细胞核与线粒体的分级分离
细胞核和线粒体的分离和观察课件
目录
CONTENTS
• 细胞核和线粒体的基础知识 • 细胞核和线粒体的分离技术 • 细胞核和线粒体的观察方法 • 实验操作注意事项 • 实验结果分析
01
CHAPTER
细胞核和线粒体的基础知重要的亚 细胞结构，由核膜、核仁和染色 质等组成。
细胞核和线粒体的分离效果
通过染色和显微镜观察，可以清晰地看到细胞核和线粒体被成功 分离，没有明显的杂质。
细胞核和线粒体形态特征
分离后的细胞核呈现圆形或椭圆形，表面光滑，结构致密；线粒体 呈现长条形或杆状，表面有细微的皱褶。
荧光染色效果
通过荧光染色技术，可以观察到细胞核和线粒体分别发出蓝色和绿 色荧光，荧光信号强且均匀。
数据分析
对观察结果进行统计分析 ，得出结论。
实验后的处理
清洗和整理实验器材
实验结果总结
实验结束后，及时清洗和整理实验器 材，确保其完好无损。
对实验结果进行总结，撰写实验报告 ，并进行分析和讨论。
废弃物处理
按照规定处理实验废弃物，避免对环 境和人体造成危害。
05
CHAPTER
实验结果分析
实验结果展示
差速离心法是一种简单、快速和经济 的方法，适用于分离大量细胞。
密度梯度离心法
01
密度梯度离心法是一种 利用连续的密度梯度介 质对细胞进行分离的方 法。
02
在密度梯度离心法中， 细胞悬浮在密度梯度介 质中，然后在离心机中 旋转。
03
由于不同细胞组分的密 度不同，它们在介质中 沉降的速度也不同，从 而实现分离。
电子显微镜观察
总结词
电子显微镜提供了高分辨率的图像，能够更精确地观察细胞核和线粒体的超微结 构。
细胞核与线粒体的分级分离
总流程
D1
匀 浆
2ml
加2ml 0.25M 蔗糖 悬浮
离 心 3000rpm 10分钟
D2
加1ml 0.34M 蔗糖
1ml D2
U5
离 心
悬浮
4000rpm 15分钟 0.8ml 0.88M蔗糖
D5 涂片
离 心 2000rpm
U2 U1 合并
10分钟
2
5000rpm 10分钟 离 心
1.5ml
置干净小 烧杯中
2、密度梯度离心法：用具有梯度的介质来替换离心 管中密度均一的介质，使介质分为不同的层次，浓度 低的在上层，高的在底层。细胞匀浆加在最上层，随 后离心。这样，不同大小、形态、密度的颗粒，就会 以不同的速度向下移动，击中到不同的区域，可以分 别收集。 该法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒； ②适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又 能分离有一定浮力密度的颗粒；③颗粒不会积压变形， 能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引 起混合。 缺点：① 离心时间较长；②需要制备梯度；③操作 严格，不宜掌握。
改良苯酚 品红染色
镜检 U3 D3
1.2ml 离 心 10000rpm 10分钟
2
镜 检
健 那 绿 染 色
涂 片
各加 0.5ml 0.25M 蔗糖 悬浮
D4Leabharlann U4注意事项•吸取上清液时应将离心管略微倾斜，按下移液抢按 钮（不要按到底），后将枪头轻靠在管壁上，缓慢 吸出液体，注意不要使液体浑浊，否则得重新离心。 •密度梯度离心加入上层低密度液体时，也应将枪头 轻靠上侧液面管壁上，缓慢加入液体，加完后上下 层液体应有明显界限。 •1.5ml离心管使用eppendof的离心机；5ml离心管使 用的转子国产小离心机，注意平衡对称！ •线粒体样本制备好后应尽快染色，不要放置过久， 以避免线粒体活性丧失。
细胞器的分级分离ppt课件
• 3．实验操作中有哪些关键步骤和因素影响所得 细胞器的含量和纯度？
(4)线粒体的分离
将分离细胞核时收集的上清以10000 g 离心10 min，将上清移入1.5 ml Ep管内并置冰上或4℃冰箱 待用。沉淀用0.25 mol/L的蔗糖溶液重悬后， 10000 g离心10 min，重复1次，取沉淀。
(2)线粒体的鉴定
于洁净载玻片上滴1滴0.02％～1％的詹纳斯 绿B染液，用牙签挑取线粒体沉淀均匀涂于染液中， 染色5～10 min，盖上盖玻片，镜检。
密度梯度离心法（density gradient centrifugation） 是一定介质形成一连续或不连续的密度梯度，顶部的 细胞匀浆在重力或离心力场的作用下分层、分离。
一般先通过差速离心法将细胞器初步分离，再进 一步通过密度梯度离心法分离纯化细胞器。
细胞器的分离常通过组织细胞匀浆、分级 分离和分析三个步骤完成。
细胞器的分级分离
[目的要求]
• 1．掌握差速离心法和密度梯度离心法的原理。 • 2．熟悉哺乳动物细胞的细胞核、线粒体分离和
纯化的实验方法。
[实验原理]
球形颗粒的沉降速率取决于其密度、半径、介质 黏度和离心力。
差速离心法（differential centrifugation）是将细 胞匀浆在密度均一的介质中从低速到高速离心，较大 颗粒先在低速离心时沉淀，再用高速离心沉淀上清液 中的小颗粒物质，从而达到逐级分离细胞器的目的。
[实验步骤]
1．组织匀浆制备
（1）取材 将空腹12～24 h的大鼠处死。剖开腹部， 迅速取出肝脏，用预冷的生理盐水洗净血污，用 滤纸吸干。
（2）制备匀浆 称取约1～2 g左右的肝组织，用预冷 的0.25 mol/L的蔗糖溶液冲洗数次，剪碎。以预 冷的0.25 mol/L的蔗糖溶液悬浮剪碎的组织，移 入匀浆器内，在冰浴条件下匀浆。匀浆完成后， 用滤网过滤，即制得肝细胞匀浆，备用。
细胞核,叶绿体,线粒体的分级分离
实验二细胞核,叶绿体,线粒体的分级分离与观察一、实验目的：1、了解细胞器分离的一般原理和方法；2、掌握分级分离的原理和注意事项;3、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光.4、线粒体的分离方法以及詹纳斯绿B超活染色的方法.二、实验原理：将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心,是分离细胞器的常用方法.细胞组分的分离在等渗溶液〔0.35mol/L Nacl或0.4mol/L蔗糖溶液〕中进行.●将匀浆液在1000r/min的条件下离心2 min以全除组织残渣和未破碎的细胞.●在3000r/min的条件下离心5 min,即可获得沉淀的叶绿体〔混有部分细胞核〕.●上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟,所得沉淀即为线粒体,可反复离心一次.三、实验步骤：第一部分细胞核与叶绿体的分离与观察1、选取新鲜的菠菜叶,洗净搽干后去除叶梗和粗脉,称30g于150ml0.35mol/L Nacl溶液中,放入组织捣碎机<间歇>；低速匀浆1min；间歇匀浆.2、将匀浆用6层纱布过滤于烧杯中.3、每小组取滤液4 ml在1000r/min的条件下离心2 min；4、取上清液在3000r/min的条件下离心5 min；沉淀即为叶绿体〔混有部分细胞核〕；上清夜转入干净的离心管中用于线粒体分离.5、叶绿体观察：➢将沉淀用0.35mol/L Nacl悬浮.〔浓度不要太高,不利于观察〕➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上,加盖玻片即可在普通光学显微镜和荧光显微镜下观察；➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上,再滴加一滴0.01%吖啶橙染料,加盖玻片即可在荧光显微镜下观察.第二部分线粒体的分级分离以及超活染色观察6 第4步获得的上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟,所得沉淀即为线粒体,可反复离心一次.收集沉淀涂片,用1%詹纳斯绿B染色5-10分钟,线粒体为蓝绿色圆形颗粒.实验过程最好在0-4o C的条件下进行；如果在室温下,要迅速分离和观察.〔教师演示示X〕第三部分人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察一、实验目的：观察活细胞内线粒体的形态、数量与分布.二、实验原理：线粒体是细胞进行呼吸作用的场所,其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同生理状态而发生改变.詹纳斯绿B是一种毒性较小的碱性染料,可专一性的对线粒体进行超活染色,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用,使染料始终保持氧化状态〔即有色状态〕,呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中,这些染料被还原为无色的色基〔即无色状态〕.三、实验步骤：1、取清洁载玻片,滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液；2、用牙签宽头在口腔颊黏膜处稍用力刮取上皮细胞,将刮下的黏液状物放入载玻片的染液中,染色10-15 min；〔作用,染液不可干燥,必要时加滴染液〕；3、盖上盖玻片,置显微镜下观察.四、实验结果：在低倍镜下,选择平展的口腔上皮细胞,换高倍镜观察,可见扁平状上皮细胞内,核周围的胞质中,分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构,即为线粒体.实验作业：3 绘口腔上皮细胞示线粒体形态与分布.。
实验 细胞器的分离
• ①、②、③片，自然干燥后，放入Giemsa染 液缸中染色 5min，用蒸馏水洗去染液，镜检。 • ④片先滴 1—2 滴健那绿 B 于玻片上，挑少许 沉淀在染液中混匀，染5min，加盖片镜检。
• ⑤片先滴 1—2 滴健那绿 B 于玻片上，滴一滴 上清液在染液中混匀，染 5min，加盖片镜检。
实验注意事项： 1.冰水中匀浆肝组织； 2.过滤匀浆液的纱布事先用预冷蔗糖液 浸湿； 3.收集液体要避免吸到脂肪层； 4.标记玻片。
可分离较小颗粒，如线粒 体、高尔基体、溶酶体
密度梯度离心法：使离心溶液含有密度逐步增加的 （密度梯度）极易溶解的惰性物质，例如蔗糖，利用 这一密度梯度来维持重力的稳定性和抑制对流。操作 时，将细胞匀浆液置于离心管的最上层，随后离心， 这样，不同大小、形状、密度的细胞结构，由于它们 的沉降系数不同，就会以不同的速率向下移动，分别 集中到相应的密度区带而得以分离。
三、实验步骤:
蛙肝 ↓冷生理盐水10ml洗，吸干水分，放在小烧杯中 ↓加入预冷蔗糖液(少于9ml)，剪碎 匀浆
↓纱布过滤至15ml离心管，溶液体积14ml。
滤液→做涂片①
↓2000 rpm离心10 min
沉淀 上清液 →做涂片② ↓加预冷蔗糖液至10ml，吹打均匀 ↓5ml,11000 rpm离心10 min，弃上清液 混合液 沉淀 ↓2000 rpm离心10 min，弃上清液 ↓加2ml预冷蔗糖液，吹打均匀 沉淀 混合液 ↓加1ml蔗糖液，混匀 ↓11000 rpm离心10 min 做涂片③ 沉淀 上清液 ↓ ↓ 取少许于载片, 取1滴于载片 加健那绿B 混匀④ 加健那绿B 混匀⑤
实验六 细胞器的分离: 细胞核与线粒体的分级分离
一、实验目的
1. 了解用差速离心的方法分级分离细胞组分 的原理和过程。 2. 熟悉离心机、匀浆器的使用方法。
5.细胞核和线粒体的分级分离
实验五细胞核与线粒体的分级分离一、实验原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／l 蔗糖一0.003mol／l氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分级分离(fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。
先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。
由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。
分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。
二、实验用品（一）材料和标本：小白鼠、冰块。
（二）器材和仪器：玻璃匀浆器、普通离心机、台式高速离心机、普通天平、光学显微镜、载玻片、盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、10ml量筒、25ml烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、镊子、吸水纸、纱布、螬盘、平皿、牙签。
（三）试剂：0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液、1％甲苯胺兰染液、0.02％詹纳斯绿B染液、0.9％NaCl溶液。
三、实验步骤（一）细胞核的分离提取1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。
2．将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／l蔗糖一0.003mol ／l氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。
实验二细胞核与线粒体的分离与观察
实验二细胞核与线粒体的分离与观察实验二细胞核与线粒体的分离与观察一、实验目的1．了解差速离心法分离细胞核与线粒体的原理。
2．掌握差速离心法分离动物与植物细胞的细胞核与线粒体的方法。
二、实验原理细胞核（nucleus）是细胞中重要的细胞器，细胞的控制中心，在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，是遗传物质的主要存在部位。
线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的能量转换的重要细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。
细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动需要。
对细胞核和线粒体结构与功能的研究通常是在离体进行的，因而分离细胞核和线粒体是必须的。
差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心分离细胞核和线粒体。
在确定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。
在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
缓冲的蔗糖溶液是常用的悬浮介质，它属于等渗溶液，比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿B（Janus green B）活染法，对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中染料被还原成无色。
从植物细胞分离线粒体除了作线粒体功能测定外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因——线粒体DNA等目的。
分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差速离心。
06实验六--细胞器的分离与观察nj
六、实验报告
1. 线粒体提取分离过程中，为什么要在0～4℃进 行？
2. 要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离 和活性鉴定的过程中需注意哪些问题？根据你的实 际体会，写出操作注意事项及改进方法。
3. 分离介质 0.34mol/L及 0.88mol/L缓冲蔗糖溶 液哪一种在下层? 有什么作用?
细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异，因此不 同细胞器在介质中的沉降系数各不相同。根据这一原 理，常用不同转速的离心法来分离不同的细胞器。分 级分离的方法有差速离心和密度梯度离心两种。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆， 在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离， 其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三 步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组 成、理化特性及其功能的主要手段。
四、实验方法与步骤
1.细胞核的分离 （1）组织匀浆:将饥饿24h的大白鼠处死,立即剪开腹部, 迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水,洗去血污,用滤 纸吸干。称取0.5g肝组织,在小烧杯中剪碎,用预冷的 0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。将烧杯中的悬浮肝组织 倒入匀浆管中进行匀浆,匀浆过程要在冰浴中进行。匀 浆完毕,移入1.5ml离心管中。
洋葱内表皮细胞的线粒体分布
植物根尖液泡的中性红染色
三、材料和试剂
材料：小鼠的肝脏
器材：高速冷冻离心机、天平、显微镜、Eppendorf 管、冰块、冰盒、载玻片、盖玻片、玻璃匀浆器
试剂：生理盐水、0.25mol/L蔗糖溶液、 0.34mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、 0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、 95%乙醇溶液、丙酮、PBS液、 甲基绿-派洛宁染液、中性红-詹纳斯绿染液。
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细胞核与线粒体的分级分离
一、原理
细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不 同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括 组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的 主要手段。
匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即 0.25mol／L 蔗糖一 0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。
先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将 浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。
由于样品中各种大 小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯 的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。
分析 分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。
二、细胞核的分离提取
(一)操作步骤
1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有 0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。
2． 将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙 溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。
3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂 直插入管中， 上下转动研磨3～5次， 用3层纱布过滤匀浆液于离心管中， 然后制备一张涂片①， 做好标记， 自然干燥。
4．将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15分钟；(1)缓缓取上清液，移入 高速离心管中， 保存于有冰块的烧杯中， 待分离线粒体用； (2)同时涂一张上清液片②做好标记， 自然干燥；
(3)余下的沉淀物进行下一步骤。
5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟弃上清，将残 留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。
6．将①、②、③涂片用l％甲苯胺兰染色后盖片即可观察。
(二)结果
分别于高倍镜下观察三张涂片，描述镜下所见。
三、高速离心分离提取线粒体
(一)操作步骤
1．将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以 17000rpm 离心 20 分钟，弃上 清，留取沉淀物。
2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化钙液lml，用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20分 钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液混匀成 悬液(可用牙签)。
3．取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④、⑤涂片)，各滴一滴0.02％詹纳斯 绿B染液盖上盖片染20分钟。
(二)结果
油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。