神经元培养步骤
神经元培养 -总结
Coverslips的清洗方法1.三蒸水浸泡过夜2.硝酸浸泡48小时, 硝酸每月更换一次。
（18h<时间<72h ）3.先用单蒸水冲洗几遍，将表面的硝酸洗去，然后用双蒸水洗8次，在摇床上摇90-100转，1小时换一次水。
最好能摇过夜。
4.干烤6小时，干烤温度为225度。
注：洗玻片这一步很重要，如果洗不彻底，细胞贴壁明显不好，并有聚团现象。
洗得过程中，请按照先放水，再放入玻片架，以免玻片互相粘在一起，洗不彻底。
换水时用PE手套，每次换水请更换PE手套，如洗的过程中有粘在一起的现象，请用镊子一个一个分开后，再继续洗。
5.在超净台，放到无菌培养皿里，封口膜封好6.用0.1mg/ml的PLL coat玻片，每个玻片100-120ul,过夜放置，60mm 加3ml，12孔板加1ml。
注：PLL最好不要使用超过1个月。
母液浓度1mg/ml，-20℃贮存，工作浓度0.1mg/ml（100ul母液+ 900ul ddH2O）7.种细胞前吸去多赖，用HBSS洗，2ml/well ，2-3次。
注：没有放coverslips的dish 不用洗，直接吹干就好了，30min 左右。
8.在Hood里自然干燥，不开紫外，紫外线可以分解多赖。
Preparation:1）冰盒，解剖工具（1把大剪刀，2 把尖镊子，2把尖嘴弯镊）泡在75%的酒精中消毒，100mm dish 2个，60mm dish 4个，细胞计数板，timer，1大1小两个塑料袋。
2）4个60mm dish每个放3ml左右HBSS置冰上，1个100mm dish 加入20ml左右DMEM全培置冰上。
3）打开37 C水浴，pre-warm HBSS，NB全培，0.25%胰酶（trypsin）学生值日准备工作1 预先查看是否有NB液及加B27的NB液2 查找并确定共需多少皿神经元，注意孵箱里保顾的待培养的皿，24孔板，6孔板等2 确定共需配制多少神经元培养液（即10% HS的全培）3 吸去待培养神经元的培养皿中的多赖并回收多赖，晾干4 配制神经元培养液，并加于各待培养的皿中，24孔板500ul，96孔板100ul神经元基础培养液：Neurobasal Medium + B27(2%，10ml/500mlNB，避光融化)神经元原代培养种植液50ml：DMEM + HS(5ml，10%)神经元培养液：神经元基础培养液 + GlutaMAX (125ul，100X，0.25%) + 双抗（1%，P-S，无血清）NB，0.25% trypsin，37℃预热。
神经元细胞培养
神经元细胞培养1. 孕16 d SD 大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks’平衡盐液中。
2. 在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入37℃孵箱内消化20 min，中间摇晃一次。
3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(DMEM＋10%FBS)的离心管内终止消化液作用5 min。
4. 用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10%FBS 的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。
重复上述步骤2～3 次。
5. 将所收集的上清经200 目筛网过滤。
6. 过滤后的细胞悬液于800 rpm 离心5 min，弃上清，管内加入新鲜培养液(DMEM＋20%FBS)并吹打成单细胞悬液。
7. 细胞计数，调整细胞密度按（700000个）1.5×105/cm2 种入6 孔板内，放入CO2 孵箱中培养。
(1)把细胞悬液用(DMEM＋20%FBS)悬浮，种到培养皿上6－12 h 后，全量换成2% B27的neurobasal 培养基，继续培养，3 d 半量换液。
（+0.5mmol/L谷氨酰胺）鉴定1.形态学的观察，在DIC下可以很清楚的看到神经元特有的形态，轴突树突以及胞体非常明显。
2.免疫学鉴定：正如楼上几位所说，NF（神经丝）或者tubulin 或者MAP2等都是目前鉴定神经元的Marker,不论你好似免疫荧光还还是免疫组化，阳性表达即可！3.在进一步你可一做mRNA水平的实验，也就是RT-PCR了。
这就更能支持2的阳性表达了。
4.电生理学的鉴定：测定神经元特有的电生理学也是证据之一啊！从以上几个方面去做，应该能证明是神经元了！错误之处还请赐教！TUJ1。
神经元原代培养实验报告
一、实验背景神经元是神经系统中最基本的结构和功能单位，研究神经元生物学特性对于理解神经系统疾病和开发新的治疗方法具有重要意义。
神经元原代培养是研究神经元生物学特性的重要方法之一，它能够模拟体内神经元的生长和发育过程，为神经元生物学研究提供了一种有效的手段。
二、实验目的1. 掌握神经元原代培养的方法和步骤。
2. 观察神经元原代培养过程中的形态学变化。
3. 分析神经元原代培养过程中细胞生长、增殖和分化情况。
三、实验材料1. 实验动物：E17-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠。
2. 试剂：含10%胎牛血清的DMEM培养基、神经元维持培养基(NeurobasalB27谷氨酰胺）、胰蛋白酶、抗神经丝抗体、荧光染料等。
3. 仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、离心机、移液器等。
四、实验方法1. 取E17-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠大脑皮质，用胰蛋白酶消化，制成细胞悬液。
2. 将细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
3. 每天观察细胞生长情况，记录细胞形态学变化。
4. 培养第3天，进行细胞计数，观察细胞生长速率。
5. 培养第5天，进行免疫荧光染色，观察神经元纯度。
6. 培养第10天，进行神经元分化实验，观察神经元功能。
五、实验结果1. 细胞形态学观察：神经元原代培养过程中，细胞从圆形逐渐转变为梭形，并逐渐出现突起，形态逐渐成熟。
2. 细胞生长速率：培养第3天，细胞生长速率为（2-4）×10^4个/皿；培养第5天，细胞生长速率为（4-8）×10^4个/皿。
3. 神经元纯度：免疫荧光染色结果显示，神经元纯度达到90%以上。
4. 神经元分化实验：神经元分化实验结果显示，神经元在培养过程中逐渐分化为不同类型的神经元，如运动神经元、感觉神经元等。
六、实验讨论1. 神经元原代培养过程中，细胞形态学变化与体内神经元生长和发育过程相似，为研究神经元生物学特性提供了有力手段。
2. 细胞生长速率受多种因素影响，如培养基、温度、CO2浓度等。
神经元原代培养_
神经元原代培养_
神经元原代培养
从孕17-18天的雌鼠的胎儿分离神经元细胞。
孕雌鼠麻醉然后解剖，胎儿收集到HBSS-1中然后快速断头。
剥离脑膜和白质后，大脑皮质收集入HBSS-2 液中机械磨碎。
皮质碎片移到有0.025%胰酶的H BSS-2液中37°C消化15分钟。
胰酶消化后，细胞用含有10%胎牛血清的HBSS-2液冲洗两次，用神经基础培养液重悬细胞（培养液添加了0.5mM左旋-谷氨酰胺，25μM左旋-谷氨酸，2%B27和0.12mg/ mL庆大霉素）。
以1×105cell/cm2接种到事先用多聚赖氨酸包被的培养皿上，放到37°C，5%CO2湿温培养箱里进行培养。
每3天用吸管换液，一次换0.5mL。
体外培养8天细胞就能用于实验。
选用17-18天的胎鼠能够提高神经元培养的效率，因为与乳鼠相比胚胎组织的细胞连接还很少。
因此，用乳鼠会使神经元的分离更加困难，会造成细胞连接不可逆的损伤，细胞之间的共同的轴突和树突更容易发生损伤。
另外，用出生后1天内的大鼠皮质培养容易有胶质细胞污染，而用胎鼠则可以避免这种情况。
如果用的是乳鼠，一般是在培养36个小时后加入阿糖胞苷，抑制胶质细胞生长。
另外，如果把分化的影响看成是考虑的重要因素，可以用培养4天的、8天的、18天的细胞。
其中一个例子可以是观察毒性物质对小孩和成年的不同效应。
海 马 神 经 元 培 养
海马神经元培养（1）材料①孕鼠：海马：孕18d，皮层或纹状体：孕16d②Neurobasal medium (Gibco-BRL, cat. no. 21103)L-Glutamine (Gibco-BRL, cat. no. 25030) 谷氨酰胺Glutamic acid (Sigma, cat. no. G-1626) 谷氨酸B27 (Gibco-BRL, cat. no. 17504)③Poly-D-lysine (mol wt 30,000—70,000) (Sigma, cat. no. P-7280)多聚赖氨酸④Hank’s balanced salt solution (HBSS) (Gibco-BRL, cat. no. 14025)⑤HBSS without Ca2+, Mg2+ (Gibco-BRL, cat. no. 14175)⑥trypsin 胰酶⑦NaHCO3⑧Na pyruvate (Gibco-BRL, cat. no. 11840)丙酮酸钠⑨Trypan blue, 0.4% 台盘蓝⑩巴氏吸管，前端用火抛光刻度吸管离心管闪烁瓶玻璃培养皿：小：3套大：2套冰袋、纱布手术器械、筛网培养瓶或培养板（2）步骤①准备a．配制试剂i) Poly-D-lysine（需保存在聚苯乙烯容器中，不能保存在玻璃、聚碳酸酯或聚丙烯容器中）配制硼酸缓冲液（pH8.4）A液（硼砂溶液）：1.907g硼砂溶于100ml纯水（0.05M），0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存B液（硼酸溶液）：1.237g硼砂溶于100ml纯水（0.2M）0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存4.5mlA液+5.5mlB液5mg P-D-L溶于10ml硼酸缓冲液中，配制成0.5mg/ml贮存液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存使用时用硼酸缓冲液稀释10倍。
ii)HBSS without Ca2+, Mg2+（D-Hank’s溶液）配制不含钙、镁的HBSS粉剂：4.75g溶于400ml纯水NaHCO3：0.175g加入溶液1M NaOH 调节pH至7.2-7.4纯水定容至500ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存iii）1M NaOH溶液配制NAOH：4g 溶于100ml纯水iv）0.125%胰酶+0.02%EDTAD-Hank’s溶液10mlEDTA 20mg 溶解后D-Hank’s溶液80ml胰酶125mg 溶解后1M NaOH溶液调节pH至7.2D-Hank’s溶液定容至100ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存v）D-Hank’s溶液配制（0.035% NaHCO3，1mM Na pyrurate，10mM HEPES，pH7.4）不含钙、镁的HBSS粉剂： 2.375g溶于200ml纯水NaHCO3：0.088g加入溶液HEPES：0.596g加入溶液Na pyrurate（100mM）： 2.5ml加入溶液1M NaOH 调节pH至7.4纯水定容至250ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存vi）Hank’s溶液配制（0.035% NaHCO3，1mM Na pyrurate，10mM HEPES，pH7.4）含钙、镁的HBSS粉剂： 2.45g溶于200ml纯水NaHCO3：0.088g加入溶液HEPES：0.596g加入溶液Na pyrurate（100mM）： 2.5ml加入溶液1M NaOH 调节pH至7.4纯水定容至250ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存vii）10%FBS的DMEM/F12（D/F12）90ml D/F1210mlFBSviii）Neurobasal/2% B27-A （0.5 mM glutamine， 25 μM glutamate ）Neurobasal： 98mlB27： 2ml200mM glutamine： 0.25ml25mM glutamate： 0.1mlix）Neurobasal/2% B27-B （0.5 mM glutamine）Neurobasal： 98mlB27： 2ml200mM glutamine： 0.25mlb．消毒：手术器械：眼科剪、眼科镊、筛网培养皿：玻璃培养皿：小：3套，大：2套纱布闪烁瓶、离心管巴氏吸管、刻度吸管（培养瓶、盖玻片等）c．塑料培养瓶或培养板的清洗、紫外消毒d．Poly-D-lysine 包被：将配制好的P-D-L铺于培养瓶或培养板，使其完全覆盖底面，置于培养箱1h或过夜。
神经元细胞培养步骤
海马神经元细胞培养一、实验前准备1.手术器械、培养皿、筛网的消毒2.多聚赖氨酸的配制3.培养板处理：（培养板中可加入小的圆形玻片，多次使用）(1)用多聚赖氨酸室温包被5min，随后吸取多余液体，晾干。
(2)用PBS洗一遍，吸取PBS后晾干备用。
4.胰酶的配制5.PBS的配制二、操作步骤1. 新生一天的小鼠，酒精喷洒全身，置于干净的培养皿中，用手术剪刀剪下头部，放入另外一个干净的培养皿中（五只）。
2.用干净镊子取出全脑放于（冰）的PBS的培养皿（10cm）中，置于解剖显微镜下。
3.移入解剖显微镜下，分离出皮层或海马组织，去除血点，移入盛有HOOD下的培养皿中。
4.将皮层或海马组织剪成1-3mm的小块，用0.25%，2ml胰酶-EDTA 消化，37ºC水浴消化30分钟，每消化10分钟振摇一下。
30分钟后，用移液枪吸取可见组织，放入离心管中，并加入与胰酶等体积的DMEM （HG）+10% FBS培养液终止消化，吹打20次左右，注意动作轻柔，不要吹打出气泡。
5.如果组织明显不能吹散或粘稠的话，过一下200目筛网。
过滤液DMEM，进入大离心管中。
离心800r，3min。
弃去上清，加入DMEM 培养液，分装在培养皿（6cm）中，放入含5% CO2 的37C恒温培养箱内培养。
6.6-8小时（或第二天）后换液，用PBS液先洗两遍，并上下左右摇晃10次左右，去除一些细胞碎片，随后培养液换成Neurobasal 培养液+B27（2%）+谷氨酰胺（0.5mM）（+双抗)继续培养，并且3天半换液一次。
7.到第八天时，将培养液换成新鲜Neurobasal无B27、谷氨酰胺、双抗，开始用于实验。
神经元细胞培养步骤
神经元细胞培养
灭菌准备：
1、将玻璃培养皿（3个）、滤器（清洗、换滤片、锡纸包裹）放入盒中、将盒拿到桶中灭菌
2、将显微镜搬至超净台灭菌
3、将直头镊（1个）、弯头镊（1个）放入盛有酒精的小烧杯，放入超净台
材料准备：17天孕鼠、冰块、75%酒精、50mL离心管、PBS、胰酶、培养基、双抗、注射器、灭菌的显微镜、灭菌的玻璃培养皿（3个）、10cm培养皿（1个）、计数器、包被好的培养板
1、处死孕鼠，取小鼠，放入50mL离心管（冰块上），移至超净台，
2、将小鼠倒入盛有PBS的玻璃培养皿中，关灯，开显微镜
3、将头取出（左手直头镊，右手弯头镊），放入盛有PBS的玻璃培养皿中
4、夹取皮层（皮质及髓质），放入盛有PBS培养皿中，移去显微镜
5、将PBS倒入50mL离心管
6、用枪弃去PBS，再以PBS洗3次，晃匀
7、弃去PBS，加入5mL胰酶，放于37℃细胞培养箱内5分钟
8、弃去胰酶，以PBS洗2次，吸掉
9、加入5mL PBS,对着底面吹打成悬液
10、吸至50mL离心管中，
11、灭菌后的滤器置于15mL离心管，用注射器将细胞加入，抽空气再吹数次
12、离心，25℃，1500rpm，5分钟
13、配制培养液，混匀
14、弃上清，将离心管中加入5mL培养液，吹打成悬液
15、再加入5mL培养液，再次吹打
16、加1滴加至计数器中央，显微镜下观察，
17、20—50个/每16小格，即20—50 ×104 = 2—5×105，若密度加大，则加入培养液稀释
18、加100uL至96孔板中（四边不用），晃匀，
19、放37℃细胞培养箱。
各类神经元细胞的培养方法
各类神经元细胞的培养方法神经元细胞是神经系统中的主要细胞类型之一，负责传递神经信息和调控神经功能。
神经元细胞的培养是神经科学研究和临床治疗的重要工具。
通过细胞培养，可以研究神经元的发育、功能和病理机制，同时也可以应用于药物筛选、组织工程和神经修复等领域。
下面将介绍一些常用的神经元细胞培养方法。
1.原代培养2.细胞系培养细胞系是已经建立起来的可持续增殖和培养的细胞株。
细胞系培养可以使用血清或无血清培养基。
通常，将细胞系继代传代，以保持其细胞特性和增殖能力。
细胞系培养可以持续扩大细胞数量，并用于大规模试验和应用，如药物筛选和基因表达研究等。
3.单细胞培养单细胞培养是将单个神经元细胞分离和培养。
首先，通过机械或酶消化方法将神经组织分散为单细胞悬浮液。
然后，通过单细胞分选技术，将单个神经元细胞分离并分配到各个培养孔中。
最后，单个细胞通过培养基提供的营养物和因子进行生长和分化。
单细胞培养是研究神经元个体特性、细胞发育和功能的重要手段。
4.同代培养同代培养是将同一类型的神经元细胞培养在同一培养物中，以形成功能连通的细胞群。
同代培养可以通过多孔膜培养皿、微流控芯片和三维支架等技术实现。
通过细胞之间的相互作用和联结，同代培养可以模拟神经系统的复杂性和功能，用于研究神经网络特性和神经系统发育。
5.共培养共培养是将不同类型的细胞培养在同一文化器皿中，以研究细胞之间的相互作用和信号传递。
常见的共培养方法包括胶质细胞和神经元细胞的共培养，以及神经元细胞和非神经元细胞的共培养。
共培养可以提供更接近体内情况的环境，用于研究细胞间相互作用和细胞发育过程。
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神经元培养步骤
新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定
11 21 1 培养器皿的预处理: 包被D -多聚赖氨酸: 将无菌处理的血盖片放入
24孔聚乙烯培养板( Falcon) 或直径为35mm 的塑料培养皿( Falcon) 内, 在培
养前24 小时用终浓度为50Lg/ ml 的多聚赖氨酸50Ll/ cm2 包被血盖片及培养
皿各孔, 37e 5% CO2 孵箱孵育过夜。
临用前吸弃D- 多聚赖氨酸液, HBSS
液清洗2 次即可使用。
1.大鼠大脑皮质神经元的分离及培养
2大鼠大脑皮质神经元的形态学观察
光学显微镜: 细胞接种后, 每天在倒置相差显微
镜下观察神经细胞的生长情况, 拍照记录。
台盼蓝染色计数活细胞取0.1 mL 的体积分数为0.4% 台盼蓝加到0.9mL 细胞悬液中, 充分混匀后立即滴加到血球计数板上并分别计数未染色的细胞数(活细胞) 及染色的细胞数(死细胞)。
用台盼蓝染细胞时, 活细胞拒染, 死细胞可摄取染料。
计算公式: 每mL原液的细胞数= 4个大方格的细胞总数/4 X 104X稀释倍数。
3-1神经元的免疫细胞化学鉴定
Dapi + NF
3-2大脑皮质神经元纯度的鉴定( Nissl. s 染色)
将细胞爬片的小玻片用0. 01 mo l/ L 的PBS 漂洗, 40 g/ L 多聚甲醛固定, 再用10 g/ L 甲苯胺蓝染色, 梯度酒精( 70%、80% 、95% 、100%) 分色, 置倒置相差显微镜下, 随机观察并计数30 个视野( 目镜10 @ , 物镜20 @ , 框面积0. 3 mm2) 内的神经细胞数。
连续观察10 d, 并拍照记录。
神经元比例( % ) = NF阳性细胞数/DAPI(+) 星形胶质细胞比例( % ) = GFAP阳性细胞数/DAPI(+)
鉴定②NF 荧光免疫细胞化学染色 : 神经丝( neurofilaments, NF) 蛋白是构成神经轴突和树突的主要结构成分 , 在中枢和外周神经系统的神经元细胞核周、特别是轴突有表达, 也是神经元特异性标志物之一。
固定后的细胞用PBS 洗2 遍, 每次5min,0.4%triton X- 100作用20min, PBS洗 3 遍, 山羊封闭血清封闭 30min, 加 NF 单抗( 1:50) 4℃孵育过夜 , PBS 洗 3 遍 , 加 FIT C 标记的
羊抗鼠二抗室温孵育 3h( 避光) , PBS 洗 3 遍 , 加 PI 作用 10min, PBS 洗后加 50%的甘油 PBS 封片 , 激光共聚焦显微镜下观察并照相 , 其中胞浆和核均着色者为阳性神经元 , 仅胞核着色者为阴性细胞。
4皮质神经元活性的测定( MTT 法)
1. 3. 3 海马神经元细胞活力测定3种培养液不同时间段(1、3、7和10 d)海马神经元活力状况:
1. 3. 3. 1 台盼蓝排斥实验
[5] 取出3组培养液培养不同时间段的神经元各10孔,用等量的0.15%台盼蓝浸染5m in,分别在倒置相差显微镜( X400)下随机观察并计数10个视野中神经细胞数(细胞总数不少于500个),根据不排斥染料的细胞数, 计算细胞的活力百分数。
细胞的活力(% ) =细胞总数-蓝染细胞(死细胞) /细胞总数。
1. 3. 3. 2 MTT测定
[6] 分别取3组培养液培养不同时间段的神经元进行MTT检测, 加入终浓度为
0.1 5 g/L的MTT, 4 h后弃去培养液, 再加入细胞溶解液(含40% N, N-二甲基甲酰胺, 10% SDS, pH41 0)溶解,用酶标仪测定各孔吸光度( K= 550 nm,OD值), OD值与细胞活性成正相关。
分别以1 X106、1 x 105 / m L 细胞悬液接种于96孔细胞培养板中, 每个接种密度设20 个重复孔, 同时设不加细胞的空白对照孔。
每2~ 3 d 半量换液1 次。
从培养第1 d 起, 加M T T( 5 m g/ m L) 到试验孔和空白孔中; 然
后用铝箔纸包起培养板, 在37 e 50m L/ L CO2 温箱中孵育4 h, 加DM SO 溶解M TT-甲结晶。
读取D570 nm 值, 以空白孔读取空白对照值;连续测定10 d, 绘制出吸光度和培养天数关系折线图, 确定神经元活性最强的时间。
将密度为2 x 105/ cm2的单细胞悬液种植于铺过多聚-L-赖氨酸的96孔培养板, 每孔200 LL, 设5个复孔。
每天取6孔, 每孔加入5 m g /mL 的MTT 液20 LL, 37 e 、体积分数为5% CO2 的饱和湿度下培养 4 h后取出, 去除上清, 每孔加150 LL DMSO , 振荡至蓝色颗粒全部溶解, 用酶标仪在490 nm 处、干涉波长655 nm 测出A 值。
根据A 值以各时间点吸光度的平均值为纵坐标, 时间(天数) 为横坐标, 绘制生长曲线。
摘要: 目的研究体外原代培养新生大鼠海马神经元的方法, 并观察其发育分化过程中形态学的变化。
方法生24 h内的W istar大鼠分离海马, 消化后差速贴壁, 种植在涂有多聚-L-赖氨酸的盖玻片上, 于不同时间在倒置显微镜下观察形态变化; 采用NSE免疫细胞化学技术鉴定神经元。
结果神经元12~ 24 h后大部分贴壁, 随时
制成细悬液。
转至塑料培养瓶中, 加入10% FBS 置CO2 培养箱( 37 e 、5%CO2、95% 湿度) 内。
差速贴壁1h后, 收获贴壁速度慢的神经元, 用台盼蓝染色法进行活细胞计数, 以1 @ 105的密度将细胞种植于6孔培养板中, CO2 培养箱中培养24 h后全量换液, 以后每周2~ 3次半量换液。
每天在倒置相差显微镜下观察神经元的生长情况。
关键失败
在细胞的分离过程中, 严格掌握脑组织消化分离时间、细胞接种数量是较重要的。
我们采用低浓度胰蛋白酶, 短时间( 0.125% , 15min) 消化的方法,尽可能减少分离过程中的化学损伤, 这样更好保持了细胞的活力。
细胞接种密度亦是影响培养效果的。
细胞接种密度也是影响培养效果的重要因素,一般接种密度应维持在 1 @ 105~ 1 @ 106
, 否则会因为密度太低使神经元缺乏相互间的支持和营养作用而死亡, 而密度过高神经元之间突起互相交错不便于观察单个神经元体外发
育过程中的变化。
差速贴壁是一种损伤小的纯化方法, 成纤维细胞、胶质细胞与神经元相比贴壁过程快; 而神经元在短时间内不附着或附着不稳定, 轻微震荡就可以浮起。
本结果表明差速贴壁法可以达到较高的纯度, 同时又避免了对神经元的人为损伤。
无菌环境
[ 3]曾用无血清的DMEM /F12作为海马神经元体外培养的培养液, 本研究发现培养24 h 后,神经元几乎没有突起生成, 48 h后细胞全部死亡,加入一定量的胎牛血清后神经元生长良好,但胎牛血清具有不稳定性, 且实验过程中需要添加阿糖胞苷抑制神经胶质细胞的生长,阿糖胞苷的加入和去除, 反复更换培养液,变更细胞的生长环境会对神经元的生长造成不良影响。
此外, 阿糖胞苷对神经元的生长也有一定的毒副作用。