稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
稳转株：G418浓度确定到单克隆化鉴定教程文件
稳转株：G418浓度确定到单克隆化鉴定稳定转染攻略：从G418浓度确定到单克隆化鉴定摘要 : 一、筛选之前确定G418浓度： 1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和一、筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3′磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%。
4、G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
稳定细胞株筛选流程
稳定细胞株筛选流程稳定细胞株筛选的流程主要包括以下几个步骤：1.构建表达载体：首先，需要构建表达目的基因的质粒载体。
该载体通常含有启动子、目的基因和选择标记基因等元件。
启动子可以控制基因的转录水平，目的基因可以是感兴趣的基因或报告基因，选择标记基因则用于筛选稳定细胞株。
2.细胞转染：将构建好的表达载体导入目标细胞中。
转染可以采用多种方法，如化学法、电穿孔法和病毒转染法等。
转染后，目标细胞中的外源基因片段将被导入细胞质。
3.选择压力：为了筛选稳定细胞株，需要加入选择压力。
选择压力可以是抗生素、毒素或药物等，只有在压力下能够存活的细胞才能继续生长和繁殖。
4.单克隆细胞筛选：经过选择压力后，细胞群体中可能存在不同的细胞克隆。
为了获得单克隆稳定细胞株，需要进行单克隆细胞筛选。
常用的方法有稀释分选法、限稀稀释法和流式细胞术等。
5.鉴定稳定细胞株：筛选出的单克隆细胞株需要进行进一步的鉴定。
可以通过PCR、Western blot、荧光显微镜观察等方法验证目的基因的稳定表达。
总结起来，稳定细胞株筛选的流程包括构建表达载体、细胞转染、选择压力、单克隆细胞筛选和鉴定稳定细胞株等步骤。
这个流程能够筛选出稳定地表达目的基因的细胞株，为基因功能研究和药物开发提供可靠的实验模型。
在实际操作中，稳定细胞株筛选的流程可能会因实验目的和细胞类型的不同而有所调整。
但总体而言，以上步骤是筛选稳定细胞株的基本流程。
通过稳定细胞株的筛选，可以获得稳定表达目的基因的细胞株，从而开展进一步的实验和研究。
稳定细胞株的筛选是基因功能研究和药物开发中必不可少的一步。
通过稳定细胞株的筛选，可以实现对目的基因的稳定表达，为研究基因功能和开发新药物提供有力支持。
因此，掌握稳定细胞株筛选的流程和方法对于科研人员和药物开发人员具有重要意义。
稳转株：G418浓度确定到单克隆化鉴定
稳定转染攻略：从G418浓度确定到单克隆化鉴定摘要: 一、筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和一、筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3′磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%。
4、G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
二、加药时间和维持浓度：1、由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
G418筛选稳定表达细胞系PROTOCOL
1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。
2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。
3.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。
4.加G418筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。
5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。
方法同4。
6.确定最佳筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。
在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的G418的量在10天前就看不到活细胞了。
假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度！心得：由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。
比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml。
这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三个浓度进行筛选。
通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。
a 转染：转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时；b 加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。
c 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结1
最全的G418筛选稳定表达细胞系简介G418是一种广谱抗生素，可以选择性地杀死没有正确整合的质粒DNA转染的细胞，从而筛选出具有稳定表达的细胞系。
G418筛选是基因转染中常用的一种选择方法，通过对G418敏感性的筛选来选择转化基因。
本文将G418筛选步骤和优化方案。
G418筛选步骤细胞株选取首先需要选取稳定转染所需的细胞株。
需要保证选取的细胞株生长健康、分裂正常、易于培养以及不易死亡。
常用的细胞株有293T、CHO、HEK293。
转染在开始筛选之前，需要将目的基因转染进入所选细胞株。
目前常用的转染方法有磷酸钙共沉淀法、电转染法和脂质体转染法等，需要根据实际情况选择转染方法。
初步筛选完成转染后，需要在培养基中加入G418，通常的加药浓度不超过1mg/mL，推荐浓度为400μg/mL。
在转染后24-48小时内开始进行初步筛选，通过观察细胞的生长状态以及基因表达情况来判断筛选效果。
细分筛选初步筛选后，需要将G418的浓度逐步增加，通常第二轮加药浓度是初步筛选浓度的2倍，第三轮加药浓度是第二轮的2倍。
逐渐递增药物浓度，可以让敏感的细胞死亡，生存的细胞逐渐表达目的基因，从而得到稳定的细胞株。
稳定维持筛选到稳定的细胞后，需要对细胞进行定期维护。
通常可以在培养基中加入适当的G418浓度，维持稳定表达的转染细胞。
优化方案药物浓度G418的加药浓度直接影响到细胞死亡率和筛选效果。
在进行筛选前需要先进行剂量反应实验，通过不同浓度药物的处理，检测细胞生长状态和基因表达情况。
细胞密度传统细胞密度在98%时，死亡率是最高的。
因此，为了降低G418对细胞的毒性，可以将细胞密度控制在70-80%左右。
同时，过稀的细胞密度也会影响到筛选效果，因此需要根据实际情况进行调整。
培养时间筛选时间也直接影响到G418对细胞的毒性程度和筛选效果。
不同的细胞株和实验条件下，对筛选时间的选择有所不同。
通常初步筛选时间在24-48小时，细分筛选筛选时间需要根据实际情况进行判断。
稳定细胞株筛选
稳定株构建 FAQ转自微博思路迪慢病毒包装1，什么是瞬时转染和稳定转染？答：瞬时转染：顾名思义，外源片段的表达时间短暂。
这主要是因为外源导入的裸露的载体整合入基因组的几率非常低，所以以染色体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂而一同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。
而且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极高。
这就导致瞬时转染呈现一个高拷贝到低拷贝迅速降低的过程，且无法在这个系统上实现可诱导表达。
稳定转染：是相对瞬时转染而言，进入细胞的质粒整合入细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。
在这个系统中，质粒表达稳定，拷贝数低，且能实现诱导表达。
稳定转染并不是一种与瞬时转染不同的方法，只是对瞬时转染的细胞进行筛选，得到稳定整合的细胞株。
稳定整合的几率因基因传递的方法而异，跨度可以从10-8到10-1。
因此，对于有的转染方法，比如化学试剂介导的转染，其整合几乎可以忽略不计。
质粒载体整合的位点并不是完全随机分布，依据不同的基因传递方法，呈现不同的靶向倾向性，所以是一种半随机整合。
不同基因传递方法对质粒稳定表达的影响见表XXXX。
2，设计稳定株构建实验需要考虑的因素有哪些？∙答：稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有：∙1)，外源插入片段的拷贝数。
多数情况下，低拷贝甚至是单拷贝可以减少人为实验因素的干扰。
∙2)，整合的几率，这不仅决定了稳定株筛选的难易程度，而且还可以帮助人们更容易得到混合稳定株。
∙3)，整合位点的转录活跃度，决定了稳定株中外源片段的表达质量。
最理想的状况是单拷贝，但转录活性比较高。
∙4)，整合后的稳定性。
不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而导致稳定株再次丢失的情况。
∙5)，最好使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。
因为稳定整合往往伴随这插入失活宿主内源基因，所以实验时通过使用混合稳定株，或者对多个单克隆稳定株进行比较，可以帮助研究人员获得更精确的实验数据。
转染细胞的稳定筛选方法和实验步骤
转染细胞的稳定筛选1、药物筛选前的准备药筛前应确定药物筛选浓度,不同细胞系具有不同的药物敏感度，因此在筛选前应该用在药物浓度范围内设定浓度梯度来确定筛选稳定克隆的药物浓度。
药物浓度一般确定为能使未转染细胞在7天之内全部死亡，如G418一般需要7天，而puro一般时间很短，只需要3-4天即可.2、药物筛选注意事项（1）药筛的时间加药时间一般为转染后48h。
但由于慢病毒表达较慢，因此利用慢病毒感染将质粒转入细胞的方法，加药时间一般为72h空白对照加药筛选时，最好设置空白对照，即未转染细胞同时加药,待空白对照中细胞全部死亡，转染组中不具有抗药性的细胞基本药杀完,但还需继续加药。
（2)换液如果加药后,细胞死亡较多，需及时换液，以防死细胞释放有害物质导致具有抗药性的细胞死亡.另外，随着细胞的代谢,抗生素的活性会降低，因此,每隔3-5天应更换一次抗生素筛选培养液.3、克隆筛选注意事项若转染的质粒带有荧光标记，不管是以下哪种筛选克隆的方法，都应该选择带有荧光较强的细胞克隆，因为加药筛选时，可能会产生耐药性的细胞,因此最好选择带有荧光较强的细胞。
若是转染的质粒不带有荧光，那么只能盲挑.不管是带有或者不带有荧光标记，都应该挑出克隆后进行验证，验证存在不成功的概率。
因此，挑克隆时,应尽量多挑几个克隆，20个左右.4、稳定克隆筛选步骤（1）有限稀释法步骤a)将药筛后的细胞（一般长满六孔板即可，若细胞生长很快药筛时可以在10cm的dish中进行）用胰酶消化下来b)对消化后的细胞悬液进行计数(如果细胞数量过大,可先稀释后计数）c)计算后，用枪头吸取约200个细胞(其中有部分为死细胞)到10ml培养液中充分混匀，剩下的大部分细胞冻存保种d)然后将以上10ml细胞悬液加到96孔板中，每孔100ul,这样有的孔就可能只有一个细胞，过程中注意不时用枪头吹打混匀细胞悬液（一个96孔板得到的克隆可能较少，可以用同样的方法做2—3个96孔板)e)待细胞贴壁后，逐孔在显微镜下观察，没有细胞或者多余一个细胞的孔划叉，只有一个细胞的孔划勾,以做好标记，如果只有一个细胞的孔数量太少，可将一个孔内有两个细胞的孔也划勾,但这样克隆就可能不纯。
细胞给药浓度 确定方法
细胞给药浓度确定方法
确定细胞给药浓度的方法可以根据具体的实验需求和药物特性来选择，一般可以采用以下几种方法：
1. 浓度计算法，根据药物的分子量、溶解度和所需的最终浓度来计算所需的药物量，然后将药物溶解在适当的溶剂中。
这种方法适用于已知药物的溶解度和细胞对药物的敏感度的情况。
2. 浓度测定法，可以通过高效液相色谱法（HPLC）、质谱法（MS）或其他分析方法来准确测定药物在给药溶液中的浓度。
这种方法适用于需要精确测定药物浓度的情况。
3. 生物活性测定法，通过测定药物对细胞的生物活性来确定最佳的给药浓度。
可以通过细胞增殖实验、细胞毒性实验或其他相关的生物活性实验来确定药物的有效浓度范围。
4. 药物释放动力学法，通过测定药物在给药溶液中的释放动力学来确定最佳的给药浓度。
可以通过体外释放实验或药物释放动力学模型来确定药物在给药溶液中的释放规律和最佳浓度范围。
总之，确定细胞给药浓度的方法需要综合考虑药物的性质、实验的具体要求和可行性，选择合适的方法进行测定和确定。
在进行实验前，需要对所选方法进行充分的验证和优化，以确保得到准确可靠的结果。
稳定细胞株筛选实验
稳定细胞株筛选实验实验稳定细胞株是指将外源基因通过转染等方式插入到目标细胞中，并通过筛选得到具有稳定表达外源基因的细胞系。
稳定细胞株在研究基因功能、开发生物制药等方面有着广泛的应用。
本实验旨在介绍一种基于抗生素筛选的稳定细胞株筛选方法。
实验步骤1. 细胞的培养和分装将需要转染外源基因的细胞经过预处理后分装到96孔板中。
预处理的方法包括细胞数的调整、培养条件的优化等。
2. 转染外源基因将目标外源基因通过转染等方式导入到细胞中。
转染方法包括磷脂质体转染、病毒载体、基因枪等。
转染参数设置需要根据不同类型的细胞和外源基因来优化。
3. 抗生素筛选将不同类型的抗生素添加到分装好的细胞中，各种抗生素对应的筛选浓度需要根据实验的设计来确定。
筛选中心目的是筛选出稳定表达外源基因的细胞株，并筛选出能够在低浓度抗生素下存活的细胞株。
4. 稳定细胞株的测试和验证通过多次传代观察稳定细胞株的稳定性和表达效果，进行各项功能和表达水平的测定，如蛋白表达水平的检测、酶活性检测等，最终得到稳定的细胞株。
实验优化和注意事项1.在细胞分装前需要严格控制细胞数，以避免细胞过密或过稀的情况出现。
2.转染参数的设置需要根据细胞类型和外源基因进行调整，一般需要进行多次实验才能确定最佳的转染条件和过程。
3.实验中选用的抗生素应根据细胞特性和耐药性来确定，合理调整浓度以取得最佳的筛选效果。
4.稳定细胞株的鉴定需要进行多次测试和验证，其中包括蛋白表达水平、酶活性检测等。
实验结果和分析经过实验，我们成功地筛选出了稳定表达外源基因的细胞株。
经过多次传代和验证，细胞株的稳定性和表达效果得到了进一步的确认。
通过此次实验，我们发现抗生素浓度和稳定细胞株的筛选密切相关，合理选择抗生素种类和浓度能够有效地提高细胞株的稳定性和筛选效率。
本实验基于抗生素筛选的稳定细胞株筛选方法能够实现稳定表达外源基因的效果，为生物技术、药物开发等领域提供了有力的技术支持。
在实验设计和实验参数设置中需要严格控制，才能取得最好的效果。
稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
在使用G418、潮霉素B或嘌呤霉素筛选稳定细胞系细胞之前，需要先通过梯度实验确定适合该类细胞的最佳药物浓度。
对于一些常见的细胞系，通常可以在资料中找到推荐的药物浓度。
例如Hela细胞用400 μg/ml的G41或1 μg/ml的嘌呤霉素进行稳定细胞株筛选。
用G418或潮霉素B，选用在5天左右出现细胞大批死亡，2周全部死亡的浓度作为筛选浓度。
对于嘌呤霉素,通常采用在3-4天杀死全部细胞的浓度。
不同批次的药物活性有一定差异。
因此在使用新批次药物时，需要重新测定最佳浓度。
筛选抗生素的推荐使用浓度（μg/ml）
抗生素工作范围筛选浓度维持用量
G418 50-800 400-500 100
Hygromycin 50-800 200 100
Puromycin 0.25-2 0.5-10 0.25
1、在加入筛选药物前一天将细胞以50%密度接种到6孔板。
第二天在培养基中按G418(0,50,1000,200,400,800μg/ml)或者嘌呤霉素（0,1,2.5,5,7.5,10μg/ml）加入。
2、用G418筛选处理5-10天。
每2天观察细胞一次。
每4天跟换新的有抗生素的培养基（如果有必要可以更换得更勤）。
直到得到最佳浓度。
3、用嘌呤霉素处理4-7天。
每2天跟换新的有抗生素的培养基。
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稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
在使用G418、潮霉素B或嘌呤霉素筛选稳定细胞系细胞之前，需要先通过梯度实验确定适合该类细胞的最佳药物浓度。
对于一些常见的细胞系，通常可以在资料中找到推荐的药物浓度。
例如Hela细胞用400 μg/ml的G41或1 μg/ml的嘌呤霉素进行稳定细胞株筛选。
用G418或潮霉素B，选用在5天左右出现细胞大批死亡，2周全部死亡的浓度作为筛选浓度。
对于嘌呤霉素,通常采用在3-4天杀死全部细胞的浓度。
不同批次的药物活性有一定差异。
因此在使用新批次药物时，需要重新测定最佳浓度。
筛选抗生素的推荐使用浓度（μg/ml）
抗生素工作范围筛选浓度维持用量
G418 50-800 400-500 100
Hygromycin 50-800 200 100
Puromycin 0.25-2 0.5-10 0.25
1、在加入筛选药物前一天将细胞以50%密度接种到6孔板。
第二天在培养基中按G418(0,50,1000,200,400,800μg/ml)或者嘌呤霉素（0,1,2.5,5,7.5,10μg/ml）加入。
2、用G418筛选处理5-10天。
每2天观察细胞一次。
每4天跟换新的有抗生素的培养基（如果有必要可以更换得更勤）。
直到得到最佳浓度。
3、用嘌呤霉素处理4-7天。
每2天跟换新的有抗生素的培养基。