厌氧性细菌及检验
厌氧菌检验的基本流程和注意事项
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临床检验主管技师 微生物检验 第十七章 厌氧性细菌及检验
第十七章厌氧性细菌及检验本章内容一、概述厌氧菌的分类厌氧菌的临床意义厌氧菌感染厌氧菌标本的采集与送检厌氧菌的分离与鉴定厌氧环境的指示二、常见厌氧菌破伤风杆菌产气荚膜梭菌肉毒梭菌艰难梭菌厌氧球菌无芽胞厌氧菌厌氧菌概述一大群专性厌氧，必须在无氧环境中才能生长的细菌。
G+有芽胞的梭菌：有芽胞，抵抗力强，广泛存在，可出芽繁殖，产生多种外毒素，引起严重疾病。
G+/G-无芽胞的球菌与杆菌：人体正常菌群，可存在于口腔、肠道、上呼吸道、泌尿生殖道等。
致病性属条件致病性的内源性感染。
厌氧菌概述——分类《伯杰系统细菌学手册》分类标准：无芽胞厌氧菌有40多个菌属，300多个菌种和亚种；而有芽胞的厌氧菌只有梭菌属，包括130个种。
据耐氧性分类（1）专性厌氧菌：是指在降低氧分压的条件下才能生长的细菌。
又分为极度厌氧菌（氧分压＜0.5%，空气中暴露10min致死，如丁酸弧菌）和中度厌氧菌（氧分压为2%～8%，空气中暴露60～90min能生存，如大多数人类致病厌氧菌）。
（2）微需氧菌：能在含5%～10%CO2空气中的固体培养基表面生长的细菌，如弯曲菌属。
（3）耐氧菌：其耐氧程度刚好能在新鲜配制的固体培养基表面生长。
一旦生长，暴露数小时仍不死亡，如第三梭菌、溶组织梭菌。
厌氧菌概述——临床意义及感染感染类型外源性感染：梭状芽胞杆菌属引起的感染。
内源性感染：无芽胞厌氧菌大多数是人体正常菌群，属于条件致病菌，在一定条件下可引起感染，一般不在人群中传播。
感染的危险因素：组织缺氧缺血；机体免疫功能下降；某些手术及创伤易发生厌氧菌感染；长期应用某些抗菌药物；深部需氧菌感染。
感染的临床指征：感染局部产生大量气体；多发生在黏膜附近；深部外伤后继发感染；分泌物有恶臭或为暗红色；常见于长期应用氨基糖苷类抗生素治疗无效的病例；镜检有细菌，常规培养阴性。
厌氧菌概述——标本的采集与送检重要原则：标本绝对不能被正常菌群所污染；应尽量避免接触空气。
适宜标本血液、骨髓、脑脊液、关节液、心包液、胸腔积液、腹腔液、胆汁、由活检或尸体解剖获得的组织标本、深部脓肿抽取物、经环甲膜以下或肺穿刺抽取的肺渗出物、后穹窿穿刺抽取的盆腔渗出液及无菌套管抽取的宫腔内容物、膀胱穿刺液及其它组织穿刺液等不宜标本鼻咽拭子、齿龈拭子、直肠拭子、喀出的痰液、自然排出的尿液和导出的尿液、流出的脓液、接近皮肤或黏膜的分泌物、阴道分泌物、胃和小肠内容物、粪便（艰难梭菌除外）等厌氧菌概述——标本的采集与送检采集多采用针筒抽取、穿刺等，应严格无菌操作，严禁接触空气。
厌氧菌及检验
二、厌氧菌感染
（一）厌氧菌在正常人体的分布
厌氧菌与需氧菌一起组成了人体的 正常菌群。人体许多部位厌氧菌在种类 和数量上远多于需氧菌，如在结肠中 99%的细菌都是厌氧菌。 临床厌氧菌感染中，由正常菌群的 无芽胞厌氧菌的感染最为多见。
常见厌氧菌在正常人体的分布
主要菌属
芽胞厌氧菌 梭菌属 无芽胞厌氧菌 革兰阳性杆菌 丙酸杆菌属 双歧杆菌属 乳杆菌属 优杆菌属 放线菌属 革兰阴性杆菌 类杆菌属 普雷沃菌属 紫单胞菌属 梭杆菌属 革兰阳性球菌 消化球菌属 消化链球菌属 革兰阴性球菌 韦荣菌属 0 ＋ ＋ ＋ ＋－ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋－ ＋－ ＋＋ ＋＋ 0 0 0 0 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋－ ＋ ＋ ＋ ＋＋ 0 0 ＋＋ 0 ＋ 0 0 ＋－ ＋－ ＋＝ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋－ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋－ 0 ＋－ 0 0 ＋－ ＋－ ＋＋ ＋－ 0 0 0 ＋＋ ＋－ ＋－
5. 厌氧袋运送法
6. 棉拭运送法 （略） 应在20~30min内处理完毕，最迟 不超过2h，防止标本中兼性厌氧菌过 度生长，抑制厌氧菌的生长。如不能 及时接种，应将标本保存于室温（因 冷藏对厌氧菌有害气味 直接涂片 染色镜检
分离培养
（接种非选择性及选择性培养基）
（二）厌氧菌感染的原因 1. 局部组织的氧化还原电势降低 如血 管损伤、烧伤、动脉硬化、肿瘤压迫、组织 坏死等，可造成局部组织的缺血、缺氧，使 Eｈ降低；此外，大面积外伤伴有需氧菌感 染消耗了氧，为厌氧菌感染提供了条件。 2 . 机体免疫功能下降 如接受免疫抑制 剂、放疗或化疗的患者；糖尿病、慢性肝、 肾疾病病人及老人、婴幼儿、早产儿等，因 免疫力下降易併发厌氧菌感染。
实验十二 厌氧性细菌(1稿)
实验十二厌氧性细菌（厌氧培养方法）厌氧性细菌（Anaerobicbacteria）是一大群必须在无氧或低氧环境中才能生长繁殖的细菌；一般情况下，这类细菌在无氧条件下比在有氧环境中生长好，不能在空气（氧气浓度大于18%）和（或）二氧化碳浓度小于10%以下的固体培养基表面生长。
这类细菌缺乏完整的代谢酶体系，其能量代谢多以无氧发酵的方式进行。
它能引起人体不同部位的感染，包括阑尾炎、胆囊炎、中耳炎、口腔感染、心内膜炎、子宫内膜炎、脑脓肿、心肌坏死、骨髓炎、腹膜炎、脓胸、输卵管炎、脓毒性关节炎、肝脓肿、鼻窦炎、肠道手术或创伤后伤口感染、盆腔炎以及菌血症等。
（一）无芽胞厌氧菌主要种类及生物学性状无芽胞厌氧菌共有23个属，与人类疾病相关的主要有10个属。
1.革兰阴性厌氧杆菌有8个属，类杆菌属中的脆弱类杆菌最为重要。
形态呈多形性，有荚膜。
除类杆菌在培养基上生长迅速外，其余均生长缓慢。
2.革兰阴性厌氧菌有3个属，其中以韦荣菌属最重要。
为咽喉部主要厌氧菌，但在临床厌氧菌分离标本中，分离率小于1%，且为混合感染菌之一。
其他革兰阴性球菌极少分离到。
3.革兰阳性厌氧菌有5个属，其中有临床意义的是消化链球菌属，主要寄居在阴道。
本菌属细菌生长缓慢，培养需5～7天。
4.革兰阳性厌氧杆菌有7个属，其中以下列3个属为主：（1）丙酸杆菌属：小杆菌，无鞭毛，能在普通培养基上生长，需要2～5天，与人类有关的有3个种，以痤疮丙酸杆菌最为常见。
（2）双歧杆菌：呈多形性，有分枝，无动力，严格厌氧，耐酸。
29个种中有10个种与人类有关，其中只有齿双歧杆菌与龋齿和牙周炎有关。
其他种极少从临床标本中分离到。
（3）优杆菌属：单一形态或多形态，动力不定，严格厌氧，生化反应活泼，生长缓慢，常需培养7天，最常见的是迟钝优杆菌。
（二）微生物学检查要从感染灶深部采取标本。
最好是切取感染灶组织或活检标本，立即送检医.学教育网搜集整理。
1.直接涂片镜检：将采集的标本直接涂片染色镜检，观察细菌形态、染色及菌量，为进一步培养以及初步诊断提供依据。
厌氧菌检验 微生物学实验
实验六、厌氧菌检验一、厌氧培养1、刨肉基法方法：将破伤风梭菌、产气荚膜梭菌分别接种在庖肉培养基中，35℃48h，观察结果。
2、厌氧罐法方法：将破伤风梭菌接种在高渗芽孢培养基中并放置于厌氧罐中；将破伤风梭菌、产气荚膜梭菌分别接种在血平板中并置于厌氧罐中，放厌氧袋，密闭，置35℃48h观察结果。
二、观察厌氧菌培养结果：1、庖肉基1）破伤风梭菌：肉汤混浊，部分消化，微变黑，有少量气体，有腐败性恶臭味。
2）产气荚膜梭菌：产生气体，肉渣呈粉红色，不被消化。
2、血平板1）破伤风梭菌：呈薄膜状生长，菌落半透明、灰白色、边缘疏松呈羽毛状，伴β溶血。
2）产气荚膜梭菌：多数菌株有双层溶血环，内环完全溶血，外环不完全溶血。
3、梭菌平板破伤风梭菌：形成直径1mm 以上不规则的菌落，中心紧密，周边疏松，似羽毛状。
三、涂片、革兰染色镜检：破伤风梭菌产气荚膜梭菌G-，细长，芽胞圆形，比菌体大，G+，粗短大杆菌，两端钝圆，单个或成双排列。
位于菌体顶端，使细菌呈鼓槌状芽胞椭圆形，位于菌体中央或次极端，芽胞直径不大于菌体四、芽孢染色：制片①5%孔雀绿加热3~5min，水洗甩干；②0.5%沙黄水溶液染色0.5~1.0min，水洗甩干干后镜检，如图所示：菌体呈红色，芽孢呈淡绿色。
破伤风梭菌产气荚膜梭菌五、汹涌发酵试验（试教）产气荚膜梭菌：分解乳糖产酸，使酪蛋白变性，同时产生大量气体，将凝固的酪蛋白冲成蜂窝状，并将液面上的凡土林层向上推挤，甚至冲开管口棉塞，气势凶猛，为“汹涌发酵”。
六、讨论：1、做生化试验时，有些细菌为致病菌，故实验时要保护好自己，且实验废弃物要妥善处理，以免发生有害菌的感染。
2、所有接种的菌株暴露于有氧环境中不得超过20min3、厌氧菌检验：可据厌氧菌的菌体形态、染色反应、菌落性状以及对某些抗生素的敏感性等作出初步鉴定。
最后鉴定则要进行生化反应及终末代谢产物等项检查。
4、破伤风梭菌微生物检验：根据破伤风的典型临床表现即可作出诊断，故一般不作细菌学检查。
厌氧菌的采集、送检、培养、分离鉴定及注意事项
厌氧菌在有氧的情况下不能生长。
要培养厌氧菌，必须创造一个环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。
如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。
常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。
1.厌氧缸法：接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。
2.厌氧袋：即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。
塑料袋透明而不透气，内装气体发生管、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。
放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。
先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。
如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育（较为推荐）。
3.厌氧手套箱：是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。
它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。
箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。
欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。
箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。
该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。
金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。
4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。
5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物，消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。
我没见过。
6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。
焦性末食子酸与碱反应后耗氧。
17章 厌氧性细菌检验
微生物学检验
• 分离培养 • PCR毒素鉴定 • 质谱方法 • VIDAS检测细菌AB毒素
第三节 革兰阴性无芽胞厌氧杆菌
第三节 革兰阴性无芽胞厌氧杆菌
革兰阴性无芽胞厌氧杆菌
临床常见革兰阴性无芽胞厌氧杆菌（non-spore-forming anaerobic gram-negative bacilli）的有
肉毒梭菌
• 芽胞椭圆形，粗于菌体，位于次极端，呈汤匙状或网球拍状 • 神经毒素分A～G 7个型，各型毒素只能被同型抗毒素中和 • 肉毒毒素不耐热，煮沸1分钟即可被破坏
致病性
• 致病物质 – 肉毒毒素 剧毒（对人致死量为0.1µg)
• 食物中毒
– 进食污染食物（多为罐头、肉制品、豆制品）发生食 物中毒--食入毒素
3～10:1 1:1 10:1 1:1 1:1 1,000:1
103-5/g 10:1 109-10/ ml 5:1
常见厌氧菌 丙酸杆菌，梭状芽孢杆菌 丙酸杆菌
韦荣球菌，普雷沃菌，卟啉单胞菌， 消化链球菌，拟杆菌（脆弱拟杆菌 除外），真杆菌 同牙垢 同牙垢 同牙垢 乳杆菌 厌氧链球菌，乳杆菌
拟杆菌，梭杆菌，真杆菌，双歧杆 菌，厌氧球菌 梭杆菌
• 严格厌氧，在血琼脂平板上，48h培养后，菌落直径3～5mm， 圆形，略凸起，白色或淡黄色、不透明、边缘不整齐、表面 粗糙。在CCFA平板上生长的菌落在紫外线照射下可见黄绿色 荧光
致病性
• 产生A、B两种毒素
– A毒素为肠毒素，能使肠壁出血坏死，液体积蓄 – B毒素为细胞毒素，能直接损伤肠壁细胞，造成伪膜性结
• 对氧敏感的破伤风溶血毒素(tetanolysin) • 质粒编码的破伤风痉挛毒素(tetanospasmin)
微生物学--厌氧性细菌
生化反应：十分活跃，可分解多种糖类，液化 明胶，H2S（+） 庖肉培基：肉渣呈粉红色，产生大量气体。
牛乳培基：汹涌发酵
产气荚膜梭菌汹涌发酵现象 （右为未接种管）
形，中或次极端，不大于菌 体。组织内无芽胞，无糖培 养基上易形成芽胞，可形成 明显的荚膜。
产气荚膜梭菌革兰染色
培养特性
（1）厌氧，要求不严格，微氧环境生长迅速。 （2）营养要求不高。含糖培养基发育最佳，无糖发
育不良，但有利于形成芽胞。 （3）繁殖迅速：通常培养2h在液体培养基深层即有
明显生长，4～6h后出现表面生长。 （4）庖肉培养基：混浊生长，产生气体，肉渣呈粉
所致疾病
• 气性坏疽：潜伏期短，仅为8～48h，细菌在局部繁殖， 产生多种毒素及侵袭性酶，造成病变部位水肿，水气 夹杂，触摸有“捻发感”，并产生恶臭，疼痛剧烈， 蔓延迅速，如不及时抢救，可因毒血症死亡.
• 食物中毒：某些菌株能产生肠毒素，食入被污染的食物，
引起食物中毒，其中毒机理类似霍乱肠毒素
• 坏死性肠炎：C型菌株引起，罕见。
形态与染色：
细长杆菌（4～8μm×0.3～0.5μm）周鞭毛，幼龄运动很活跃。 中等大小细长杆状，两端钝圆。无荚膜，芽胞正圆形，位于菌 体顶端，比菌体粗，呈鼓槌状，为本菌典型特征，G+菌，形成 芽胞后易形成G-。
•培养特性：专性厌氧pH7.0～7.5 37℃最适。
营养要求不高，普通琼脂即可生长。
指端气性坏疽
气性坏疽
防治原则
（1）早期彻底清创，局部用H2O2冲洗、湿敷，消除厌氧微环 （2）对感染局部应尽早施行手术，切除并消除感染和坏死组
临床检验技师-微生物检验(2019)讲义第十七章_厌氧性细菌及检验
第十七章厌氧性细菌及检验本章内容一、概述厌氧菌的分类厌氧菌的临床意义厌氧菌感染厌氧菌标本的采集与送检厌氧菌的分离与鉴定厌氧环境的指示二、常见厌氧菌破伤风杆菌产气荚膜梭菌肉毒梭菌艰难梭菌厌氧球菌无芽胞厌氧菌厌氧菌概述一大群专性厌氧，必须在无氧环境中才能生长的细菌。
G+有芽胞的梭菌：有芽胞，抵抗力强，广泛存在，可出芽繁殖，产生多种外毒素，引起严重疾病。
G+/G-无芽胞的球菌与杆菌：人体正常菌群，可存在于口腔、肠道、上呼吸道、泌尿生殖道等。
致病性属条件致病性的内源性感染。
厌氧菌概述——分类《伯杰系统细菌学手册》分类标准：无芽胞厌氧菌有40多个菌属，300多个菌种和亚种；而有芽胞的厌氧菌只有梭菌属，包括130个种。
据耐氧性分类（1）专性厌氧菌：是指在降低氧分压的条件下才能生长的细菌。
又分为极度厌氧菌（氧分压＜0.5%，空气中暴露10min致死，如丁酸弧菌）和中度厌氧菌（氧分压为2%～8%，空气中暴露60～90min能生存，如大多数人类致病厌氧菌）。
（2）微需氧菌：能在含5%～10%CO2空气中的固体培养基表面生长的细菌，如弯曲菌属。
（3）耐氧菌：其耐氧程度刚好能在新鲜配制的固体培养基表面生长。
一旦生长，暴露数小时仍不死亡，如第三梭菌、溶组织梭菌。
厌氧菌概述——临床意义及感染感染类型外源性感染：梭状芽胞杆菌属引起的感染。
内源性感染：无芽胞厌氧菌大多数是人体正常菌群，属于条件致病菌，在一定条件下可引起感染，一般不在人群中传播。
感染的危险因素：组织缺氧缺血；机体免疫功能下降；某些手术及创伤易发生厌氧菌感染；长期应用某些抗菌药物；深部需氧菌感染。
感染的临床指征：感染局部产生大量气体；多发生在黏膜附近；深部外伤后继发感染；分泌物有恶臭或为暗红色；常见于长期应用氨基糖苷类抗生素治疗无效的病例；镜检有细菌，常规培养阴性。
厌氧菌概述——标本的采集与送检厌氧菌概述——标本的采集与送检采集多采用针筒抽取、穿刺等，应严格无菌操作，严禁接触空气。
实验 厌氧性细菌形态.染色性及培养特性
产气荚膜梭菌荚 膜(体内易形成)：
4
培养特性
血平板
庖肉培养基 紫牛奶培养基
破伤风 梭菌
37℃ 48h，薄膜状爬 肉汤混浊，肉渣 无明显改变
行生长物，边缘不齐， 部分被消化，呈
伴轻度β 溶血
灰白色
产气荚 膜梭菌
菌落平整，光滑，边 分解肉渣中糖类 分解乳糖产酸，指
缘齐。有双层溶血环： 而产生大量气体。示剂变黄，培养基
内层完全溶血(θ 毒素
凝固,产生大量气体,
引起)，外层不完全溶
呈蜂窝状,将液面凡
血(α 毒素引起)
士林上推,甚至冲走
管口棉筛。
精y fermentation
Clostridium perfringens shows "stormy fermentation" of litmus milk. Acid turns the pH indicator litmus from blue to pink, acid and enzymes coagulate the proteins in the milk, and gas tears the curds apart.
精选ppt
6
Nagler 反应
产气荚膜梭菌产生卵磷脂酶(α毒素)，在蛋黄琼脂平板上， 卵磷脂酶分解蛋黄中的卵磷脂，生成的甘油二酯在菌落 周围形成乳白色混浊圈。当加入相应抗毒素后，卵磷脂 酶活性丧失，菌落周围不出现混浊圈。
精选ppt
7
产气荚膜梭菌致病性试验
培养液注入小鼠腹腔→ 断颈处死
37℃
5→-8h
剖腹→肝脏印
片→石炭酸复红负染
染色 涂片→自然干燥 →染液 →迅速水洗 →印干 →油镜检
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厌氧性细菌及检验● 考点概念及分类分布与临床意义厌氧菌标本的采集与送检分离与鉴定常见厌氧性细菌【内容讲解】一、厌氧菌概述概念：一大群专性厌氧，必须在无氧环境中才能生长的细菌。
分类：二、厌氧菌感染（一）厌氧菌在正常人体的分布及感染类型1.厌氧菌在正常人体的分布正常人的肠道、口腔、阴道等处均有大量的厌氧菌寄居。
厌氧菌与需氧菌和兼性厌氧菌共同组成人体的正常菌群，其中绝大多数为无芽胞厌氧菌。
其中肠道中的厌氧菌数量是大肠埃希菌的1000～10000倍。
表5-22-2 重要的厌氧菌种类及其在正常人体内的分布--------------------------------------------------------------------------厌氧菌皮肤上呼吸道口腔肠道尿道阴道--------------------------------------------------------------------------一、芽胞菌革兰阳性杆菌梭状芽胞杆菌属0 0 ±＋＋±±二、无芽胞菌（一）革兰阳性杆菌乳杆菌属0 0 ＋＋＋±＋＋双歧杆菌属0 0 ＋＋＋0 ±优杆菌属±±＋＋＋0 ±丙酸杆菌属＋＋＋＋＋＋？±放线菌属0 ±＋＋＋ 0 0（二）革兰阴性杆菌类杆菌属0 ＋＋＋＋＋梭杆菌属0 ＋＋＋＋＋±普雷沃菌属0 ＋＋＋＋＋＋＋紫单胞菌属0 ＋＋＋＋＋＋＋（三）革兰阳性球菌消化球菌属＋＋＋＋＋＋±＋＋消化链球菌属＋＋＋＋＋＋±＋＋（四）革兰阴性球菌韦荣菌属 0 ＋＋＋±＋--------------------------------------------------------------------------2.外源性感染梭状芽胞杆菌属引起的感染，其细菌及芽胞来源于土壤、粪便和其他外界环境。
3.内源性感染无芽胞厌氧菌大多数是人体正常菌群，属于条件致病菌，在一定条件下可引起感染，一般不在人群中传播。
（二）临床意义1.厌氧菌感染的危险因素1）组织缺氧或氧化还原电势降低。
2）机体免疫功能下降。
3）某些手术及创伤。
4）长期应用某些抗菌药物。
5）深部需氧菌感染。
2.厌氧菌感染的临床及细胞学指征1）感染组织局部产生大量气体，造成组织肿胀和坏死，皮下有捻发感，是产气荚膜梭菌所引起感染的特征。
2）发生在口腔、肠道、鼻咽腔、阴道等处的感染，易发生厌氧感染。
3）深部外伤如枪伤后，以及动物咬伤后的继发感染，均可能是厌氧菌感染。
4）分泌物有恶臭或呈暗血红色，并在紫外光下发出红色荧光，均可能是厌氧菌感染。
分泌物或脓肿有硫黄样颗粒，为放线菌感染。
5）分泌物涂片经革兰染色，镜检发现有细菌，而培养阴性者，或在液体及半固体培养基深部生长的细菌，均可能为厌氧菌感染。
6）长期应用氨基糖苷类抗生素无效的病例，可能是厌氧菌感染。
7）胃肠道手术后发生的感染。
三、厌氧菌标本的采集与送检注意：标本绝对不能被正常菌群所污染；应尽量避免接触空气。
1.采集表5-22-2 不同部位标本采集法--------------------------------------------------------------标本来源收集方法--------------------------------------------------------------封闭性脓肿针管抽取妇女生殖道后穹窿穿刺抽取下呼吸道分泌物肺穿刺术胸腔胸腔穿刺术窦道、子宫腔深部创伤用静脉注射的塑料导管穿入感染部位抽吸组织无菌外科切开尿道膀胱穿刺术-------------------------------------------------------------- 标本送到实验室，应在20～30分钟内处理完毕，不超过2h。
如不能及时接种，可将标本置室温保存。
（1）针筒运送；（2）无菌小瓶运送；（3）棉拭子运送；（4）厌氧罐或厌氧袋运送。
四、厌氧菌的分离与鉴定（一）直接镜检根据形态和染色性，结合标本性状与气味，初步对标本中可能有的细菌作出估计。
表 5-22-3 厌氧菌直接镜检初步鉴别----------------------------------------------------------------------- 菌名革兰染色形态及其他特征----------------------------------------------------------------------- 脆弱类杆菌G-b 两端钝圆，着色深，中间色浅且不均匀，且有气泡，长短不一产黑素普雷沃菌G-b 多形性，长短不一，有浓染和空泡，无鞭毛和芽胞。
标本有恶臭，琥珀味，紫外线照射发红色荧光具核梭杆菌G-b 菌体细长，两头尖，紫色颗粒菌体长轴成双排列，标本有丁酸味坏死梭杆菌G-b 高度多形性，长短不一，菌体中部膨胀呈圆球形韦荣球菌G-c 极小的革兰阴性球菌消化链球菌G+c 革兰阳性呈链状的小球菌乳酸杆菌G+b 细长，有时多形性，呈单、双、短链或栅状排列痤疮丙酸杆菌G+b 排列特殊呈X、Y、V或栅状，标本有丙酸气味双歧杆菌G+b 多形性，有分支呈Y、V形成棒状，标本有醋酸气味放线菌G+b 分支呈棒状、X、Y、V或栅状，脓汁中得黄色颗粒，有琥珀酸味破伤风杆菌G+b 细长、梭形或鼓槌形，有芽胞，有周鞭毛产气荚膜梭菌G+b 粗大杆菌，呈单或双排列，有芽胞，有荚膜艰难梭菌G+b 粗长杆菌，有芽胞，有鞭毛，近来发现有荚膜-----------------------------------------------------------------------（二）分离培养主要分初代培养和次代培养两个阶段，初代培养的一般原则是：（1）先将标本涂片染色直接镜检，指导培养基的选择；（2）尽量选用在厌氧菌中覆盖面宽的非选择性培养基；（3）最好多选1～2种覆盖面不同的选择性培养基；（4）尽量保证培养基新鲜；（5）要考虑到微需氧菌存在的可能。
1.选用适当的培养基接种培养基的使用，应注意下列各点：尽量使用新鲜培养基，2～4h内用完；应使用预还原培养基，预还原24～48h更好；可采用预还原灭菌法制作的培养基；液体培养基应煮沸10min，以驱除溶解氧，并迅速冷却，立即接种；培养厌氧菌的培养基均应营养丰富，并加有还原剂与生长刺激因子。
培养基的选择：初次培养一般都使用选择培养基和非选择培养基。
非选择培养基：本培养基使分离的厌氧菌不被抑制，几乎能培养出所有的厌氧菌。
ü 常使用心脑浸液琼脂（BHI）、布氏琼脂（BR）、胰豆胨肝粉琼脂（GAM）、胰胨酵母琼脂（EG）、CDC厌氧血琼脂等。
选择培养基：为有目的选择常见厌氧菌株，以便尽快确定厌氧的种类。
选择培养基培养基细菌KVLB血平板产黑素类杆菌早期产生黑色素七叶苷胆汁平板（BBE）脆弱类杆菌FS培养基（梭杆菌选择培养基）梭杆菌2.每份标本至少接种3个血平板，分别置于有氧，无氧及5%～10%C02环境中培养。
3.厌氧培养法厌氧罐培养法；气袋法；气体喷射法；厌氧手套箱培养法（迄今厌氧菌培养的最佳仪器之一）；平板焦性没食子酸法；生物耗氧法；高层琼脂培养法。
4.厌氧状态的指示：美蓝和刃天青。
无氧时均呈白色，有氧时美蓝呈蓝色，刃天青呈粉红色。
5.分离培养厌氧菌失败的原因：①培养前未直接涂片和染色镜检；②标本在空气中放置太久或接种的操作时间过长；③未用新鲜配制的培养基；④未用选择培养基；⑤培养基未加必要的补充物质；⑥初代培养应用了硫乙醇酸钠作为唯一厌氧菌培养基；⑦无合适的厌氧罐或厌氧装置漏气；⑧催化剂失活；⑨培养时间不足；⑩厌氧菌的鉴定材料有问题。
（三）鉴定试验（1）形态与染色：可为厌氧菌的鉴定提供参考依据。
（2）菌落性状：不同的厌氧菌其菌落形态和性质不同。
（3）抗生素敏感性鉴定试验：卡那霉素可用于梭杆菌属与类杆菌属的区分，甲硝唑用于厌氧菌与非厌氧菌的区分。
（4）生化特性：主要包括多种糖发酵试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂肪酸酶试验、蛋白溶解试验、明胶液化试验、胆汁肉汤生长试验以及硫化氢试验等。
（5）气液相色谱：可以利用该技术来分析厌氧菌的终末代谢产物，已成为鉴定厌氧菌及其分类的比较可靠的方法。
五、常见厌氧菌（一）破伤风杆菌1.生物学性状（1）形态与染色：G+，细长，有周鞭毛，无荚膜。
芽胞在菌体顶端，呈圆形，使整个细菌体呈鼓槌状。
（2）培养特性：专性厌氧菌，在普通培养基上不易生长。
血平板：扁平、灰白色、半透明、边缘不齐的菌落。
（3）生化反应：本菌一般不发酵糖类，能液化明胶，产生硫化氢，多数菌株吲哚阳性，不还原硝酸盐，对蛋白质有微弱的消化作用。
（4）抗原构造：本菌有菌体（O）抗原和鞭毛（H）抗原。
（5）抵抗力：繁殖体的抵抗力与其他细菌相似，但芽胞体抵抗力非常强，在干燥的土壤和尘埃中可存活数十年。
2.微生物学检查破伤风的临床表现典型，根据临床症状即可作出诊断，所以一般不做细菌学检查。
（1）特殊需要时，可从病灶处取标本涂片，革兰染色镜检。
（2）需要培养时，将标本接种疱肉培养基培养。
（3）也可进行动物试验。
3.临床意义引起人类破伤风，对人的致病因素主要是它产生的外毒素。
毒素对中枢神经系统有特殊的亲和力。
主要症状为骨骼肌痉挛。
典型的临床症状为咀嚼肌痉挛造成的牙关紧闭、呈苦笑面容，以及颈部、躯干及四肢肌肉持续强直性痉挛导致的角弓反张，呼吸困难，终因窒息死亡。
4.治疗原则（1）正确处理创口，包括清刨、扩创等，防止厌氧微环境。
（2）可以尽早注射破伤风抗毒素，也可同时给予类毒素。
在注射抗毒素前应做皮试。
（3）采用四环素、红霉素等进行抗感染治疗。
（二）产气荚膜梭菌1.生物学性状（1）形态与染色：革兰阳性粗大杆菌，芽胞呈椭圆型，次极端。
在机体内可形成明显的荚膜。
（2）培养特性：厌氧但不十分严格。
最适温度为45℃。
血平板：双层溶血环。
疱肉培养基：产生大量气体。
牛乳培养基：分解乳糖产酸，使酪蛋白凝固，同时产生大量气体，出现“汹涌发酵”现象。
（3）生化反应：本菌代谢活跃，可分解多种糖类，产酸产气，能液化明胶。
（4）分型：根据其产生的毒素，大体可将产气荚膜梭菌分成5个型别（A、B、C、D、E）对人类致病的主要为A型。
2.微生物学检查（1）直接涂片镜检：在创口深部取材涂片，革兰染色镜检，这是极有价值的快速诊断方法。
（2）分离培养及鉴定：可取坏死组织制成悬液，接种血平板或疱肉培养基中，厌氧培养，取培养物涂片镜检，利用生化反应进行鉴定。
3.临床意义致病物质：外毒素及多种侵袭酶类，外毒素以α毒素为主，本质为卵磷脂酶；还可产生透明质酸酶、DNA酶等。