小鼠成年性神经干细胞的分离和纯化
成年C57小鼠脊髓神经干细胞的培养与鉴定
成年C57小鼠脊髓神经干细胞的培养与鉴定郎兵;孟晋宏;杨浩;刘惠玲;焦西英;游思维;王百忍;鞠躬【期刊名称】《中国神经科学杂志》【年(卷),期】2004(20)5【摘要】目的从成年小鼠脊髓中培养神经干细胞,并对其进行鉴定和诱导分化。
方法成年C5 7小鼠 ,悬浮培养神经干细胞技术。
结果培养 1～ 2周时 ,培养液中即可出现神经干细胞克隆球。
该克隆球具有很强的自我增殖能力,可多次传代。
免疫细胞化学技术证明该克隆球表达大量的神经干细胞特征性的中间丝———巢蛋白(Nestin) ;经 1%胎牛血清诱导后可表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特征性标志物β tubulinIII、胶质纤维酸性蛋白(Gliafibrillaryacidicprotein ,GFAP)和RIP ,提示它们可朝神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞方向分化。
结论本研究结果提示正常成年C5 7小鼠脊髓中含有神经干细胞 ,在体外条件下可以大量增殖。
【总页数】5页(P363-367)【关键词】神经干细胞;巢蛋白;免疫组织化学;细胞培养;脊髓;小鼠【作者】郎兵;孟晋宏;杨浩;刘惠玲;焦西英;游思维;王百忍;鞠躬【作者单位】第四军医大学基础部全军神经科学研究所【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.成年大鼠脊髓神经干细胞的培养与鉴定 [J], 高峰;贺世明;王学廉;高国栋2.C57胚胎小鼠神经干细胞的分离、培养与鉴定 [J], 万丽;易桦林;贝伟剑3.成年小鼠神经干细胞培养、鉴定以及多不饱和脂肪酸含量的测定 [J], 张正卫;俞俊峰;王荣根;阮苗苗;张润洁;方斌;王冠;王盈;戴一凡4.人胎脑组织神经干细胞的分离培养、克隆和分化/EGF和bFGF对成年大鼠神经干细胞增殖和分化的影响/小鼠脊髓重量和脊髓颈膨大截面积的基因组扫描分析[J],5.C57胎鼠、乳鼠及成年小鼠心室肌细胞分离、培养及鉴定 [J], 张玲;段明军;魏琴;陈华;时利;侯月梅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小鼠干细胞实验报告
一、实验目的本研究旨在探讨小鼠干细胞的生物学特性及其在组织再生和疾病治疗中的应用。
通过体外培养和观察小鼠干细胞，分析其增殖、分化和迁移能力，为干细胞在临床治疗中的应用提供理论依据。
二、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）小鼠脾脏、骨髓等组织；（2）DMEM/F12培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素；（3）小鼠成纤维细胞；（4）表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子；（5）流式细胞仪、细胞培养箱、倒置显微镜等。
2. 实验仪器：（1）流式细胞仪；（2）细胞培养箱；（3）倒置显微镜；（4）超净工作台；（5）离心机。
三、实验方法1. 小鼠干细胞分离（1）取小鼠脾脏、骨髓等组织，用眼科剪剪成1mm³大小的组织块；（2）将组织块放入DMEM/F12培养基中，加入Ⅰ型胶原酶，37℃消化1小时；（3）用200目尼龙网过滤，收集细胞悬液；（4）用离心机离心，弃去上清液，用DMEM/F12培养基重悬细胞。
2. 小鼠干细胞体外培养（1）将细胞悬液接种于培养瓶中，放入细胞培养箱，37℃、5%CO2条件下培养；（2）每3天更换一次培养基，观察细胞生长情况。
3. 小鼠干细胞表型鉴定（1）用流式细胞仪检测细胞表面标记，如CD29、CD44、CD45等；（2）用倒置显微镜观察细胞形态。
4. 小鼠干细胞增殖实验（1）取对数生长期的干细胞，以1×10⁵个/孔的密度接种于96孔板；（2）每24小时更换一次培养基，观察细胞增殖情况；（3）计算细胞增殖倍数。
5. 小鼠干细胞分化实验（1）将干细胞接种于培养皿中，加入表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，诱导细胞分化；（2）观察细胞形态和生物学特性，如神经细胞、成骨细胞等。
6. 小鼠干细胞迁移实验（1）将干细胞接种于培养皿中，加入细胞迁移实验试剂；（2）观察细胞迁移情况，记录细胞迁移距离。
四、实验结果1. 小鼠干细胞分离成功，细胞生长旺盛，呈梭形、椭圆形等；2. 表型鉴定结果显示，小鼠干细胞表面表达CD29、CD44、CD45等干细胞标记；3. 小鼠干细胞增殖实验结果显示，细胞增殖倍数为10倍；4. 小鼠干细胞分化实验结果显示，细胞可分化为神经细胞、成骨细胞等；5. 小鼠干细胞迁移实验结果显示，细胞迁移距离为1.5mm。
性成熟前小鼠生精细胞的发育过程
第20卷第3期中 国 兽 医 学 报V o l.20,N o.3 2000年5月Ch inese Jou rnal of V eterinary Science M ay2000性成熟前小鼠生精细胞的发育过程张学明,文兴豪,赖良学,李德雪3,李子义,杨盛华,杜惜明,曾发贵 (解放军军需大学动物科技系,吉林长春130062)摘要:用光镜、电镜观察了生后1～18d昆明白小鼠的生精上皮。
结果显示,生后1～3d,曲细精管内只有生殖母细胞和支持细胞2类形态结构截然不同的细胞,前者位于管中部;生后4～5d,少数生殖母细胞已附着在基膜上;生后6～7d,原始A型精原细胞大量出现并附着在基膜上;生后8d,A型精原干细胞大量出现,B型精原细胞开始出现;生后10d,B型精原细胞大量出现;生后12～13d,前初级精母细胞出现,少数曲细精管的管腔开始出现;生后14～15d,多数曲细精管管腔基本形成,前初级精母细胞大量出现。
本试验的结果表明,7～8d小鼠的睾丸最适于分离精原干细胞。
关键词:精原干细胞;形态结构;小鼠中图分类号:S852116 文献标识码:A 文章编号:100524545(2000)0320293205 精原干细胞的异体及异种移植是当前干细胞领域的一个新的研究热点。
但目前用于移植的细胞都是混合细胞,效率很低[1]。
若能将精原干细胞分离纯化,即可克服上述不足。
分离纯化精原干细胞必须选取合适日龄的睾丸,才能获取较多的细胞。
目前有关性成熟前小鼠生精上皮细胞生长发育所经历的形态结构的变化,尚缺乏系统的研究报道。
本试验系统观察了小鼠性成熟前各级生精细胞发育分化进程,以为选择合适日龄的小鼠睾丸分离纯化小鼠精原干细胞提供依据。
1 材料与方法111 动物的选择及饲养 昆明白小鼠,由本校实验动物中心提供,按常规方法饲养管理。
选择自然发情母鼠与公鼠合笼,次日8:00检查阴道栓,见栓日中午记为交配后(PC)0.5d,PC19d后确切记录幼鼠出生时间。
实用神经变性实验方法-成年鼠干细胞培养
实用神经变性实验方法----成年鼠神经干细胞培养神经干细胞具有自我更新和分化成中枢神经系统不同类型细胞的能力。
体外分离培养和分析神经干细胞是揭秘神经发生的细胞和分子机制的重要方法,也有助于神经系统疾病和神经损伤干细胞治疗的条件优化。
成年哺乳动物脑内神经发生主要集中在两个区域:侧脑室室下区( subventricular zone of the lateral ventricle,SVz) 和海马齿状回的颗粒下层( subgranular zone of the dentate gyrus in the hippocampusSGZ)。
SGZ区的神经干细胞主要产生海马齿状回兴奋性谷氨酸能神经元。
SVZ区的神经干细胞产生抑制性的￥-氨基丁酸能神经元和嗅球的多巴胺能中间神经元除了分化为不同的神经元外,这两个区域的神经干细胞对神经营养因子、神经生理和病理刺激的反应性也不同,然而,这两个区域神经干细胞具有不同特性的分子机制并不十分清楚。
因此,比较同一个脑组织中,这两个神经发生区域神经干细胞的特征显得尤为重要。
近些年来,国际上相关领域的专家一直都在优化成年鼠神经干细胞的分离培养条件,但仍然存在很多的不足之处,如贴壁单层生长的细胞容易分化、所需的鼠脑数量较多等。
本文将介绍一种从一只鼠脑中同时分离培养DG区和SVZ区神经干细胞的方法。
1.材料8~12周雌性或雄性C57BL6J小鼠、Hank's平衡盐溶液(HBSS,购自Invitrogen, 货号14025126)、Neurobasal培养基(购自Invitrogen,货号210-049)、DMEM/F12培养基(购自Invitrogen,货号1032、B27添加物(购自Invitrogen,货号1750404),N2添加物(购自Invitrogen,货号17502-408,无菌分装)、Glutamax(购自Invitrogen,货号35050-038,无菌分装)、L-谷氨酰胺(购自Invitrogen,货号2503081,无菌分装)、青霉素/链霉素Antibiotic-antimycotic,自Invitrogen,货号15240-062,无菌分装)、碱性纤维生长因子(bFGF-2,购自Peprotech,货号100-18B-B)、表皮生长因子(EGF,购自Pepo Tech,货号100-15)、MACS神经组织分离试剂盒(购自Miltenyi Biotec,货号130-092-628)、β-巯基乙醇(购自EM Sciences货号MX0O31OMB-1,属剧毒品,在通风橱中打开)、Percoll分层液(购自Amersham Biosciences,货号17-0891-01)、10×DPBS(购自Invitrogen,货号14200-059)、1×DPBS(购自Invitrogen,货号14190-136)、多聚鸟氨酸(Poly-L--ornithine,购自SigmaAldrich,货号P-3655)、层粘连蛋白( Laminin,购自BD biosciences,货号354232) 维甲酸( Retinoic acid,RA,购自Sigma-Aldrich,货号R2625)、毛喉素( Forskolin FSK,购自Sigma-Aldrich,货号F6886)、二甲亚砜( Dimethyl Sulfoxide,DMSO,购自Sigma-Aldrich,货号D2650),超纯水( Mini Q)、75%酒精、4%多聚甲醛、细胞消化液(购自Accutase)、磷酸盐缓冲液(PBS)、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Brom2-deoxy Uridine, Brd)2.仪器6cm和10cm直径的细胞培养皿,离心管,1ml带滤芯的吸头,超低黏附6孔和24孔细胞培养板;解剖工具[眼科剪(购白Roboz,货号RS-5840、RS-6942),眼科镊(购自Roboz,货号RS-5237、RS-5095)];解剖显微镜;MclⅡ组切片机(购自The Mickle Laboratory Engineering Co.LTD,货号10180)及刀片Macsmix离心管混匀器(购自Miltenyi Biotec,货号130-090-753);无菌试纸(购自Fisher Scientific,货号14-959-92B);低速离心机(购自Eppendorf,型号5702,货号022626001);数字相差倒置显微镜(购自Olympus,CK41)。
成年小鼠心脏干细胞的分离、培养鉴定和离子通道特征
Ｏ Ａ肾上腺 素受体在激 动剂作 用下向细胞 内运动特征 ￣－ Ｉ
刘飞 徐宁 徐 明 张幼 怡 ，
北京大学第三 医院血管 医学研究所、分子心血管学教 育体 向细胞 内的运动是很多Ｇ 白偶联受体的特征行为，本研 究旨在 蛋
探讨０Ａ肾上腺素受体 （ ｌ Ａ ｃ． ｌ ｔＡ Ｒ）在激动剂苯肾上腺素 （ Ｅ ｘ． Ｐ ）作用下的内化运动 。方法和结果 ：
利用全 内反射显微镜ＴＲＦ Ｉ －Ｍ技术及拉曼光谱分析，发现活细胞膜下表面荧光标记 的＆ Ａ Ｒ Ｅ ｌ Ａ 在Ｐ ．
作用下 出现 内化运动，撤去Ｐ 后一部分受体又 回复到膜上 。 ＡＡ 的定向运动速率分布发生了 Ｅ －Ｒ 明显变化 。在２ ｎ ０ｍ 时间点以内，０ＡＡ 的运动速率分布成单峰，集中在０ １ ；从３ 分钟开 ｉ ｃ． Ｒ ｌ ． ／ ３ ｓ ０
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中国药理通讯 ２ｏ ０ ８年 第 二 十 五 卷 第 二 期
ｉｆ ｒｔ ｏｕ ｅａ ｄｗｅｇ ｔＣｏ ａ ｅ ｈ ｍ ｒ ｉ ｈＢＲＳ ｇｏ ｐ ａｓ ｔｅｉｆａ ｎ ａｃ ｌｍ ｎ ｉｈ ． ｍｐ ｄｔ ｓ ａ ｏ ｇ ｖ ｒ ｏ ｈ ｒ ｕ ｓｒ ｔ，ｈ ｌ ｍｍ ａｏ ｙｆ ｃｏ ｓｌｖ ｌ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｒ ｅｓ ｅ ｗｅｅｅｅ ａｅ ａｋ ｄｙｉ ＡＤ ｒ ｏ ＢＲＳ ｇｏ ｐ ． ｈ ｓ ． ｍｏ ｓ ａｅｔａ ｅ ｌ ａｏ ｅ ｅ ｕ ｃ ｏ ｒ ｌｖ ｔ ｍ ｒ ｅ ｌ Ｓ ｄ ｎ ｏ ｌｗ ｒ ｕ ｓ Ｔ ｅ ｅ ｅ ｎ ｔ ｔ ｔ ｄ ｒ ｈ ｍ ｄａ ｒ ｒｆ ｘｆ ｎ ｔ ｎ ｂ ｌ ｉ ｉ ａ ｐ ｒａ ｔ ｅｅｍｉ ａ ｔ ｎ ｔｅ ａ ｕｅ ｃ ｒｂ ａ ｓ ｈ ｍｉ ａｓｗｉ ＣＡ ｃ ｌｓｏ ． ｎ ａ ｍａ ｏ ｓｎ ｉ ｏ ｔｎ ｔｒ ｎ ｃ ｔ ｅｅ ｒ ｌ ｃ ｅ ａｉ ｒｔ ｔ Ｍ ｍ ｄ ｎ ｏ ｈ ｉ ｎ ｈ ｏ ｃｕ ｉｎ Ｉ ｆ ｍ ｌ ｉ ｔｎ
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养物品准备：6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。
操作步骤：（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。
（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。
使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。
（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。
（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。
注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。
消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。
（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。
（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。
不要收集倾向于漂浮的组织碎片。
（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。
（9）800r，离心5min。
（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。
（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。
（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。
（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。
此时成纤维细胞类似于小圆点。
（14）收集并丢弃上清液。
用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。
在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。
人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定
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中国老年学杂志 2012 年 3 月第 32 卷
化学染色，细胞质中有棕色颗粒。成纤维细胞的标志物 Vimen- tin 为阳性，证明提取细胞为成纤维细胞。见 细胞培养第 2 天； c： 细胞培养第 12 天细胞生长呈鱼群状； d： 细胞培养第 14 天，细胞生长呈漩涡状
5 Keisuke T，Jin H，Taranova O，et al. Generation of insulin-secreting isletlike clusters from human skin fibroblasts〔J〕. Science，2008； 283 （ 46 ） ： 31601-7.
2结果 2. 1 成纤维细胞分离、纯化及培养 通过酶消化法及贴壁筛 选法，成功分离出人成纤维细胞。 2. 2 形态学观察 倒置显微镜观察细胞形态，接种第 2 天可 见细胞散在生长，分布不均的单个贴壁细胞呈梭形，成纤维细 胞样。待细胞培养 10 ～ 14 d 时，细胞生长已达 80% ～ 90% ，呈 鱼群样或漩涡状排列。见图 1。 2. 3 细胞 HE 染色 成纤维细胞的形态呈梭形，也可见大多 角形和扁平星形等。核仁明显，核呈椭圆形，可见 1 ～ 2 个核 仁，胞体较大，胞质弱嗜碱性，染色质疏松着色浅。当细胞汇流 时，呈鱼群样或漩涡状排列，细胞在 15 代内形态保持不变，经 HE 染色可以更清楚地观察到这些表现。见图 2。 2. 4 细胞免疫组化结果 对第 6 代成纤维细胞进行免疫细胞
人 成 纤 维 细 胞 的 体 外 分 离 、纯 化 培 养 及 细 胞 鉴 定
王玲玲1 马 峰2 张玉成 杜珍武 张桂珍 （ 吉林大学中日联谊医院中心研究室，吉林 长春 130033）
〔摘 要〕 目的 对人皮肤成纤维细胞进行分离、纯化、培养及细胞鉴定，探讨一种高效的分离及纯化方法，为细胞移植提供种子细胞。方法 使用酶消化法原代提取人成纤维细胞，快速贴壁法纯化细胞，对细胞进行形态学观察、HE 染色，免疫细胞化学鉴定细胞标志物 Vimentin。结果 利 用倒置显微镜及 HE 染色，可见细胞为散在分布的梭形贴壁细胞，当细胞汇流时，呈鱼群样或漩涡状排列，且细胞在 15 代内形态保持不变。结论 成 功地发现快速提取成人成纤维细胞的方法，为成人自体细胞移植的研究奠定了基础。
小鼠胚胎中脑神经干细胞分离、培养及分化
小鼠胚胎中脑神经干细胞分离、培养及分化刘兵;刘洪涛;戴冀斌;彭超华;黄娟【摘要】目的:探讨小鼠胚胎中脑分离神经干细胞的体外培养方法,以获取高纯度的神经干细胞,为神经干细胞的深入研究提供试验材料。
方法:无菌条件下分离孕12~13 d小鼠胚胎中脑曲,制成单细胞悬液,碱性成纤维生长因子(bFGF)和B27存在的培养基中培养扩增,通过免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞及子代细胞的分化方向,流式细胞术检测TH阳性神经元比例。
结果:培养的部分细胞体外分裂增殖,同时表达神经干细胞特异性抗原nestin,并向神经细胞和胶质细胞分化并经流式细胞仪检测自然分化为多巴胺能神经元的比例为3.25%。
结论:小鼠胚脑中脑存在具有多分化潜能的神经干细胞,它们能在体外稳定培养、传代和分化。
【期刊名称】《长江大学学报：医学卷》【年(卷),期】2006(000)012【总页数】4页(P)【关键词】神经干细胞;培养;分化;中脑【作者】刘兵;刘洪涛;戴冀斌;彭超华;黄娟【作者单位】长江大学医学院;武汉大学医学院;武汉大学医学院;湖北荆州;湖北荆州;湖北武汉【正文语种】中文【中图分类】Q813神经干细胞(neural stem cells, NSCs)是一类广泛存在于胚胎及成体中枢神经系统的早期未分化细胞，被认为是神经系统的“发源地”[1]。
应用神经干细胞移植的方法修复神经系统脑的损伤与治疗人类神经退行性疾病中更显示出其优越性,其中最具有代表性的就是怕金森病，然而，这种方法在患者中广泛应用的障碍就是胚脑移植的问题。
本试验对小鼠胚胎中脑神经干细胞的分离和培养进行了尝试，为神经干细胞的进一步研究奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料1) 实验动物孕12～13 d昆明小鼠(E12～13 d，SPF级)，由武汉大学医学院实验动物中心提供。
2) 试剂 DMEM/F12培养基，特优级胎牛血清(FBS),B27均购自GIBCO公司；碱性成纤维生长因子(bFGF)购自Peprotech公司；胰酶(Trypsin)、DNA酶1(DNase1)、左旋多聚赖氨酸(PLL)和DAPI购自SIGMA公司。
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小鼠成年性神经干细胞的分离和纯化
神经干细胞被认为是一类具有自我更新和多潜能分化亚群的细胞，能够产生成
熟神经元和神经胶质细胞。
而小鼠成年性神经干细胞的分离和纯化一直是神经科学研究的一个重要课题。
小鼠成年性神经干细胞的分离和纯化的方法主要有两种：体外培养和体内标记。
其中，体外培养法是常用的方法之一，其主要步骤包括：从小鼠脑组织中分离出神经干细胞，将其在低黏附培养条件下培养，用培养基逐渐去除非神经干细胞，提纯出纯正的神经干细胞。
具体来说，小鼠脑组织的分离和消化可以通过切片法或酶消化法完成。
其中酶
消化法可用的酶有多种，如胰酶、玉米胚芽酶等。
一般来说，使用Papain是最常
见的方法，其消化时间和浓度的选择需要根据组织的类型和实验的要求而定。
随后将细胞分离并筛选，即可获得含有神经干细胞的原代培养物。
接下来，体外培养条件的优化是保证培养成功率的重要因素。
小鼠成年性神经
干细胞体外培养中所用的培养基主要包括DMEM-F12培养基和N2培养基或B27
培养基的组合。
在培养基添入bFGF (20 ng/ml)和EGF (20 ng/ml)的情况下，小鼠成
年性神经干细胞可以存活并自我更新。
同时，将细胞培养在低黏附板上也是培养成功的关键，此时细胞间的物理纽带松弛，可以最大化地模拟细胞在体内的状态。
培养过程中，需要使用划痕法或免疫染色法来鉴定纯度。
对于划痕法，将涂片
中的单元格划成斜线，如果发现小鼠成年性神经干细胞在划痕的两侧增殖，则表示培养纯度高。
而免疫染色法则通过检测神经生长因子受体（NGFR）或神经元标记Nestin蛋白，来判断细胞的类型和纯度。
除了体外培养法，体内标记法也是一种可行的小鼠成年性神经干细胞分离的方法。
体内标记法主要是将神经干细胞标记为一种特定的融合蛋白，以便在体内将其
分离出来。
目前常用的体内标记法是将神经干细胞瞬间转染为GFP或复合物蛋白的方法，这些蛋白可以较准确地表达在神经干细胞的表面，并带有一个标记蛋白。
一旦神经干细胞成功地被分离和纯化在手，我们就可以进行相关的实验研究。
例如，研究其在发育和再生中的功能以及作用机制，从而为神经学和医学领域的研究和应用提供基础支持。
同时，小鼠成年性神经干细胞的分离和纯化也是体细胞再生医学的基础，有望促进神经细胞的再生和治疗。
总之，小鼠成年性神经干细胞的分离和纯化是一个长期的过程，需要结合多种方法和技术，才能获得纯正的细胞群。
其在生物医学领域中的前景不可估量，值得我们继续深入研究。