实验五 细胞器的分离及纯化
实验五 双水相萃取及分配系数的测定
1.200g/mL。 ⑶ 按质量百分比配制3管（各8g,要求完全溶解，混合均匀）。
添加
顺序 管
PEG
PEG
40%
质量浓度5%
质量浓度10%
丙醇 磷酸钾 硫酸铵
双水相萃取的基本特点
(1) 体 系 有 生 物 亲 和 性 。 两 相 中 的 水 分 含 量 通 常 高 达 65%～90% ，所用的PEG、dextran等高聚物或磷酸盐、硫 酸盐等无机盐对蛋白质、核酸等生物活性物质无毒害，甚 至还有稳定保护作用，而且相界面张力比水-有机或有机有机两相体系的界面张力要小1～3 个数量级。由于生物 活性物质在有机溶剂中易变性，再加上有的生物活性物质 亲水性很强，不溶于有机溶剂，有机溶剂萃取等分离技术 难以在生物活性物质的分离中发挥其效能。
K=C1/C2
思考题：
1、常用双水相体系有哪些？双水相体系形成 的原因是什么？
2、影响双水相成相的因素有哪些？
双水相萃取概述
现代生物技术中，基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内 产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的 变化给固-液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能 对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们 在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃 取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶 束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。因 此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、 经济简便的、快速高效的分离纯化技术。其中双水相萃取 技术(又称水溶液两相分配技术)是近年来出现的引人注目、 极有前途的新型分离技术。
细胞生物学实验
二、实验原理
植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁而使原生质体释放出来。
原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。
选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。
将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。
利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀桨3-5min。
将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即是叶绿体(混有部分细胞核)。
二、实验原理
凝集素是一类含糖的(少数例外)并能与糖专一性结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果。
01
凝集素与糖分子结合有一定的专一性和结合价，并与细胞膜上受体的分布有关。
01
三、实验仪器
显微镜、粗天平、载玻片、滴 管、 离心管、离心机等.
用镊子撕去叶的下表皮，然后将叶放有酶液的培养皿或带盖三角瓶，每10ml酶液放2g叶片；
洋葱、小麦种子或黄豆幼根根尖
人口腔上皮细胞
五、实验内容与实施过程
1.人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察
1.人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察 清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上 ↓ 滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液 ↓ 用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞 ↓ 刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中 ↓ 染色10-l5min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液) ↓ 盖上盖玻片,显微镜下观察
分离细胞器的方法
分离细胞器的方法细胞器是细胞内的重要组成部分，其分离对于细胞学研究和生物医学应用具有重要意义。
本文将介绍几种常用的分离细胞器的方法，希望能够对相关研究和实验提供帮助。
一、超速离心法。
超速离心法是一种常用的分离细胞器的方法。
通过不同细胞器的离心沉降系数和大小差异，可以利用超速离心将细胞器分离。
首先，将细胞悬液置于离心管中，然后进行低速离心，使得细胞器在不同位置沉淀。
接着，将上清液取出，再进行高速离心，就可以得到不同细胞器的分离物。
二、密度梯度离心法。
密度梯度离心法是通过不同细胞器的密度差异进行分离的方法。
首先，制备不同浓度的密度梯度液，然后将细胞悬液加入密度梯度液上，进行超速离心。
在超速离心的作用下，细胞器会在密度梯度液中沉降到不同位置，从而实现细胞器的分离。
三、差速离心法。
差速离心法是通过不同细胞器在差速离心机上的不同离心速度进行分离的方法。
首先，将细胞悬液置于差速离心机中，然后根据不同细胞器的大小和密度差异，设置不同的离心速度和时间，从而实现细胞器的分离。
四、亲和层析法。
亲和层析法是通过利用生物分子之间的特异性相互作用进行分离的方法。
通过将特定的亲和层析填料与靶细胞器特异结合，然后通过洗脱等步骤，将目标细胞器从混合物中分离出来。
五、免疫沉淀法。
免疫沉淀法是通过利用抗体与抗原的特异性结合进行分离的方法。
首先，将抗体与抗原特异结合，然后通过沉淀或其他方法将目标细胞器分离出来。
综上所述，分离细胞器的方法有多种多样，可以根据实验需求和细胞器特性选择合适的方法进行分离。
希望本文介绍的方法能够为相关研究和实验提供帮助，促进细胞学领域的发展和应用。
[训练]实验五_叶绿体的分离与观察
![[训练]实验五_叶绿体的分离与观察](https://img.taocdn.com/s3/m/ad2eb1df5ebfc77da26925c52cc58bd631869388.png)
实验五叶绿体的分离与观察一、实验目的1. 通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
2. 观察叶绿体以及气孔、表皮细胞、保卫细胞的形态，加深对植物组织形态的了解。
二、实验原理将植物组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状、稠密度，也与离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L 氯化钠或0.4mol/L 蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
将匀浆液在1000 r/min 的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些末被破碎的完整细胞。
然后在3000 r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。
分离过程最好在0～4℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
三、实验用品(一) 材料:新鲜菠菜（二）器材:普通离心机、组织捣碎机、光学显微镜、500m1 烧杯2 个、250m1 量筒1 个、滴管10 支、纱布若干、载玻片和盖片等。
（三）试剂:0.35mol/L NaCl 溶液。
四、实验操作----游离叶绿体的制备与观察1、选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称20g 于100ml的0.35mol/L NaCl 溶液中，装入组织捣碎机。
2、利用组织捣碎机低速(5000 r/min)匀浆3～5min。
3、将匀浆液用200 目尼龙网或6 层纱布过滤，收集于500m1 烧杯中。
4、取滤液1.5m1 在1000 r/min 下离心2min。
弃去沉淀。
5、将上清液在3000 r/min 下离心5min。
弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核)。
实验五叶绿体的分离与观察
实验五叶绿体的分离与观察引言：叶绿体是植物和一些藻类细胞中的一种重要细胞器，其内含有叶绿素，参与光合作用，并且能够进行自我复制。
叶绿体的分离与观察可以帮助我们更好地理解叶绿体的结构和功能。
本实验旨在通过破碎叶绿体细胞壁和最后沉淀纯化，获得高纯度的叶绿体样品，并观察其形态和颜色。
材料与方法：1.植物叶片（如菠菜等）2.磨砂棒3.0.5MEDTA（乙二胺四乙酸二钠，含有金属离子螯合剂，可帮助破环细胞壁）4.磷酸盐缓冲液（PH=7.2）5.叶绿体离心管6.离心机7.色谱柱8.吲哚素（荧光指示剂）9.显微镜实验步骤：1.将大约10g的菠菜叶片放入研钵中，加入足够的磷酸盐缓冲液，用磨砂棒研磨，直至叶片完全破碎。
2.将研磨的混合物过筛，将过筛的悬浊液取出置于离心管中。
3.加入适量的0.5MEDTA溶液，溶液中EDTA的浓度约为0.3M，为了破坏细胞壁脱落细胞质中的叶绿体。
4. 将离心管放入离心机中，离心10分钟，以3000 rpm离心速度。
5.将上清液倒入新的离心管中。
6. 用磷酸盐缓冲液把上出来的树珪胶稀释为1 ml，用来测定叶绿素a含量，以叶绿素a含量/体积的值判断叶绿体的提纯程度。
7. 用离心机再一下离心10分钟，以5000 rpm离心速度，取出离心管，倒出上清液。
8.取少量草绿后的混合悬浊液加入色谱柱中，过滤，用于进行吲哚素荧光指示剂的观察和检测。
结果与讨论：通过实验操作，我们成功将叶绿体从菠菜叶片中分离出来，并获得了纯化程度较高的叶绿体样品。
在观察纯化后的叶绿体样品时，我们可以看到其呈现出绿色或草绿色。
这是因为叶绿体内含有大量的叶绿素，而叶绿素能够吸收光线中的蓝光和红光，反射绿光，因此使得叶绿体呈现出绿色。
此外，利用吲哚素荧光指示剂对叶绿体样品进行观察和检测，可以进一步确认我们所提取的物质是否为叶绿体。
吲哚素是一种常用的荧光指示剂，当其与叶绿体内的一些化合物结合时，会发出绿色荧光。
因此，如果我们在观察过程中观察到绿色荧光的出现，就可以确认叶绿体的存在。
高中生物细胞器的分离教案
高中生物细胞器的分离教案
课时：1课时
教学目标：
1. 了解细胞器的结构和功能；
2. 掌握生物学实验中的细胞器分离方法；
3. 提高学生的实验操作能力和综合分析能力。
教学重点和难点：
重点：细胞器的结构和功能，细胞器分离实验方法。
难点：细胞器的分离过程中的操作技巧和细胞器的鉴定。
教学准备：
1. 实验用具：显微镜、离心机、细胞破碎器、离心管、生理盐水、甘油等；
2. 实验材料：新鲜的细胞组织。
教学过程：
一、细胞器的介绍
1. 介绍细胞器的种类及其功能。
2. 展示细胞器的结构，让学生对细胞器有一个基本的了解。
二、细胞器分离实验
1. 实验步骤：
(1) 取新鲜的细胞组织放入细胞破碎器中；
(2) 加入生理盐水，用离心机进行离心，分离出细胞器；
(3) 将分离出的细胞器放入离心管中，用甘油处理；
(4) 观察分离出的细胞器。
2. 学生操作：
(1) 学生进行实验操作，观察细胞器的分离过程；
(2) 学生用显微镜观察分离出的细胞器，进行细胞器的鉴定。
三、讨论与总结
1. 讨论实验中的操作技巧和结果；
2. 总结细胞器分离实验的要点和注意事项。
四、作业
完成实验报告，包括实验目的、原理、步骤、结果及分析。
教学反思：
通过本节课的教学，学生对细胞器的结构和功能有了更深入的了解，同时也提高了实验操作能力和综合分析能力。
希望通过这样的教学方式，能够激发学生对生物学的兴趣，培养他们的实验技能和解决问题的能力。
细胞生物学实验复习
实验一、细胞膜的渗透性1. 细胞膜具有对物质选择透过的生理功能。
脂溶性越高通透性越大，水溶性越高通透性越小；非极性分子比极性容易透过，小分子比大分子容易透过。
水分子可通过由膜脂运动而产生的间隙。
非极性的小分子如O2、CO2、N2可以很快透过脂双层，不带电荷的极性小分子，如尿素、甘油等也可以透过人工脂双层，尽管速度较慢，分子量略大一点的葡萄糖、蔗糖则很难透过，而膜对带电荷的物质如：H+、Na+、K+、Cl–、HCO3 –是高度不通透的。
2.hemolysis（溶血现象）：渗入红细胞的溶质能提高红细胞的渗透压，使水进入细胞，引起细胞吸水胀破；即红细胞膜破裂，血红蛋白从红细胞中逸出的现象称为溶血现象。
3.i sotonic solution（等渗溶液）：渗透压与血浆渗透压相等的溶液称为等渗溶液。
4.Hypertonic solution（高渗溶液）：渗透压高于血浆渗透压的溶液称为高渗液。
5.Hypotonic solution（低渗溶液）：渗透压低于血浆渗透压的溶液称为低渗溶液。
6.semipermeable（半透性）：膜或膜状结构只允许溶剂(通常是水)或部分溶质(一般为小分子物质)透过，而不允许其他溶质(一般为大分子物质)透过的特性。
7.osmosis（渗透作用）：膜两侧溶液浓度存在差异，造成化学势能差，在势能差的驱动下，溶剂穿过对溶质不透膜的过程。
一、实验材料及作用：150 mmol/L NaCl , 蒸馏水，5 mmol/L NaCl，65 mmol/L NaCl，0.8 mol/L甲醇，0.8 mol/L 乙醇，0.8 mol/L丙醇，0.8 mol/L乙二醇，0.8 mol/L丙三醇，2%Triton X-100，氯仿(三氯甲烷)。
1.NaCl的作用：将正常红细胞悬浮于不同浓度的NaCI溶液中：等渗溶液中的红细胞保持正常大小和双凹圆碟形；渗透压递减的一系列溶液中，红细胞逐步胀大并双侧凸起，当体积增加30%时成为球形；体积增加45%～60%则细胞膜损伤而发生溶血，这时血红蛋白逸出细胞外，仅留下一个双凹圆碟形细胞膜空壳，称为血影细胞（ghost cell）。
实验五 叶绿体的分离
山东大学实验报告2013年3月12 日姓名李某某系年级同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体的分离、纯化与荧光观察学号201100140000【实验目的】1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法；2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
【实验原理】1.叶绿体分离原理匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。
差速离心：颗粒在离心场中的沉降速度取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的密度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速度不同，先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液中（0.35mol/L的氯化钠或0.4mol/L的蔗糖溶液）进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
分离过程最好在0~5℃的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。
2、差速离心特点：1.介质密度均一；2.速度由低到高，逐级离心。
用途：分离大小相差悬殊的细胞核、细胞器。
沉降顺序：细胞核—线粒体—溶酶体与过氧化物酶体—内质网与高尔基体—核蛋白体。
可将细胞器逐步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。
3、密度梯度离心密度梯度离心是用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中，这种离心技术又可分为速度沉降和等密度沉降两种，速度沉降主要用来分离密度相近而大小不同的物体，而等密度沉降用于分离密度不同的物体。
叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的，由于具有这一重要功能，所以它一直是植物生物学、细胞生物学和分子生物学的重要研究对象，叶绿体是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集，然后用密度梯度离心纯化，便可用于各种研究。
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2.菠菜叶叶绿体的分离
取去叶脉的新鲜菠菜5g于研钵内，加入 取去叶脉的新鲜菠菜 于研钵内，加入0.35mol/L NaCl 15ml研磨 于研钵内 研磨 ↓ 绿色的匀浆液用尼龙网（ 绿色的匀浆液用尼龙网（200目）过滤，滤液分别转入两只干净的离心 目 过滤， 管 ↓ 1000rpm离心 离心4min，除去沉淀 ， 离心 ↓ 上清液在高速低温离心机上以3000rpm离心 离心5min，所得沉淀即为叶绿体 上清液在高速低温离心机上以 离心 ， ↓ 液稀释， 用0.35mol/L NaCl液稀释，置冰箱中保存备用 液稀释 ↓ 在干净的载玻片上，滴一滴叶绿体悬液，加上盖玻片， 在干净的载玻片上，滴一滴叶绿体悬液，加上盖玻片，于显微镜下观察
It's over. Thanks!
差速离心法 速
differential centrifugation
速Leabharlann 分离匀浆离心 1 000G20分钟 分钟
细胞骨架
细 胞 核 离 心 10 000G 分 钟 20
细胞骨架
差 速 离 心 法
线 核 糖 体 等 离心0.26% 离心 15 000G20分钟 分钟 微 粒 体 离心 15 000G120分钟 分钟 粒 体 等
细胞器的分离、 实验五 细胞器的分离、 ——（细胞分级分离法） 纯化——（细胞分级分离法）
一、实验目的
• 掌握细胞器的分离及纯化的一般原 理和方法。 理和方法。 • 了解用细胞匀浆和差速离心的方法 分级分离细胞组分的原理及过程。 分级分离细胞组分的原理及过程。 • 熟悉离心机、匀浆器的使用方法。 熟悉离心机、匀浆器的使用方法。
↓
过滤液在低温高速离心机上2300rm离心10分钟、弃沉淀 过滤液在低温高速离心机上2300rm离心10分钟、 2300rm离心10分钟
↓
上清液在低温高速离心机上9950rm离心10分钟、弃上清 上清液在低温高速离心机上9950rm离心10分钟、 9950rm离心10分钟
↓
所留沉淀用匀浆介质液洗涤，仍以9950rm离心10分钟、 所留沉淀用匀浆介质液洗涤，仍以9950rm离心10分钟、弃上清 9950rm离心10分钟
二、实验原理
• 细胞内各种结构的比重和大小都不相同， 细胞内各种结构的比重和大小都不相同， 各种结构的比重和大小都不相同 在同一离心场内的沉降速度也不相同， 在同一离心场内的沉降速度也不相同，根 据这一原理，常用不同介质和不同转速的 据这一原理， 离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。 离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。 其过程包括组织细胞匀浆、 其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分 析三步，这种方法已成研究亚细胞成分的 析三步， 化学组成、理化特性及其功能的主要手段。 化学组成、理化特性及其功能的主要手段。 • 一般采用差速离心或密度梯度离心的方法 一般采用差速离心或密度梯度离心的方法 差速离心 得到分离细胞器。 得到分离细胞器。
缺点：
优点： 分离效果好，可一次获得较纯粒； 优点：①分离效果好，可一次获得较纯粒； 适应范围广， ②适应范围广，既能分离具有沉淀系差的颗 又能分离有一定浮力密度的颗粒； 粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；③颗 粒不会积压变形，能保持颗粒活性， 粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并止已 形成的区带由于对流而引起混合。 形成的区带由于对流而引起混合。 缺点： 离心时间较长； 需要制备梯度； 缺点：① 离心时间较长；②需要制备梯度；③ 操作严格，不宜掌握。 操作严格，不宜掌握。
三、实验用品
• 材料：新鲜菠菜 材料： • 器械：显微镜、高速低温离心机、普通离 器械：显微镜、高速低温离心机、 心机、 目的尼龙网、 心机、200目的尼龙网、漏斗、烧杯、组织 目的尼龙网 漏斗、烧杯、 研磨器等。 研磨器等。 • 试剂：线粒体离心匀浆介质； 试剂：线粒体离心匀浆介质； 0.05M Tris—HCl液体 液体 0.35mol/L NaCl
常见的离心机
相对离心场
• RCF = 1.119 x 10 ·(rpm) r
• • • RCF表示相对离心场 表示相对离心场 rpm表示离心机每分钟的转数 rpm表示离心机每分钟的转数 r 表示离心机转轴中心与离心管中心的距离
-5 2
由于离心管的位置由转（ 由于离心管的位置由转（rotor） ） 决定，因此r 决定，因此 必须由查阅相关 转子的参数而得。 转子的参数而得。
密度梯度离心法 density gradient centrifugation method 原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下， 原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，
颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。 颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
• 这个方法包括匀浆化、分级分离、分析三 这个方法包括匀浆化、分级分离、 个步骤。 个步骤。
• 匀浆化 ： 在蔗糖和其它的溶液中将细胞进行机械破碎。 在蔗糖和其它的溶液中将细胞进行机械破碎。 这就是细胞匀浆化， 这就是细胞匀浆化，而破碎物为细胞匀浆 。 • 分级分离：利用匀浆各组分的大小、形状、密度等的不同 分级分离：利用匀浆各组分的大小、形状、 来将其分离。 来将其分离。 • 分析 对用这样方法得到的各分离物进行化学分析， ： 对用这样方法得到的各分离物进行化学分析， 可以大大丰富细胞各种组分的结构和机能的知识。 可以大大丰富细胞各种组分的结构和机能的知识。
↓
将所得沉淀悬浮于0.5M、pH7.2甘露醇中， 将所得沉淀悬浮于0.5M、pH7.2甘露醇中，置冰箱备用 0.5M 甘露醇中
↓
将制备的线粒体悬液滴于干净载玻片上， B的0.25M蔗糖液染 将制备的线粒体悬液滴于干净载玻片上，用1%Janus Green B的0.25M蔗糖液染 色20min
↓
加上盖玻片，最好用相差显微镜镜检，观察。 加上盖玻片，最好用相差显微镜镜检，观察。
四、实验方法
1.玉米黄化幼苗线粒体的分离
将玉米黄化幼苗剪下，称约5g，在冰箱中放置1 将玉米黄化幼苗剪下，称约5g，在冰箱中放置1小时 5g
↓
将幼苗剪碎，倒入研钵，1:3比例加入PBS介质， 将幼苗剪碎，倒入研钵，1:3比例加入PBS介质，快速磨碎 比例加入PBS介质
↓
双层尼龙网过滤， 双层尼龙网过滤，出去残渣