缺陷假单胞菌

缺陷假单胞菌（B.diminuta）ATCC○R19146TM菌种鉴定

1.菌落形态

TSA平板：微黄，光滑，边缘整齐。

2. 革兰氏染色

2.1原理

通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

2.2实验步骤

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

1取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。

2 涂片：

液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。

固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。

3 晾干：让涂片在空气中自然干燥。

4 固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。

5 染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。

6 水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。

7 媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。

8 脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。

9 复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。至此，革兰氏染色结束。

2.3染色结果

革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。

缺陷假单胞菌是革兰氏阴性菌

3．靛基质（Indole）试验

3.1 原理

某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。

3.2 试验方法

将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36±1C培养24h时后，取约2ml 培养液，加入Kovacs氏试剂2~3滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。

缺陷假单胞菌为阴性结果

4．甲基红试验

4.1 原理

某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降至4.5以下，当加入甲基红试剂则呈红色，为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醚、气体和水等），则培养基的酸度仍在pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，是为阴性。

4.2 方法

挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于36±1°C或30°C （以30°C较好）3~5天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂1~2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。

4.3 结果

呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。

缺陷假单胞菌为阴性结果

5. V-P试验

培养基：含葡萄糖、K2HPO4、蛋白胨各5g，完全溶解于1000ml水中后，

分装试管内，间歇灭菌或10磅10分钟灭菌。

5.1 原理

某些细菌能从葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇（Acetymethyl carbinol）

→2，3-丁烯二醇（2，3-bytaylene cylycol），在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用，产生粉红色的化合物。

5.2 方法

5.2.1 O’Meara’s法

试剂：40g氢氧化钾溶于100ml蒸馏水中，加入0.3g肌酐即成。

用琼脂培养物将被检细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养后，于35～37℃（哈夫尼亚菌则应在22～25℃）培养48-96小时，。于每毫升培养物中加入0.1ml，猛烈摇振混合。

5.2.2 Baritt’s法

试剂：6％α-奈酚酒精溶液为甲液，40％氢氧化钾为乙液。

同上法接种培养细菌，于2ml培养液内加入甲液1ml和乙液0.4毫升，摇振混合。

5.3 结果

试验时强阳性者约于5分钟后，可产生粉红色反应，如无反应，应放在

36±1℃下培养4h再进行观察。（长时间无反应，可置室温过夜），次日不变者为阴性。

缺陷假单胞菌为阴性结果

6. 过氧化氢酶试验

6.1 试剂

3%过氧化氢溶液：临用时配制。

6.2 方法

挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2mL，观察结果。

6.3 结果

于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。

缺陷假单胞菌为阳性结果

7. 细胞色素氧化酶试验

7.1试剂

1%盐酸二甲基对苯二胺溶液，1%α-萘酚－乙醇溶液。

7.2 方法

取37℃(或低于37℃)培养20h的斜面培养物一支，将两种试剂各2～3滴，从斜面上端滴下，并将斜面略加倾斜，使试剂混合液流经斜面上的培养物。如系平板培养物，则可用试剂混合液滴在菌落上。

7.3 结果

于2min内呈现蓝色者为阳性。阳性培养物大多数于半分钟内出现强阳性反应，2min以后出现微弱或可疑反应均作为阴性结果。

缺陷假单胞菌为阳性结果

8. 麦康基琼脂培养基试验

麦康基琼脂培养基一种用于分离鉴定细菌的培养基，大肠杆菌在其上呈红色或粉红色，有的菌落只是中间呈现红色。由于含有胆酸盐，能抑制革兰氏阳性菌生长，有利于大肠杆菌和沙门氏菌的生长。

以麦康基琼脂培养基培养检测细菌，观察其生长情况。