支原体污染的检测方法
支原体污染及其检测
支原体污染及其检测支原体污染在细胞培养中最为常见，培养体系中支原体污染的最可能途径是经已被支原体污染的细胞蔓延和传扬，据报道目前约有11％的二倍体细胞和传代细胞存在支原体污染；支原体污染的另一重要来源是培养液中加入了被支原体污染的血清。
支原体是一种介于细菌和病毒之间的能自立生活的微生物，它无细胞壁，形态呈多形性。
最小的支原体直径约200nm，可通过滤菌器。
支原体污染后培养基普通不发生混浊，细胞形态无显然变幻，但事实上细胞已受到各方面的潜在影响，如影响DNA合成，代谢减慢，生长被抑制等。
这种污染造成的危害较大，但支原体污染不易被发觉，因此对支原体的污染必需引起足够的重视，应严加防范。
支原体污染常用的检查办法如下。
1．形态学检查常用相差显微镜检测取洁净载玻片，滴加少许待检的细胞悬液，压上盖片，用相差显微镜油镜观看。
如有支原体污染，镜下可见暗色极小颗粒，类似布朗运动，可位于细胞表面或细胞之间。
要注重支原体与细胞破裂后溢出的内容物如线粒体等相区分。
电镜检测：用普通染色办法难以确定时，可用电镜检查。
详见电子显微镜技术一节。
2．支原体染色镜检支原体经低张处理后用地衣红染色观看，本法简便易行，不仅适用于检测支原体，亦可用于检查真菌和细菌。
【材料】 (1)待检疑有支原体污染的培养物； (2）检测用试剂：低张处理液（0.45%），Carnoy固定液（配方：60ml纯加30ml和10m1）,2％的地衣红染液（配方：2g地衣红，60ml加蒸馏水至100m1 )。
【办法】 (1)取材：吸取待检培养液1 ml, 500～800r/min，离心5分钟后去上清液，余留0.2m1备用。
(2）低张处理：用新奇配制的0.45％溶液0.2m1，加入上述待检标本中，静止低张处理10分钟，然后离心去上清液，留取沉淀物0. 2m1，涂片2～3张，晾干。
(3）固定：用新配制的Carnoy液固定2次，共10分钟。
(4）染色：将晾干的涂片用2％的地衣红染5分钟。
支原体检测方法有哪些
支原体检测方法有哪些
支原体检测方法主要有以下几种：
1. PCR法：即聚合酶链反应，在医学领域中被广泛应用于病原体的检测。
PCR法可以通过扩增病原体DNA的特定片段来检测支原体的存在与否。
该方法具有高灵敏度和高特异性。
2. 培养法：支原体可以在特定培养基中进行培养和繁殖。
通过将样品涂布到培养基上，培养一定时间后观察培养基上是否有支原体的生长，从而判断有无感染。
3. 免疫学检测法：包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光法等。
这些方法通过检测患者血清中的特定抗体或抗原来判断是否感染支原体。
4. 基因测序法：通过对支原体基因组进行测序，可以准确确定其种类和亚型，进而进行分子流行病学研究和溯源分析。
5. 免疫组化方法：利用特定抗体对支原体进行染色，通过显微镜观察标记物的分布和形态特征来检测支原体的存在。
以上是常用的支原体检测方法，每种方法都有其适用的场景和优缺点。
儿童支原体检测方法
儿童支原体检测方法
儿童支原体的检测方法主要有以下几种：
1. 喉拭子检测法：通过用棉签或拭子在儿童的喉部刮取样本，然后将样本送往实验室进行检测。
这种方法可以检测儿童的支原体感染，尤其适用于儿童咽喉部有炎症症状的情况。
2. 尿液检测法：通过收集儿童清晨第一次小便的尿液样本，然后送往实验室进行检测。
这种方法可以检测儿童的尿液中是否存在支原体感染。
尿液检测法在幼儿中应用较广，操作简单，无创伤。
3. 血清学检测法：通过采集儿童的静脉血，然后检测血清中的特异性支原体抗体水平。
这种方法可以检测儿童是否曾经感染过支原体，并且可以区分活动感染和既往感染。
4. 分子生物学检测法：通过采集儿童的咽拭子样本，然后通过PCR等分子生物学技术检测支原体的核酸。
这种方法可以快速、准确地检测儿童是否感染了支原体，并且可以确定感染的支原体亚型。
需要注意的是，具体使用哪种方法进行儿童支原体的检测取决于临床情况和实际需要，医生会根据患儿的症状和体征来决定使用哪种方法进行检测。
PCR方法 支原体检测
PCR检测支原体方法如下：
1、吸取待检细胞的培养液100ul，转移入无菌的1.5ml 离心管中。
请注意：待检
细胞必须换液24小时以上，否则会有假阴性结果。
2、将盛有100ul待检培养液的 1.5ml 离心管用金属浴或空气浴在95℃加热
5min。
请注意：加热过程中，要保持离心管的盖子是盖紧的。
（因为在加热时，盖子会自己崩开，可以在离心管上放置书本之类的物品压住盖子）
3、高速离心，13200rpm，1min。
4、配制PCR反应体系：
1）待检样品数量+1个阳性对照+1个阴性对照=总的样品数量。
2）阳性对照是以往确定被支原体污染的样品，阴性对照是灭菌超纯水。
3）PCR反应体系：
H2O（灭菌超纯水）13 ul
Buffer 10×（必须含Mg2+） 2 ul
dNTP0.8 ul
Primer(+) (10uM)0.5 ul
Primer(-)(10uM)0.5 ul
Polymerase0.2 ul
Sample 3 ul
4)PCR反应程序：
94℃2min
94℃30sec
55℃30sec
72℃20sec
GOTO step 2 , 36 times
72℃7min
5、配制2%的琼脂糖胶，上样量5-10ul。
6、20-30min后观察结果，阳性条带在200-300bp。
引物序列：
Primer(+)：’GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT3’
Primer(-)：5’TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC3’。
细胞培养中支原体污染的检测方法
细胞培养中支原体污染的检测方法由于细胞支原体污染的隐蔽性及对细胞的严重影响，细胞的支原体污染已经成为了一个比较棘手的世界性难题。
实验室新引进的细胞，应该比较采取一定的方法检疫确定没有支原体污染才能使用。
为了提高动物细胞培养生物制品的质量和安全性，中华人民共和国药典规定主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞应进行支原体检测。
美国食品药品监督管理局(FDA)强烈建议，应该用合适的方法检测细胞的支原体污染状况。
欧洲药典European Pharmacopoeia(EP,7 the dition,Section2.6.7.)规定对细胞治疗产品需要进行严格的支原体检测。
提高对支原体污染的警惕，坚持定期做支原体的检测，努力杜绝污染。
所以寻找一种快速简单灵敏的方法进行细胞支原体常规检测就显得尤为重要。
2017年先达基因（）研发了一种细胞污染支原体检测试剂盒，每次检测只需半个小时，减少了很多工作量，其原理是基于其自主研发的恒温核酸检测技术（ERA），结合恒温荧光定量检测仪，可以在恒定的低温下（25℃-42℃）对痕量的支原体种内保守性DNA 片段进行特异性的扩增，扩增反应可以在20min内完成，该试剂盒检测范围涵盖130种支原体，实现了快速、简单、灵敏的进行细胞支原体常规检测。
1956年，Robinson等首次发现细胞培养物中的支原体污染以来，对其形态、繁殖、分类、体外培养、细胞膜结构和膜蛋白分析、代谢途径等方面都进行了深入研究。
1995年10月，来自马里兰盖瑟斯堡的基因组研究协会(TIGR)与位于ChapelHill的北卡罗来纳州立大学的团队合作，共同完成生殖支原体全基因组580kb测序，这也是人类首次完成支原体全基因组测序的，随后RichardHerrma实验室完成了肺炎支原体全基因组800kb的测序，使得支原体的检测进入分子检测领域成为可能。
到目前为止，出现了很多支原体的检测方法，有传统检测方法（包括直接培养法和DNA荧光染色法）、ATP酶法、免疫法（ELISA法等）以及分子诊断方法（包括普通PCR和荧光PCR、LAMP，重组酶扩增技术等），这些技术在检测时间，检测准确性，灵敏度和特异性上有不同的差别。
一种快速判定细胞培养中支原体污染的方法——瓜氨酸测定法
．
技 术 方 法
一
种快速判定细胞培养 中支原体污染 的方法——瓜氨酸测定法
梁少东 ， 黄小 乐 ， 媛 ， 琴 ， 严 杨 肖成祖
广 州 铭 康 生物 工 程 有 限公 司 ， 东 广 州 ５ ０ ３ 广 １７ ０ 【 要 ］ 目 的 ： 发 一 种 简便 、 摘 开 快速 、 及 时发 现 细 胞 培 养 中支 原体 污 染 的方 法 。 法 ： Ｈ Ｌ 能 方 用 Ｐ Ｃ检 测 细 胞培 养 中瓜 氨 酸 是 否 存 在 及 其量 的大 小 。 结 果 ： 当细 胞 培 养 被 支 原 体 污 染 时 ， 养 基 中精 氨酸 量 明 显下 降 ， 培 同时 有瓜 氨酸 出现 ； 当支 原体 被 消 除 后 ， 氨 酸 即消 失 。 论 ： 细胞 培 养 中瓜 氨 酸 的 出现 与支 原 体 污 染 的关 系是 特 异 的 ， Ｈ Ｌ 在 ２ ｈ内 即可 检 出， 明该 方 瓜 结 在 用 ＰＣ 表 法可 靠 、 便 、 简 快速 ， 可作 为细 胞 培 养 过 程 中支原 体 污 染 的 常规 监测 手 段 。 【 键 词 ］ 细胞 培 养 ； 原 体 污 染 ； 氨 酸 ； 氨 酸 脱 亚 氨 酶 ； 效 液相 色谱 关 支 瓜 精 高
ｗａ ａ ａ ｒ ｇ ｌ ｒ ｉ ｓ ｃｉ ｎ ｆ ｒ ｍｙ ｐｌｓ ｏ ａ ｉａ ｉｎ． ｙ ｓ ｅ ｕ ａ ｎ ｐｅ ｔｏ ｏ ｃｏ ａ ｍａ ｃ ｎｔｍ ｎ ｔｏ
［ ｙｗｏｄ ］ ｃｌ ｃｌ ｒ； ｙｏ ｌ ｍ ｏ ｔ ｎｔ ｎ ｃ ｒｌｎ ；ａ ｉ ｎｄｉ ｉａｅ Ｈ Ｌ Ｋｅ ｒ ｓ ｅ ｕｔ ｅ ｍ ｃｐａ ａｃｎａ ａｉ ； ｉｕｌ ｅ ｒ ｎ ｅｅｍ ｎｓ； Ｐ Ｃ ｌ ｕ ｓ ｍｉ ｏ ｔ ｉ ｇｉ
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支原体检测PCR方法
PCR法检测支原体实验原理：通过对支原体特定的序列设计引物，当存在支原体污染时通过PCR特异性扩增，会将目标DNA特异性的复制，然后通过琼脂糖电泳观检测，会跑出条带出现阳性结果。
反之当没有支原体污染时，由于没有模板，PCR无法扩增，则琼脂糖电泳跑不出条带，出现阴性结果，为确保PCR法的精确性，故需要找到最优的PCR 条件在进行检测。
实验目的：检测培养的细胞是否有支原体污染。
实验材料：0.5ml EP管；PCR管；镊子；手套；口罩；EP管架；移液枪（100ul，10ul）及配套枪头(黄、白)；dd H2O；上下游引物（两组）；dNTPs；10x Buffer；Easy Taq；冰盒；琼脂糖；锥形瓶（200ml）；量筒（50ml）；全套琼脂糖电泳设备（电泳槽，制胶槽，梳子，电源输出）；凝胶成像系统；PCR引物：LZY-5Myco universal F：GGGGAATGGGTGAGTAACACGLZY-5Myco universal R：CGGATAACGCTTGCGACCTATG产物大小：500bpLZY-6mycotest F：GGGAGCAAACAGGATTAGTATCCCTLZY-6mycotest R：TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC产物大小：250bp实验步骤：1、取样：直接取培养细胞的培养基上清。
2、PCR（为25ul体系）1、配制反应体系，根据检测样本数+1个阴性对照（水）+1个阳性对照，算出PCR样本的个数，在此基础上增加几管的量，把除检测培养基外的其他组分按计算好的量加到一起，混匀后分装，最后加入检测培养基。
25ul反应体系5#引物：LZY-5Myco universal反应体系反应条件检测培养基1ul94℃3minLZY-5-F0.5ul94℃30sLZY-5-R0.5ul55℃30s10xBuffer 2.5ul72℃30sdNTP0.5ul25cycles或30cycles Easy Taq0.5ul72℃10min ddH2O19.5ul6#引物：LZY-6mycotest反应体系反应条件培养基1ul94℃3minLZY-5-F0.5ul94℃30sLZY-5-R0.5ul51℃30s10xBuffer 2.5ul72℃20sdNTP0.5ul35cyclesEasy Taq0.5ul72℃5minddH2O19.5ul3.琼脂糖凝胶的制备1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。
支原体检测方法
支原体检测方法
一、抗体检测
1、采用抽血取样
2、检测肺炎支原体IgM、IgG抗体。
由于肺炎支原体IgM 抗体在感染后一周出现，因而此阶段就诊患者可以选择抗体检测。
3、IgM现症感染,IgG是既往感染。
二、抗原检测
1、采用咽拭子取样，即“捅嗓子”
2、PCR法检测支原体的方法最为快速、灵敏、取样量少，既可做细胞本身，也可做细胞上清的检测，同时可以检测多种支原体的污染，是目前常用的检测手段。
但其成本较高，条件要求严格，且有时易出现假阳性或假阴性。
弥补的方法是对怀疑的样品要经过3 次PCR 检测，或用培养法检测。
三、扫描电子显微镜法
1、扫描电子显微镜法非常直观、准确，对使用环境要求高，操作复杂，实验周期较长，常作为样品的最后定性检测。
四、培养法
1、为最为经济可靠的方法，但其实验周期较长，所以常用来进行对怀疑细胞的最后甄别。
常用于细胞及临床治疗细胞的支原体检查。
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本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
细胞被支原体污染后，不论从外观上有无变化，均会严重的影响各种实验的结果。被支 原体感染的细胞其正常的生长和代谢会受到影响。部分细胞虽然表面变化不十分明显，实际 上潜伏着多方面的危险。而细胞重组表达的蛋白质，其活性也会受到影响，甚至完全失去活 性。支原体可以通过消耗培养基中的精氨酸，抑制细胞 DNA、RNA 的合成，降低细胞的抵抗 力。支原体感染会对细胞造成的影响是多方面的：包括代谢、免疫或生化特性、生长状况、 酶的作用途径、细胞膜的组成、染色体结构、转染效率、以及细胞存活等多方面的改变。因 此，支原体污染会对培养细胞的分子水平研究带来偏差或假阳性的实验结果。
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电话：021-33921235 邮箱：bestbio@ 传真：021-60853530
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产品说明书
菌群）、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制 备细胞的原始组织或器官的污染。支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支 原体。
贝博支原体检测试剂盒为预防或清除细胞培养过程中支原体污染而精心研发的一个高 效的支原体检测产品。该产品能快速检测细胞是否有支原体污染。本产品可以为科研、生产 中的细胞培养工作提供有力的安全保障，防止和解决细胞污染带来的各种成本浪费。
产品号 BB-4104 BB-4105 BB-4106 BB-4107 BB-4108 BB-4112 BB-4123 BB-4137 BB-4132estbio@ 传真：021-60853530
产品简介： 支原体是一种大小仅为 0.2~0.3 μm，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 μm）的
原核生物，在细胞培养过程中，支原体感染发生率达到 63%，因而细胞培养过程中被支原 体污染是一个世界性的难题。当细胞（特别是传代细胞）被支原体污染后，细胞内的 DNA、 RNA 及蛋白表达发生改变，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，因而细胞被支原体 污染一般难以察觉，严重时会导致细胞生长缓慢，状态不好。
产品说明书
支原体检测试剂盒
产品组成：
产品编号 规格 固定液 染色液 洗涤液
使用说明书
BB-4314-1 20T 20ml 10ml 60ml 1
BB-4314-2 50T 50ml 25ml
150ml 1
储存条件： 2-8℃避光保存。
有效期： 一年。
注意事项： ● 请在使用前仔细阅读并参考该说明书。 ● 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。 ● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。 ● 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。 ● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清 洗并彻底清除残留清洁剂。 ● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。
支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（一些支原体在人体是正常
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荧光显微镜观察： 染色后，置于荧光显微镜下，选用 340-350nm 的激发光观察，最大发射波长为 461nm。
结果分析 ： 染色后，置于荧光显微镜下，选用 340-350nm 的激发光观察： 正常细胞的细胞核呈弥散均匀蓝色荧光，核外无荧光点。若有支原体污染，在细胞核外
与细胞表面会出现蓝色萤光小点或丝状点。其形状一致，与细胞碎片染成之不规则点状物不 同。
检测方法： 荧光显微镜
样本类型： ● 悬浮细胞
● 贴壁细胞
试剂盒以外自备试剂和仪器：
● PBS
● 纯水
● 移液器及吸头
● 离心机
●荧光显微镜
使用方法：
使用注意事项： ● 培养板、细胞爬片、甩片、滴片等均可检测。下面步骤以贴壁细胞在细胞培养板原位检测为例，
其他类型样品制作好后参考以下步骤即可。
样品染色： 1、 培养好的细胞吸出培养基，用不含酚红的 Hanks 液漂洗一次。 2、 加入适量固定液固定细胞 10 分钟。吸出固定液。 3、 加入适量固定液固定细胞 10 分钟。 4、 吸出固定液。自然晾干。 5、 加入适量染色液后轻轻混匀于室温避光条件下静置 20 分钟。 6、 吸出染色液。 7、 滴加洗涤液洗涤 2 次。晾干。
产品号 BB-4101 BB-4102 BB-4201 BB-4202 BB-4203 BB-4204 BB-4131 BB-4133 BB-4122
产品说明书
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