细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍
支原体污染及其检测
支原体污染及其检测支原体污染在细胞培养中最为常见，培养体系中支原体污染的最可能途径是经已被支原体污染的细胞蔓延和传扬，据报道目前约有11％的二倍体细胞和传代细胞存在支原体污染；支原体污染的另一重要来源是培养液中加入了被支原体污染的血清。
支原体是一种介于细菌和病毒之间的能自立生活的微生物，它无细胞壁，形态呈多形性。
最小的支原体直径约200nm，可通过滤菌器。
支原体污染后培养基普通不发生混浊，细胞形态无显然变幻，但事实上细胞已受到各方面的潜在影响，如影响DNA合成，代谢减慢，生长被抑制等。
这种污染造成的危害较大，但支原体污染不易被发觉，因此对支原体的污染必需引起足够的重视，应严加防范。
支原体污染常用的检查办法如下。
1．形态学检查常用相差显微镜检测取洁净载玻片，滴加少许待检的细胞悬液，压上盖片，用相差显微镜油镜观看。
如有支原体污染，镜下可见暗色极小颗粒，类似布朗运动，可位于细胞表面或细胞之间。
要注重支原体与细胞破裂后溢出的内容物如线粒体等相区分。
电镜检测：用普通染色办法难以确定时，可用电镜检查。
详见电子显微镜技术一节。
2．支原体染色镜检支原体经低张处理后用地衣红染色观看，本法简便易行，不仅适用于检测支原体，亦可用于检查真菌和细菌。
【材料】 (1)待检疑有支原体污染的培养物； (2）检测用试剂：低张处理液（0.45%），Carnoy固定液（配方：60ml纯加30ml和10m1）,2％的地衣红染液（配方：2g地衣红，60ml加蒸馏水至100m1 )。
【办法】 (1)取材：吸取待检培养液1 ml, 500～800r/min，离心5分钟后去上清液，余留0.2m1备用。
(2）低张处理：用新奇配制的0.45％溶液0.2m1，加入上述待检标本中，静止低张处理10分钟，然后离心去上清液，留取沉淀物0. 2m1，涂片2～3张，晾干。
(3）固定：用新配制的Carnoy液固定2次，共10分钟。
(4）染色：将晾干的涂片用2％的地衣红染5分钟。
支原体清除实验
支原体清除实验支原体污染是细胞培养过程中的常见现象。
细胞被支原体污染之后，在显微镜下无法直接观察到，生长状态可能发生或不发生改变，因此一般不易被察觉。
但是支原体会改变细胞的很多生长参数，因而极易对后续实验造成影响，所以对支原体污染的检测和清除非常重要。
以下为一次支原体检测和清除的实例。
材料：细胞系：SH-SY5Y支原体PCR检测试剂盒：Myco-P-20 (上海炎熙生物 )支原体清除剂：Myco-E-1 (上海炎熙生物 )方法与结果：1，将已检测出有支原体污染的SH-SY5Y细胞以正常传代密度铺到6孔板中，一个孔加清除剂，作为测试孔，另一孔不加清除剂，作为阴性对照孔。
两孔之间间隔一个孔，以免互相污染。
2，在清除支原体的过程中细胞以常规方法传代培养，并使细胞在培养过程中一直处于清除剂的作用下。
在加清除剂后第4、8、9、11天各取1毫升培养上清。
每份上清与细胞已共培养48小时，除第9天的上清只共培养了24小时。
3，将这些培养上清在16000g离心5分钟，小心去除离心上清，将沉淀用无菌PBS洗三次，每次以16000g离心5分钟。
最后获得的沉淀用100微升纯水重悬，在100℃水浴中孵育5分钟，然后用于PCR反应。
4，按照支原体检测试剂盒Myco-P-20的说明书进行PCR检测操作，结果如下：4.1，与对照样品共同反应，用这种方式可以判断是否出现了假阴性结果。
在加清除剂后第4天的样品中仍可见到支原体阳性条带（约440bp），在第8、9、11天的样品中，已看不到支原体阳性条带。
4.2，不加对照样品，检测样品单独反应，用这种方式可以提高测试灵敏度。
可见在第8天和第9天的样品中，支原体阳性条带仍然出现，但是弱于第4天的样品。
在第11天的样品中，有明显的200bp以下的非特异的条带，且亮度高于阳性条带，所以判断此时的PCR产物是非特异反应的产物，样品中已没有支原体DNA。
注释：由于PCR是一种非常灵敏的检测方法，所以很容易出现假阳性条带。
支原体污染检测试剂盒(PCR法)
Taq DNA Polymerase 0.5 μL
ddH2O up to 50 μL
（3）．轻轻混匀，2000rpm离心20s；
（4）．进行PCR扩增
PCR扩增条件：
94°C，5min；
94°C，30 sec；55°C，2min；72°C，1 min；32 Cycles；
Taq DNA Polymerase 0.5 μL
ddH2O up to 50 μL
（3）．轻轻混匀，2000rpm离心20s；
（4）．进行PCR扩增
PCR扩增条件：
94°C，5min；
94°C，30 sec；55°C，2min；72°C，1 min；32 Cycles；
2.PCR反应
第一步PCR：
50μL体系PCR反应（如客户需要使用更小量的反应体系，试剂加样量按比例进行减少）：
（1）．使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s；
（2）．取灭过菌的0.2mL离心管，在冰上依次加入
10×Taq Buffer 5 μL
72°C，10 min，
第二步PCR：
50μL体系PCR反应（如客户需要使用更小量的反应体系，试剂加样量按比例进行减少）：
（1）．使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s；
（2）．取灭过菌的0.2mL离心管，在冰上依次加入
10×Taq Buffer 5 μL
பைடு நூலகம்72°C，10 min，
3.反应结束后，取反应液10μL进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。
4.根据感染支原体类型的不同，扩增产物大小有所不同，第一步PCR产物在350～700bp 之间，第二步PCR产物在150～250bp之间。
支原体污染的检测方法
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
细胞被支原体污染后，不论从外观上有无变化，均会严重的影响各种实验的结果。被支 原体感染的细胞其正常的生长和代谢会受到影响。部分细胞虽然表面变化不十分明显，实际 上潜伏着多方面的危险。而细胞重组表达的蛋白质，其活性也会受到影响，甚至完全失去活 性。支原体可以通过消耗培养基中的精氨酸，抑制细胞 DNA、RNA 的合成，降低细胞的抵抗 力。支原体感染会对细胞造成的影响是多方面的：包括代谢、免疫或生化特性、生长状况、 酶的作用途径、细胞膜的组成、染色体结构、转染效率、以及细胞存活等多方面的改变。因 此，支原体污染会对培养细胞的分子水平研究带来偏差或假阳性的实验结果。
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电话：021-33921235 邮箱：bestbio@ 传真：021-60853530
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产品说明书
菌群）、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制 备细胞的原始组织或器官的污染。支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支 原体。
贝博支原体检测试剂盒为预防或清除细胞培养过程中支原体污染而精心研发的一个高 效的支原体检测产品。该产品能快速检测细胞是否有支原体污染。本产品可以为科研、生产 中的细胞培养工作提供有力的安全保障，防止和解决细胞污染带来的各种成本浪费。
支原体试检测剂盒使用说明书(中文版)
支原体检测试剂盒使用说明书1.试剂：支原体检测试剂盒由武汉源深生物科技有限公司提供。
2.实验方法:巢式PCR的方法检测支原体污染：A.待检细胞汇合率在90％以上时取100 µL细胞上清液到离心管内B.95o C孵育5分钟C.短暂高速离心15秒钟左右D.试剂盒里的组份：引物混合物(Primer Mix) 20 µL阳性对照DNA (Positive Control DNA) 15 µL阴性对照(Internal Control DNA) 20 µL巢式PCR一共需要做2轮PCR，本检测方法不受其他来源（如所培养细胞）DNA的影响，不但提高了检测的灵敏度，同时也提高了特异性。
(1)第一轮PCR:PCR 混合物：向0.2 mL PCR薄壁管中依次加入以下组分，盖紧管盖，轻弹管壁混匀，稍加离心。
E.热循环程序：将准备好的PCR管放入PCR仪，运行如下程序。
PCR 混合物：向0.2 mL PCR薄壁管中依次加入以下组分，盖紧管盖，轻弹管壁混匀，稍加离心。
F. 热循环程序：将准备好的PCR 管放入PCR 仪，运行如下程序。
试验结果：2％ 琼脂糖凝胶电泳，TBE 缓冲液，PCR 产物及Marker 均点样10µL ，于50V 下电泳1hr ，EB 染色15min ，紫外灯下观察。
电泳结果见下图：图中泳道M 为DNA Marker ，1和2为待检测细胞系的第一轮PCR 产物 (1st )，3和4为待检测细胞系的第二轮PCR 产物 (2nd ), 其中1、3为阳性对照管PCR 产物，2、4为阴性对照PCR 产物。
阳性对照管在200bp 左右，和300-400 bp 处各有一条带，证明本次实验准确可靠 (不同的支原体Mycoplasma, such as M. fermentans, M. hyorhinis, M. arginini, M. orale, M. hominis, M. arthritidis, M. hyopneumoniae and Acholeplasma laidlawii 的保守区的片段长度不一，大概在200-400 bp 之间)。
细胞培养中支原体污染的检测方法
细胞培养中支原体污染的检测方法由于细胞支原体污染的隐蔽性及对细胞的严重影响，细胞的支原体污染已经成为了一个比较棘手的世界性难题。
实验室新引进的细胞，应该比较采取一定的方法检疫确定没有支原体污染才能使用。
为了提高动物细胞培养生物制品的质量和安全性，中华人民共和国药典规定主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞应进行支原体检测。
美国食品药品监督管理局(FDA)强烈建议，应该用合适的方法检测细胞的支原体污染状况。
欧洲药典European Pharmacopoeia(EP,7 the dition,Section2.6.7.)规定对细胞治疗产品需要进行严格的支原体检测。
提高对支原体污染的警惕，坚持定期做支原体的检测，努力杜绝污染。
所以寻找一种快速简单灵敏的方法进行细胞支原体常规检测就显得尤为重要。
2017年先达基因（）研发了一种细胞污染支原体检测试剂盒，每次检测只需半个小时，减少了很多工作量，其原理是基于其自主研发的恒温核酸检测技术（ERA），结合恒温荧光定量检测仪，可以在恒定的低温下（25℃-42℃）对痕量的支原体种内保守性DNA 片段进行特异性的扩增，扩增反应可以在20min内完成，该试剂盒检测范围涵盖130种支原体，实现了快速、简单、灵敏的进行细胞支原体常规检测。
1956年，Robinson等首次发现细胞培养物中的支原体污染以来，对其形态、繁殖、分类、体外培养、细胞膜结构和膜蛋白分析、代谢途径等方面都进行了深入研究。
1995年10月，来自马里兰盖瑟斯堡的基因组研究协会(TIGR)与位于ChapelHill的北卡罗来纳州立大学的团队合作，共同完成生殖支原体全基因组580kb测序，这也是人类首次完成支原体全基因组测序的，随后RichardHerrma实验室完成了肺炎支原体全基因组800kb的测序，使得支原体的检测进入分子检测领域成为可能。
到目前为止，出现了很多支原体的检测方法，有传统检测方法（包括直接培养法和DNA荧光染色法）、ATP酶法、免疫法（ELISA法等）以及分子诊断方法（包括普通PCR和荧光PCR、LAMP，重组酶扩增技术等），这些技术在检测时间，检测准确性，灵敏度和特异性上有不同的差别。
支原体检测方法有哪些
支原体检测方法有哪些
支原体是一类细菌，常引起呼吸道感染、性传播疾病和眼部感染等，支原体感染的确诊通常需要进行相应的检测。
常用的支原体检测方法包括：
1. 核酸扩增技术：常见的包括PCR（聚合酶链反应）和实时荧光PCR。
通过使用特异性引物和荧光探针来扩增和检测支原体的特定基因片段。
2. 培养法：将患者样本进行细菌培养，然后观察和鉴定培养出的菌落。
这种方法通常需要较长的培养时间，并且对支原体种类有一定的限制。
3. 免疫学方法：包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光染色法等，通过检测患者血清中的特异性抗体来判断是否感染了支原体。
4. 细胞培养法：将患者样本中的细胞培养，然后观察和鉴定培养出的细胞是否被支原体感染。
这种方法通常需要较长的培养时间，并且对细胞的感染敏感性较高。
5. 蛋白质检测法：通过检测患者样本中的特定支原体蛋白质的存在来判断是否感染了支原体。
需要注意的是，不同的检测方法有其各自的特点和应用范围，医生会根据具体情况选择合适的方法来进行支原体的检测。
支原体染色试剂盒
支原体染色检测试剂盒简介：支原体染色检测试剂盒(Mycoplasma Stain Assay Kit)是一种经典的利用DNA 荧光染色法检测支原体污染的试剂盒，其原理是当细胞发生凋亡时，染色质会固缩，Hoechst 染色后在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白。
Hoechst Staining Kit 经常用于培养的贴壁或悬浮细胞以及组织切片的细胞凋亡检测。
该试剂盒检测细胞含量范围一般为0.1～1×106之间。
组成：操作步骤(仅供参考)：(一)贴壁细胞1、取洁净盖玻片在70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用无菌的PBS 或生理盐水洗涤3次，再用细胞培养液洗涤1次。
将盖玻片置于6孔板或其他培养皿内，接种细胞培养过夜，使融合率约为50%～80%。
2、加入干预条件使细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入Hoechst 固定液固定。
3、去除固定液，用PBS 或生理盐水洗2次，吸尽液体。
4、加入Hoechst 染色液孵育。
也宜用摇床，或手动晃动数次。
5、弃染色液，PBS 或生理盐水洗2次。
6、滴一滴抗荧封片剂于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片剂，避免气泡。
(二)悬浮细胞1、离心收集细胞样品于1.5ml 离心管内并弃液，加入Hoechst 固定液，缓缓悬起细胞，固定10min 或更长时间(亦可4℃过夜)。
2、低速离心去除固定液，用PBS 或生理盐水洗2次，每次3min 。
洗涤时手动晃动数次。
3、低速离心离心后吸去大部分液体保留约50μl 液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。
编号 名称 DA0140 100T Storage 试剂(A): Hoechst 固定液 50ml RT 试剂(B): Hoechst 染色液 50ml -20℃ 避光 试剂(C): 荧光封片剂 5ml 4℃ 避光 使用说明书 1份4、稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。
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细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍
（2016年10月16日）
哺乳动物细胞的培养，支原体（Mycoplasma）污染是个世界性的问题。
支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误。
从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。
相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。
目前，细胞支原体污染常用的支原体检测方法主要有：
一、培养法
●原理：将待检测样品先接种到支原体液体培养基中大量繁殖，然后再转
接种到支原体固体培养基中，培养一段时间后（大约一个月），如果固体
培养中，出现典型的支原体菌落，则说明待测样品有支原体污染。
●优点：支原体培养法是相对可靠的支原体检测技术，也是我国药典认可
的方法之一。
●缺点：（1）培养法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支
原体污染的快速检测；（2）通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最
常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。
这是因为猪鼻支原体无
法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。
而猪鼻支原体约占所有细胞
支原体污染的20-50%。
●《培养法支原体检测试剂盒》》主要厂家：读者可以根据《中国药典》中
收录的培养法支原体检测方法进行操作。
二、荧光染色法
●原理：将待检测样品接种到专门的指示细胞（如：Vero细胞）中，培
养一段时间后，用DNA荧光染料（如：Hoechst 33258，DAPI）进行染色，
如果除了细胞核被染色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被荧光染料
染色，那么这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA。
●优点：荧光染色法也是我国药典认可的方法之一。
●缺点：（1）该方法灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污
染；（2）需要用到专门的指示细胞（如：Vero细胞），如果不用指示细
胞而直接对目标细胞进行荧光染色，由于每种细胞繁殖和吸附支原体的
能力差异极大，检测的准确性将比用Vero等指示细胞进行检测要低得多；
（3）该方法严重依赖实验人员的经验，可重复性较差。
●《荧光染色法支原体检测试剂盒》主要厂家：读者可以根据《中国药典》
中收录的荧光染色法支原体检测方法进行操作。
三、PCR法
●原理：设计支原体特意的引物，进行PCR扩增。
●优点：（1）快速，往往只需几小时；（2）可检测的支原体种类较多；（3）
目前，该方法是细胞培养液中支原体污染检测的常规方法之一。
●缺点：（1）整个过程大约需要3个小时；（2）由于细胞培养数天后，培
养液中经常含有严重抑制PCR扩增的代谢物，所以样品的前处理一般是
PCR法不可或缺的环节；（3）PCR产物的电泳，需要用到EB等潜在的致
癌物质；（4）需要用到PCR仪、电泳槽、凝胶成像仪、离心机等仪器；
（5）存在假阳性和假阴性。
●《PCR法支原体检测试剂盒》主要厂家：（1）Sigma公司的LookOut
Mycoplasma PCR Detection Kit（货号：MP0035），价格：价格：3469
元/24次；（2）上海易色医疗科技有限公司的《PCR法支原体检测试剂盒》，
货号：PM008；价格：1000元/100次；（3）以色列Biological Industries
（BioInd）公司的EZ-PCR Mycoplasma Test Kit，货号：20-700-10，
价格：约1000元/10次。
四、RD-RCA恒温扩增法
●原理：这个是上海易色医疗科技公司依托其RD-RCA恒温扩增技术开发的
支原体检测产品，产品名称：《一步法恒温支原体检测试剂盒》。
该产品
非常具有特色，详细原理可以访问其网站了解。
●优点：《一步法恒温支原体检测试剂盒》使用独特的RD-RCA恒温基因扩
增技术，彻底解决了上述PCR法的缺点：（1）整个检测过程只需1小时，
大大缩短了检测时间；（2）细胞培养液中的PCR抑制剂，不会抑制该产
品的恒温基因扩增，所以任何情况下都无需样品的前处理；（3）恒温基
因扩增的灵敏度是PCR法的10-1000倍，检测只需使用1μL的细胞培养
液，无需样品的离心浓缩或者进行支原体DNA的抽提；（4）恒温基因扩
增的产物无需电泳，可以通过指示剂的颜色变化直接肉眼判断反应结果；
（5）无需用到PCR仪、电泳槽、凝胶成像仪、离心机等仪器，整个检测
过程只需一个水浴锅。
●缺点：该产品只能保证认识最常见的污染细胞的13种支原体，虽然这
13种支原体大约占污染细胞的支原体种类的99%左右。
但是，不排除《一
步法恒温支原体检测试剂盒》无法识别个别在体外细胞培养中出现概率
极低的支原体。
●《RD-RCA恒温扩增法支原体检测试剂盒》主要厂家：据笔者了解，目前
只有上海易色医疗科技公司生产《一步法恒温支原体检测试剂盒》，货号：MD001，价格大约15-19元/次
五、酶活法
●原理：通过检测支原体特异性ATP合成相关酶的活性。
●优点：（1）支原体识别率高，100多种支原体，只有1种不能识别，而
不能识别的这种支原体几乎不会出现在体外培养的细胞中；（2）可以区
分支原体的死活；（3）不存在假阳性和假阴性；（4）检测时间短，整个
检测过程只需25分钟。
●缺点：需要用到具有发光检测功能的多功能酶标仪或独立的发光检测仪。
●《酶活法支原体检测试剂盒》主要厂家：（1）上海易色医疗科技有限公
司的《发光法支原体检测试剂盒》，货号：LM009；价格：1250元/50次。
（2）Lonza公司的 MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit，货号：
LT07-710；价格：大约10000元/100次。
总结：以上每种支原体检测方法各有优缺点，大家应该根据自己试验的需要和实验室条件进行选择。
此外，作为支原体检测领域的共识，单独使用目前市面上的任何一种支原体检测试剂盒和检测方法，都无法做到100%正确，既不会漏检（假阴性），也不会多检（假阳性）。
严格的支原体检测，至少需要使用两种，最好使用三种不同原理的支原体检测方法同时进行检测，才能使检测结果接近100%正确。