PCR法支原体检测

PCR法支原体测定PROTOCOL

生效日期（年-月-日）

有效期至（年-月-日）

分发部门：质量部

1.目的

规范PCR法支原体检测的操作方法。

2.范围

适用于项目研发过程样品、原液、成品及中间体的分析。

3.责任

质量分析人员熟悉并遵守该标准操作规程。

4.定义

N/A

5.设备、材料和试剂

5.1设备、材料

设备名生产商型号/货号备注PCR仪Thermo ARKTIK5020 N/A VORTEX IKA GENIUS 3 N/A

小型台式冷冻离心

机Thermo

HERAEUS Fresco

21

N/A

单道移液器

(10ul,20ul,100ul)

Eppendorf Research plus N/A 多功能水平电泳槽Tanon HE-120 N/A

凝胶成像系统BIORAD ChemiDoc™

XRS+ System

N/A

5.2试剂

试剂名称生产商货号TaKaRa PCR Mycoplasma

Detection Set

TaKaRa 6601 TaKaRa Ex Taq® TaKaRa RR001A Regular Agarose G-10 Biowest N/A Goldview 国产N/A

10×Loading Buffer TaKaRa 9157

DL5000 DNA Marker TaKaRa 3428A

内毒素检查用水厦门鲎试剂实验厂有限公司

6.溶液配制

6.1 50× TAE Buffer

称取242.0g Tris，37.2g Na2EDTA·2H2O于1L烧杯中，向烧杯中加入约800ml 超纯水，充分混匀，加入57.1ml冰乙酸，充分溶解，加入超纯水定容至1L，室温保存。有效期6个月。

6.2 1× TAE Buffer

量取10ml 50× TAE Buffer，加入490ml超纯水，充分混匀。有效期6个月。

7.操作步骤

用于检测支原体的样品是接种后进行3-6天细胞培养的培养上清液。如果使用常用的细胞培养基时，培养上清可直接加入到PCR反应液中，如果使用细胞悬浊液作为样品，则需要提取DNA，再进行PCR反应。如果样品中含有PCR 反应阻碍物，需要对DNA进行抽提，再添加到PCR反应液中，为了确认样品中是否含有反应阻碍物，在样品中加入Control Template进行正对照反应。

7.1 1st PCR反应

7.1.1按下表顺序配制反应混合液（50ul体系）

试剂用量（ul）

内毒素检查用水37.75~38.75

10× PCR Buffer 5

dNTP Mixture 4

MCGp F1 Primer 0.5

MCGp R1 Primer 0.5

TaKaRa Taq 0.25

7.1.2向以上反应混合液中分别加入1ul阴性对照样品（内毒素检查用水），1ul供试品，1ul阳性对照样品(Control Template)和2ul供试品阳性对照（1ul供试品+1ulControl Template)，添加样品时务必防止交叉污染。

为了避免交叉污染，实验过程需分区域操作。在实验区域1完成PCR反应液配置后，先在该实验区域加入1ul内毒素检查用水（阴性对照），再在实验区域2加入1ul供试品，最后在实验区域3加入1ul Control Template（阳性对照）及“1ul供试品+1ul control Template”（供试品阳性对照）。

7.1.3将反应管置于PCR仪中，设定以下反应条件进行PCR反应。

94℃30sec

94℃ 30sec

55℃ 2min 35 cycles

72℃ 1min

72℃ 5min

7.2 2nd PCR反应

7.2.1按下表顺序配制反应混合液

试剂用量(ul)

内毒素检查用水39.25

10× PCR Buffer 5

dNTP Mixture 4

MCGp F2 Primer 0.5

MCGp R2 Primer 0.5

TaKaRa Taq 0.25

7.2.2用内毒素检查用水将1st PCR反应产物稀释100倍，取0.5ul加入以上反应混合液中。为了防止交叉污染，加样时需分区域操作，具体加样方式同7.1.2。

7.2.3 将反应管置于PCR仪中，设定以下反应条件进行PCR反应。

94℃30sec

94℃ 30sec

55℃ 2min 30 cycles

72℃ 1min

72℃ 5min

7.3 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析

7.3.1 1%琼脂糖凝胶的制备

称取0.4g Regular Agarose G-10，加入约40ml 1× TAE Buffer（大于40ml），置于微波炉中中高火加热2min，摇匀，再加热2min。稍微冷却后加入1ul Goldview，振荡摇匀，倒入胶槽中，冷却30min左右直至凝固。

取出制备完成的琼脂糖凝胶置于多功能水平电泳槽中，加入1×TAE Buffer 直至超过凝胶2mm左右。

7.3.2 上样

取1st和2nd PCR产物各10ul，加入1.1ul 10×Loading Buffer，混匀后，取10ul上样，用6ul DL5000 DNA Marker作为对照。

7.3.3 电泳及分析

调节电压120V，电泳1h。取出凝胶置于凝胶成像系统，拍照并分析确认扩增片段的有无及片段大小。

8.数据分析

8.1 Control实验（阴性对照，阳性对照，供试品阳性对照）

本实验中以内毒素检查用水作为阴性对照样品；以Control Template作为阳性对照样品；以“供试品+Cont rol Template”作为供试品阳性对照样品。使用Control Template时，F1和R1引物扩增产物是810 bp（见图1，泳道5、6），F2和R2引物扩增产物是590 bp（见图1，泳道11、12）。

当阴性对照结果呈阴性，阳性对照结果呈阳性，此反应系统可行。

当供试品阳性对照结果呈阳性，说明待测样品对PCR反应无阻碍；如果供试品阳性对照结果呈阴性，说明检测样品中有阻碍物，建议将检测样品进行DNA 提取，再以其作为模板进行扩增。