亲和层析法纯化胰蛋白酶共61页文档
胰蛋白酶或抑制剂分离、纯化综合分析
实验胰蛋白酶或抑制剂分离、纯化在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。
在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca2+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链N -端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原分子量约为24 000，其等电点为pH8.9；胰蛋白酶的分子量约为23 400，其等电点为pH 10.8。
胰蛋白酶在pH3.0时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（0℃以下）数周而活性无显著丧失。
pH＜3时，胰蛋白酶易变性。
PH＞５时，胰蛋白酶易自溶。
胰蛋白酶催化活性的最适pH为7.6～7.8。
重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。
胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。
实验（一）胰蛋白酶活性测定[原理]胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。
此外，胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键，有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化学键的催化水解活性的敏感度为：酯键＞酰胺键＞肽键。
因此，可以利用含有这些化学键中任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化活性。
本实验方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯[（BAEE），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester]作为底物，水解反应如下：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸[（BA），benzoyl-L-arginine]的紫外光吸收。
在胰蛋白酶的催化下，BAEE随着酯键的水解，水解产物BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以△A253nm计算胰蛋白酶的活性。
胰蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm 增加0.001的酶量为一个BAEE单位。
实验报告亲和层析法纯化胰蛋白酶
亲和层析法纯化胰蛋白酶一. 实验目的1.理解亲和层析法的基本原理, 并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法；2.掌握利用紫外可见分光光度计测定酶活性和抑制酶活性的原理和方法。
二. 实验原理亲和层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。
这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方法。
许多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性。
这种分子之间的结合能力做亲和力。
亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。
所以有人称为“生物专一吸附技术”。
在实际工作中, 只要把被识别的分子, 称为配基（Ligand）, 在不损害其生物学功能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上（如Sepharose4B）制成亲和吸附剂, 然后装柱。
再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子, 这时绝大部分对配基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留, 只有与配基互补的化合物被吸附留在柱内。
当所有的杂质从柱上流走后, 再改变洗脱条件, 使结合在配基上的物质解离下来。
这样, 原来混合液中被分离的物质便以高度纯化的形式在洗脱液中出现。
本实验为了纯化胰蛋白酶, 采用胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂。
鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂, 对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用, 但不抑制糜蛋白酶。
在pH=7-8的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合, 而在pH=2-3时, 又能被解离下来。
采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从粗提液中通过一次亲和层析直接获得高纯度的胰蛋白酶制品, 比用经典分离纯化方法简便得多。
纯化效率可达到10-20倍以上。
1.三. 实验方法步骤2.鸡卵粘蛋白的制备取蛋清60ml, 加入等体积的三氯乙酸丙酮溶液（丙酮: 三氯乙酸=40:60）后, 出现大量白色沉淀, 搅匀后室温静置4h以上, 待清蛋白完全沉淀, 3000rpm离心10min, 弃去沉淀, 47ml上清液倒入250ml锥形瓶并用塑料薄膜封好, 置于冰箱中冰浴片刻, 缓慢加入3倍体积(141ml)的预冷丙酮, 搅匀后冰浴4h直到出现沉淀,用真空泵抽去部分上清液, 剩余部分的部分沉淀和上清液全部转移至离心管中, 以3000rpm下离心15min, 弃上清液。
10亲和层析纯化胰酶
实验14 亲和层析纯化胰酶一、原理在制备胰蛋白酶过程中，往往混杂着与胰蛋白酶相近似的蛋白水解酶，如胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。
由于三者在物理化学性质和结构上均十分接近，利用一般常用的提取分离方法，很难将它们之间彼此彻底分开。
为了获得高纯度的胰蛋白酶制品，采用亲和层析技术进一步纯化后、可达到十分满意的效果。
生物大分子化合物的重要特征之一是具有与某些相对应的分子通过次级键或共价键专一结合的能力即亲和力。
例如酶与抑制剂之间，抗原与抗体之间，结合的双方不仅是专一的，而且结合以后可以在不丧失生物活性的基础上用物理或化学的方法进行解离。
根据这一特性，如果把具有亲和力的一对分子的某一方连接于水不溶的固相载体上作为固定相，那么另一方随着流动相流经该固定相时，双方便亲和结合为一个整体。
然后只有改变某种物理条件或化学条件使结合的双方解离，即能得到与固定相有特异亲和力的某一特定物质。
这种利用生物分子和相对应分子之间亲和结合和解离性质而建立起来的层析方法称之为亲和层析。
亲和层析作为一种新型的分离纯化技术，可以用来纯化各种酶、抗体、抗原、维生素结合、传递蛋白、激素和药物的受体、核酸以及其他生物大分子化合物。
与一般的提纯生物大分子化合物的方法相比，亲和层析具有简单、快速、得率和纯化倍数高等显著特点，尤其适合实验室规模的微量生物大分子化合物的分离纯化。
但是，亲和层析也有其局限性。
由于某一种生物大分子化合物只与特定的配基之间具有亲和力，因此针对每一个分离对象不仅需要寻找和制备专一的固相配基，而且还需要选择特定的层析条件。
几乎没有统一的方法可供任意配套。
用于生物活性分子固相化的材料首先要求能够功能化，即具有能活化或修饰的功能基团，以使配基与之结合，除此之外，固相化材料必须具有稳定的物理化学性质，优良的流通性，非专一性吸附小等特性。
常用的固相载体有纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和交联琼脂糖等。
为了将配基偶联与固相载体上，需要使固相载体活化，即使载体具有与配基进行反应，生成共价偶联物的性质，其方法根据固相载体的性质而定。
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利于酸性蛋白的偶联。
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5、CM-生物胶A、亲和胶202和亲和胶102 CM Bio-Gel A，无“手臂” 的羧基衍生物； Affi-Gel 102具有6个原子“手臂”，未端为氨基。 Affi-Gel202具有10个原子的“手臂”，未端具有羧基；
（二）、空间障碍的影响
空间位阻。 对于分子大的配体以及小分
子配基更明显。
“手臂”，增加与载体相连 配基的活动度，减轻载体的 立体障碍。
常用的“手臂”多为烃链。
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（三）、配基与载体的结合位点的影响
多肽或蛋白质等大分子配基 须控制偶联反应条件，使它以最少的功能基
团与载体连接。 保持蛋白质原有的高级结构，使亲和吸附剂
（2）当ESI稳定性与EI相同时，I的存在并不 影响E对S的结合，非竞争性效应。
（3）反竞争性效应，即ESI比EI稳定，I使E与 S结合更紧密（负洗脱） 。
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反竞争性效应
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亲和层析中配基的选择和洗脱条件
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（三）、亲和吸附剂的再生
用缓冲液充分平衡后即可重复使用。 亲和力下降，非特异吸附增加，大多由
联。
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3、环氧活化型Sepharose 6B
由亲水“手臂”与Sepharose 6B载体 通过醚链形成的衍生物。
用于小分子配基的固定化。 用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。
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4、活化型亲和胶10和15
由N-羟琥珀酰亚胺与琼脂糖衍生物形成的活化酯。 Affi-Gel10的“手臂”长为10个碳原子，产生一些负电荷，有
择性。
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（二）、亲和层析的洗脱
生化实验讲义：实验十一亲和层析最后word资料8页
实验十一亲和层析纯化胰蛋白酶一、引言前面我们所学的凝胶过滤法、离子交换法以及电泳等一系列分离纯化生物大分子的手段，比起早期采用的盐析法，有机溶剂及等电点沉淀法等，分离效果要好得多。
但是，这些方法中，或是利用生物大分子在一定条件下不同的溶解度、电荷分布、总电荷的不同，或是依据其分子的大小和形状的不同。
一句话，多是利用生物分子间物理和化学性质的差异来进行分离纯化的。
由于这些方法的特异性比较低，加之待分离物质之间的物化性质差异较小，常常要综合不同的分离方法。
经过许多步骤才能使生物分子达到一定的纯度。
这样既费时间，又费试剂，有时最后产品还不能令人满意。
另外，有些生物大分子，往往在生物组织或发酵液中的含量很低，相对地说杂质很多，特别是一些具有生物活性的分子，往往由于分离纯化的步骤很多，时间过长，造成破坏以致失活，产率很低。
这就促使人们去寻求新的方法来解决存在的问题。
亲和层析法是近十多年来迅速地发展并广泛被采用来分离纯化生物大分子的一种十分有效的方法。
它具有分离快速，纯化效率高。
特别是对于那些含量少，杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子，显示了独特的优越性。
有时一次被分离物质的纯度可提高几倍，十几倍甚至几百倍。
因此，亲和层析技术已成为纯化生物分子，特别是纯化生物活性物质最重要的方法之一。
二、实验目的与要求1. 理解亲和层析法的基本原理，并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法；2. 理解和掌握亲和层析实验操作技术；3. 学会一种测定蛋白水解酶活力及比活的方法。
三、基本原理简言之，亲的层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。
这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方法。
许多生物分子都有一种独特的生物学功能。
即它们都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性（分子间通过某些次级键结合，如范德华力，疏水力，氢键等，在一定条件下又可解离）。
如：酶和底物（包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似物）的结合。
亲和层析法
第三节 提高吸附剂的操作容量
亲和吸附剂的操作容量的影响因素： 配体性质 配体在吸附剂中的含量 配体与吸附物结合时的位阻效应大小、 基质的多孔性 操作条件 等因素
一、在配体和基质之间引入“手臂”
1．原理
在配体和基质之间，特 别是在小分子的配体 和基质之间，引入适 当长度的“手 臂 ” ( arm)， 使 配 体 离开基质的骨架，
• 将琼脂糖衍生物与溴乙酰衍生物或琥珀酸酐等化合物 反应(见图7-9)后，再与含氨基、酚羟基和咪唑基等基 团的化合物反应，
• 即可生成一系列具有长短不等“手臂”的亲和吸附剂，
二、增加配体取代的程度
对一些解离常数较大的配体而言，增加配体在基质上 的浓度也是增加吸附剂结合量的有效手段。
增加配体数的方法是： 在配体量一定时，随着基质活性基团的增加(通过活化 时pH值的提高和溴化氰量的增加)偶联配体的量也相
• ①亲和力比较小时，可以连续用大体积平衡缓冲液洗 脱，得到迟缓的大分子物质峰。
• ②亲和力一般时，主要靠改变缓冲液的性质(如改变 pH值或离子强度，或者同时改变pH值和离子强度)， 使复合物之间的亲和力下降到足以分离的程度。
• ③亲和力较强时，可用与配体竞争的溶液或者用蛋白 质变性剂洗脱。
A．竞争性洗脱剂 这类洗脱剂的优点是专一性强，并能洗脱出和配体特 异结合的大分子物质。
• 2)间接测定法
①推算法
一般情况下，从加入配体的数量中减去配体与活化琼脂糖偶联后洗涤出 来的配体量，即可大致推算出配体的结合量。 ②根据亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的结合量 其方法有： 一是把亲和吸附剂装入柱(0.5cm×10cm)内，加入过量的欲分离大分子 物质，使其结合量达到最大，用适当的洗涤剂彻底洗去非专一性的物质， 然后再用特异的洗脱剂洗出欲分离的大分子物质。根据分离出的大分子 物质的量，计算出配体的结合量。 二是把少量纯品大分子物质陆续加到亲和层析柱中，直到饱和平衡为止，
亲和层析法纯化胰蛋白酶
3鸡卵粘蛋白的分离纯化 鸡卵粘蛋白的分离纯化 3.1 Sephadex G-25 柱脱盐 (1)溶胀 溶胀： 溶胀 称取15g Sephadex G-25放入500ml的烧杯中, 加入200ml 蒸馏水，在室温下溶胀24小时或在沸水浴中溶胀2小时。 (2)装柱 装柱： 装柱 取一支30×3cm 的层析柱，将溶胀好的Sephadex G-25 装柱，自然沉降。 (3) 处理 处理： 用2倍柱床体积的0.5mol/L NaCl 溶液洗柱，2倍体积的 蒸馏水洗去残留的NaCl。
1.1环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基的偶联
↓活化
↓偶联
↓亲和结合
↓洗脱
1.2溴化氰活化载体 与蛋白质配基的偶联
2亲和介质合成 亲和介质合成 2.1琼脂糖凝胶层析介质(Sepharose 4B)的活化 2.1.1 琼脂糖凝胶层析介质的处理 称取10克琼脂糖凝胶层析介质，置于G-3玻璃烧结漏斗内， 用100ml 1.0mol/L NaCl溶液抽洗（少量多次），100ml 蒸 馏水抽洗，抽干后转移到100ml三角瓶中备用。
图2，鸡卵粘蛋白在 ，鸡卵粘蛋白在DEAE-Cellulose柱的分离 柱的分离
3.3透析及丙酮沉淀 透析及丙酮沉淀 (1) 透析： 透析： 将经DEAE-Cellulose柱分离的鸡卵粘蛋白转入透析袋内， 对蒸馏水透析，隔一段时间换一次水，直到渗出液经 BaCl2溶液检查无氯离子存在，即可。 (2) 调pH值： 值 将透析好的鸡卵粘蛋白溶液，用0.1mol/L HCl 精确调 至pH4.0（最好一次调成功），量体积。 (3)丙酮沉淀： 丙酮沉淀： 丙酮沉淀 加入3倍体积的预冷丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，在 冰箱内静止4小时以上或过夜。
本实验以亲和层析方法分离纯化猪胰蛋白酶为目的， 从猪胰脏提取液中分离纯化胰蛋白酶，最终得到纯度较高 的胰蛋白酶。围绕亲和层析实验所涉及的蛋白质和酶基本 性质及相关技术进行综合训练。其中主要包括亲和层析介 质配基的制备，亲和介质的合成，蛋白质和酶的分离纯化， 酶活性的测定等内容。 通过综合训练，能够系统掌握蛋白质制备的基本原理 和操作，学习如何进行实验设计，掌握实验过程中的关键 环节，对实验中出现的问题进行科学的分析。使学生在学 习实验技术的同时，自觉培养分析问题和解决问题能力。
实训 亲和色谱纯化胰蛋白酶
实训亲和色谱纯化胰蛋白酶［任务描述］亲和色谱主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。
鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，在pH7.0～8.0的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在pH2.0～3.0时，又能被解离下来。
因此，采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从胰脏粗提液中通过一次亲和色谱直接获得活力大于10000BAEE单位/毫克蛋白胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简便得多，纯化效率可达到10～20倍以上。
本次实训任务为纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂-鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂，从胰脏粗提取液中纯化胰蛋白酶。
［任务实施］一、准备工作1.建立工作小组，制定工作计划，确定具体任务，任务分工到个人，并记录到工作表。
2.收集亲和色谱纯化胰蛋白酶工作中必须信息，掌握相关知识及操作要点，与指导教师共同确定出一种最佳的工作方案。
3.完成任务单中实际操作前的各项准备工作。
（1）材料准备鸡蛋清，新鲜猪胰脏。
（2）试剂与仪器试剂：丙酮、三氯乙酸、HCl、NaOH、NaCl、NaHCO3、Na2CO3、氯代环氧丙烷、乙腈、甲酸、Tris、CaCl2、KCl、DEAE-纤维素、Sepharose-4B、乙酸二氧六环二甲基亚砜。
主要贮存溶液：①鸡卵粘蛋白色谱液（1L）。
0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液。
②DEAE-纤维素处理液。
0.5mol/L HCl 300mL和0.5mol/L NaOH、0.5mol/L NaCl 各300mL。
③卵粘蛋白洗脱液。
0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液含0.3mol/L NaCl，150mL。
④标准胰蛋白酶溶液。
结晶胰蛋白酶以0.001mol/L HCl 配制成1mg/mL 。
⑤亲和色谱柱平衡液。
含0.5mol/LKCl 、0.05mol/L CaCl 2的0.1mol/L pH8.0 Tris-HCl 缓冲液500mL （配1000mL ：12.1g Tris ，37.5g KCl ，5.6g CaCl 2）。