Ki67在胃癌细胞株中的表达及意义

Ki67在胃癌细胞株中的表达及意义摘要目的：探讨ki67在人胃癌细胞sgc7901、bgc-823中的表达及意义。

方法：选择两种不同的胃癌细胞（人胃癌转移淋巴结细胞sgc7901，人胃低分化腺癌细胞bgc-823细胞），采用细胞免疫化学sabc法和及western-blot法对两种胃癌细胞中ki67表达情况进行检测和分析。

结果：ki67在两种胃癌细胞中都高表达，且差异有统计学意义（p<0.01）。

结论：ki67参与了胃癌的发生发展。

且ki67蛋白高表达可能是胃癌细胞的重要生物学标志。

关键词胃癌免疫细胞化学 western blot ki67doi：
10.3969/j.issn.1007-614x.2012.30.213
胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤，且死亡率极高，严重威胁人类的生命[1]。

ki67是一与增殖细胞相关的核抗原，与肿瘤增殖、浸润及转移和预后密切相关[2]。

本研究应用免疫细胞化学技术sabc和western blot对胃癌细胞株sgc7901、bgc-823进行检测，探讨ki67在胃癌细胞中的表达及在胃癌发生发展中的意义。

资料与方法
材料：①细胞：人胃癌转移淋巴结细胞sgc7901购自武汉生命科学细胞中心，人胃低分化腺癌细胞bgc-823细胞购自武汉博士德生物工程有限公司。

②试剂：rpmi-1640购自gibeo公司；ki67单克隆抗体购自北京中杉金桥有限生物公司；dab显色试剂盒及即用型（鼠/兔）sabc免疫组化染色试剂盒购自北京中衫生物技术有限公司。

pira裂解液购自北京中衫生物技术有限公司。

方法：①细胞培养：细胞株sgc7901、bgc-823在rpmi-1640完全培养液中常规培养。

完全培养液中含有10%的小牛血清（cs）、1%青霉素、1%链霉素。

培养条件为湿润状态下37℃和5% co2。

②免疫细胞化学：常规消化细胞，制备细胞悬液，并调整细胞密度2×105/ml。

将高压灭菌的盖玻片放入6孔培养板内，滴加细胞悬液2.5ml/孔，待细胞爬满盖玻片时，取出细胞爬片，浸入固定液4%
多聚甲醛30分钟，pbs（ph 7.2～7.6）浸洗3×3分钟后进行染色。

采用sabc免疫组化法，具体步骤按照试剂盒说明操作。

试剂盒里的阳性片为阳性对照，用pbs代替一抗做阴性对照。

③结果判定标准：cyclind1、ki67阳性细胞均表现为细胞核内含棕黄色颗粒。

在光镜下，结合免疫细胞化学染色强度和阳性细胞率两个参数，综合判定cyclind1、ki67的阳性染色。

用biomias图像处理系统在100倍镜下选取癌视野中5个区域，分别在高倍镜（400×）下随机选择25个视野。

采用image pro plus 5.0图像分析软件检测阳性染色的积分光密度值（iod）。

④western blot方法：收集细胞，裂解得总蛋白，考马斯亮蓝法定量蛋白。

调整样品蛋白浓度使其相同，取样品经sds-page后，转印至pvdf膜上。

pvdf膜以5%脱脂奶粉封闭2小时，加入一抗过夜。

经洗涤后，加入二抗，室温孵育2小时。

最后用ecl显影并扫描测灰度值。

统计学处理：采用spss13.0统计软件，实验数据以（x±s）表示，根据数据来源和统计学要求进行重复测量的方差分析。

p<0.05有统计学意义。

结果
免疫细胞化学法检测ki67在两种胃种胃癌细胞株中的蛋白表达：ki67在胃癌细胞株中阳性表达均呈棕黄色，并且定位于细胞核。

人胃癌转移淋巴结细胞sgc7901中ki67的蛋白表达iod值（5018.210±107.628）△明显高于bgc-823细胞（1966.439±123.020），差异有显著性（p<0.05）。

western blot检测ki67在各宫颈癌细胞株中的蛋白含量：人胃癌细胞株sgc7901、bgc-823内均有ki67阳性蛋白表达条带。

蛋白条带灰度值分析表明：人胃癌转移淋巴结细胞sgc7901中ki67蛋白的阳性表达均高于人胃低分化腺癌细胞bgc-823细胞，差异有显著性（p<0.05）。

讨论
细胞的增殖状态，对研究肿瘤生物学行为、判断其危害性具有及其重要意义。

一旦细胞周期调控失常，就会导致肿瘤的恶性增生[3]。

ki67是应用最广泛的增殖细胞标记之一。

ki67蛋白是由两条多肽链组成，ki67抗原的量随细胞周期的不同而发生改变。

在g1中期到后期出现表达，s期和g2期逐渐增加，有丝分裂期达到高峰，分裂后迅速降解或丢失抗原决定簇。

现认为ki67的功能与染色质相连，与细胞的有丝分裂有关[4]。

ki67的表达和细胞增殖状态密切相关，是反映细胞增殖的主要生物学指标。

因此，通过本研究结果表明，在转移癌细胞株sgc7901中ki67的表达明显高于非转移细胞株bgc-823（p<0.05），提示ki67的高表达与胃癌的发生和发
展密切相关。

肿瘤细胞的异常增殖可以通过多种方式与细胞外基质相互作用促进了肿瘤细胞的浸润和转移。

由此可见，ki67在胃癌的发生、发展过程中起到了重要的作用。

它不仅能客观反映胃癌细胞的增殖活性，并能评估癌细胞发生增殖、转移的潜能[5]。

因此认为，ki67高表达可能导致胃癌细胞增殖周期调控失常，使细胞发生无限制增殖及异常分裂，最终导致胃癌细胞恶性转化，甚至发生转移。

参考文献
1 lee j h，miele me，hicks dj，et al.kiss-1，a novel human malignant melanoma metastasis suppressor gene[j].j natl cancer.
2 charles j，sherr.the pezcoller lecture：cancer cell cycles revisited[j].cancer research，2000，60（14）：3689-3695.
3 pruitt k，der cj.ras and rho regulation of the cell cycle and oncogenesis[j].cancer lett，2001，71（1）：1210.
4 bartek j，lukas c，lukas j.checking on dna damage in s phase.nat rew mol cell biol，2004，5：792-804.
5 nakayama ki，nakayama k.ubiquitin ligases：cell-cycle control and cancer.nat rev cancer，2006，6：369-381.。