标识码 B 文章编号 1007-5739（2016）05-0117-02近年来，随着科学技术的迅猛发展，植物组织培养已成为生物学科中的重要研究技术和手段之一，其被广泛应用于科研和生产，在农学、花卉、林业、医药业等领域中取得了巨大的经济、社会效益。
但是，植物组织培养过程中褐变问题普遍存在，褐变的发生会严重影响外植体的生长与分化，甚至导致培养材料的死亡，褐变问题已成为组织培养中的一大难题。
褐变的影响因素是复杂的，随外植体种类、基因型、取材部位及生理状况等的不同而危害程度有所区别，国内外也研究报道了一些减少或防止褐变的方法。
本文系统归纳了植物组织培养褐变的影响因素和防止措施，对深入研究褐变问题和组织培养技术都有着非常重要的意义。
1 褐变的影响因素1.1 外植体基因型在植物组织培养中，有些品系容易褐变，诱导困难，而有些品系褐变较少，愈伤组织化容易些，组培容易成功，其原因之一可能是酚类物质含量及多酚氧化酶活性上的差异。
1.2 外植体的生理状态外植体本身的生理状态不同，接种后褐变的程度也不同。
致褐物质的含量会因生理年龄、季节、取材时间及部位的不同而不同。
1.3 培养基成分和培养条件无机盐浓度、培养基pH值、培养基状态及植物激素等不适宜，均会引起褐变的产生。
此外，培养过程中温度过高或光照过强，也会加速褐变的产生。
1.4 培养时间接种后转瓶时间的早晚也是影响褐变的因素，接种后外植体培养时间过长，未及时转瓶，会使培养材料伤口积累过多酚类物质，导致褐变。
2 褐变的防止措施2.1 外植体的选择2.1.1 基因型。
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核桃外植体褐化影响因素及增殖培养研究
核桃（Juglans regia L.）是一种重要的经济作物，其果实富含营养，具有很高的经济和医疗价值。
然而，在核桃栽培和贮藏过程中，不可避免地会出现外植体褐化的现象，极大地降低了其品质和商业价值。
因此，研究核桃外植体褐化的影响因素及其增殖培养技术对于促进核桃产业的发展具有重要意义。
核桃外植体褐化是指在离体培养过程中，外植体的组织和细胞发生不可逆的氧化酶介导的褐化反应，导致外植体组织变色，细胞死亡，并最终导致外植体失去再生和生长能力。
目前，有关核桃外植体褐化的影响因素的研究还相对较少。
根据目前的研究成果和实践经验，本文将从以下几个方面进行分析和讨论。
首先，外植体来源是影响核桃外植体褐化的重要因素之一。
核桃外植体通常采用幼嫩的离体子叶、叶片或幼苗作为外植体材料。
这些外植体在采集和处理过程中很容易受到伤害和污染，进而引发褐化反应。
因此，在采集和处理外植体材料时，应注意采用无菌操作，并尽可能缩短材料与外界接触的时间，减少伤害和污染的发生。
其次，外植体的培养基成分也对核桃外植体褐化起着重要的影响。
适宜的培养基成分可以提供必要的营养物质，调节植物内部激素平衡，促进外植体的生长和分化。
在核桃外植体培养中，常用的培养基成分包括碳源、氮源、无机盐和维生素等。
合理调节这些成分的浓度和比例，既能够满足外植体正常的生长需求，又能够降低外植体组织的褐化程度。
另外，外植体培养条件也是影响核桃外植体褐化的重要因素之一。
温度、光照和湿度等环境因素对外植体的生长和分化
具有直接影响。
在核桃外植体培养过程中，适宜的温度和光照条件可以促进外植体的生长和分化，同时降低外植体组织的褐化程度。
此外，适当控制培养基的pH值、添加有效抗氧化剂
和调节外植体的培养周期等措施，也对核桃外植体的褐化有一定的抑制作用。
最后，外植体的处理和转运也可能对核桃外植体褐化产生影响。
因为在采集、处理和转运过程中，外植体会受到细胞损伤、氧化酶的激活等因素的影响，进而引发褐化反应。
因此，在处理和转运外植体时，应尽可能减少细胞损伤和激活氧化酶的发生，采用无菌操作，并尽快将外植体转移到培养基中，以减少外植体褐化的风险。
综上所述，核桃外植体褐化是核桃产业中的一个重要问题。
在核桃外植体褐化的影响因素及其增殖培养研究中，外植体来源、培养基成分、培养条件以及外植体的处理和转运等因素都对核桃外植体褐化产生一定的影响。
因此，合理调控这些因素，采取相应的管理措施，能够有效降低核桃外植体褐化的程度，提高核桃外植体的培养和增殖效果，推动核桃产业的高效发展
综上所述，核桃外植体褐化是核桃产业中一个重要问题，其影响因素包括外植体来源、培养基成分、培养条件以及外植体的处理和转运等。
合理调控这些因素，并采取相应的管理措施，可以有效降低核桃外植体褐化的程度，提高核桃外植体的培养和增殖效果，从而推动核桃产业的高效发展。
为了解决核桃外植体褐化问题，今后的研究可以着重探讨外植体来源的选择、优化培养基成分及添加抗氧化剂等方面，以进一步提高核桃外植体培养的成功率和产量。