第2课时 分离以尿素为氮源的微生物 学案(含答案)

第2课时分离以尿素为氮源的微生物学案（含答案）第第2课时课时分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物学习目标1.进行微生物分离。

使用含有尿素的培养基，采用涂布分离法，分离有脲酶的细菌。

2.使用酚红指示剂检测以尿素为氮源的细菌的存在。

3.说明分离以尿素为氮源的细菌的实验原理。

4.举例说明本实验分离出来的细菌不一定都是以尿素为氮源的细菌。

一.实验原理1.脲和脲酶1脲又称尿素，是蛋白质降解的产物。

人和其他哺乳动物的尿中都含有尿素，大量尿素的存在会对环境造成污染。

2脲酶降解尿素的酶。

3以尿素为氮源的微生物的特点含有脲酶，通过降解尿素作为其生长的氮源。

其利用尿素的反应式为NH22COH2O脲酶2NH3CO2。

2.实验目的1使用专一的培养基含有尿素分离专一的细菌有脲酶的细菌。

2利用指示剂颜色的变化检知酶脲酶所催化的反应。

3.实验原理1不同微生物利用的氮源种类不同，有一些细菌含有脲酶，通过降解尿素作为其生长的氮源。

2尿素在脲酶的作用下降解产生NH3，使培养基的pH升高，培养基中的酚红指示剂变成红色。

4.两种培养基的比较项目全营养LB固体培养基尿素固体培养基培养基组成0.25g蛋白胨，0.12g酵母提取物，0.25gNaCl，0.5g琼脂糖，25mL水0.025g葡萄糖，0.12gNaCl，0.12gK2HPO4，0.25mg酚红，0.5g琼脂糖，15mL水，10mL尿素溶液灭菌方法高压蒸汽灭菌10mL尿素溶液采用G6玻璃砂漏斗过滤灭菌，其余用高压蒸汽灭菌，60时两者混合上述属于选择培养基的是尿素固体培养基。

用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基的原因是琼脂中含有少量含氮化合物，用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的固化剂，是为了尽可能使培养基中只含尿素一种含氮化合物，以防止琼脂中的含氮化合物被不能以尿素为氮源的细菌利用，有利于对以尿素为氮源的细菌的筛选。

特别提醒能在选择培养基上生长的不一定是目的菌原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需进一步鉴定。

例1xx温州高二检测下列有关尿素培养基的叙述，错误的是A.根据物理性质划分，该培养基属于固体培养基B.培养基中的唯一氮源为尿素，用以筛选以尿素为氮源的微生物C.培养基中的酚红，用于鉴别以尿素为氮源的微生物D.培养基中加入G6玻璃砂漏斗过滤的尿素后，要用500g/cm2压力90以上灭菌30min答案D解析因为尿素加热会分解，所以应先将培养基经500g/cm2压力灭菌30min，再添加经过G6玻璃砂漏斗过滤后的尿素。

例2尿素是一种高浓度氮肥且长期施用没有不良影响，但尿素只有通过土壤中某些细菌的分解作用，才能被植物吸收利用。

某同学要分离出土壤中能分解尿素的细菌，并尝试进行计数，培养基配方如下表K2HPO4NaClH2O葡萄糖尿素酚红琼脂0.12g0.12g15mL0.025g2.0g0.25mg0.5g1分解尿素的细菌都能合成________，该种细菌在生态平衡中起到什么作用____________。

写出细菌分解尿素的反应式________________________________________。

2根据培养基的成分判断，该同学能否分离出土壤中分解尿素的细菌________填“能”或“不能”，原因是_________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________ ____________________________________。

3尿素在高温下容易分解，因此常用________________对尿素进行过滤灭菌，而该器材在进行过滤灭菌操作前应使用______________法进行灭菌。

答案1脲酶参与了氮循环或维持氮平衡NH22COH2O脲酶2NH3CO22不能琼脂是未被纯化的混合物，内含一定的含氮化合物，尿素不是唯一氮源，不能选择出只以尿素为氮源的细菌3G6玻璃砂漏斗高压蒸汽灭菌解析1含有脲酶的细菌通过降解尿素作为其生长的氮源，从而也起到维持生物圈氮元素平衡的作用，脲酶分解尿素的反应式为NH22COH2O脲酶2NH3CO2。

2从培养基的成分看，因为含有琼脂，所以不能分离出分解尿素的细菌，因为琼脂是一种未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。

3尿素在高温下易分解，应采用G6玻璃砂漏斗过滤灭菌，G6玻璃砂漏斗在使用之前，需采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。

方法技巧筛选菌株的原理1原理根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学.物理因素的抗性不同而制备培养基。

2方法在培养基中加入某种化学物质。

例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以筛选出金黄色葡萄球菌。

改变培养基中的营养成分。

例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能降解石油的微生物；用含无机碳源的培养基分离出自养型微生物。

改变微生物的培养条件。

例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离出厌氧型和兼性厌氧型微生物。

二.实验操作与分析1.实验中的对照设置1实验组以尿素固体培养基进行培养。

2对照组以全营养LB固体培养基进行培养。

2.实验步骤3.实验结果培养基细菌悬液稀释度104105LB固体培养基尿素固体培养基1稀释度为104的培养基中的平均菌落数多。

2在相同稀释度的情况下，尿素培养基中的平均菌落数少于LB培养基中的平均菌落数，其原因是大多数微生物不能利用尿素为氮源。

3在尿素培养基上的菌落周围会出现红色的环带。

归纳总结1.样品稀释的问题1稀释原因样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目。

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。

因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。

2稀释标准选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30300之间，便于计数。

2.与涂布平板有关的问题1防止培养基外溅在倒平板的过程中，不能将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。

2涂布器的灭菌玻璃刮刀用70酒精消毒，取出时，多余酒精在烧杯中滴尽，沾有少量酒精的玻璃刮刀在酒精灯火焰上引燃。

3设置对照可排除实验中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

3.酚红指示剂的选择本实验中，酚红作为酸碱指示剂被添加到了培养基中，其变色的pH范围是6.48.2，在酸性条件下呈黄色，碱性条件下呈红色。

以尿素为氮源的微生物培养一段时间后，由于细菌产生的脲酶向周围扩散，将培养基中的尿素分解，产生的NH3使培养基的pH升高变成碱性，于是培养基中的酚红指示剂变成红色，圆形红色区域愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强。

例3xx浙江名校“新高考”联盟请分析回答以下关于分离以尿素为氮源的微生物实验的问题1脲酶可以催化尿素分解为______________，其中碱性物质可以使酚红指示剂变为______。

2分离以尿素为氮源的微生物，培养基配制必须加凝固剂________，培养基在________g/cm2压力下灭菌30分钟，冷却至60，加入通过______________的尿素溶液，混合均匀待用。

3为了从土壤中分离得到以尿素为氮源的微生物，分离效果比较好的操作方法是采用______________，采用该方法分离，土壤溶液必须经过________处理。

答案1NH3和CO2红色2琼脂糖500G6玻璃砂漏斗过滤3涂布分离法稀释例4xx嘉兴模拟幽门螺杆菌Hp感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。

在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。

实验基本步骤如下配制培养基灭菌.倒平板X培养观察请回答1在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp中含有________，它能以尿素为氮源；若有Hp，则菌落周围会出现________色环带。

2下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是________灭菌。

A.高压蒸汽B.紫外灯照射C.70酒精浸泡D.过滤3步骤X表示________。

在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液____________到培养基平面上。

菌液稀释的目的是获得________菌落。

4在培养时，需将培养皿倒置并放在______________中。

若不倒置培养，将导致___________。

5常用的纯化微生物的方法除涂布分离法外，还有______________。

6临床上用14C呼气实验检测人体是否感染Hp，其基本原理___________________________。

答案1脲酶红2D3接种均匀涂布单4恒温培养箱无法形成单菌落5划线分离法6Hp能将14C标记的尿素分解为NH3和14CO2解析1幽门螺杆菌中含有脲酶，能将尿素分解成为NH3和CO2。

NH3为碱性，能使酚红指示剂呈红色，故菌落周围会出现红色环带。

2尿素在高温下会被分解，故不能用高温灭菌法，只能采取过滤的方法。

3由培养操作步骤可知，X为接种。

接种时，应将菌液均匀涂布在培养基上。

为了获得单菌落，接种前应该稀释菌液。

4为了形成单菌落还应该将培养皿倒置在恒温培养箱中。

分离以尿素为氮源的微生物实验前的准备实验目的实验原理实验设备.用品及材料实验过程倒平板制菌悬液涂布分离细菌倒置培养菌落数观察1.判断正误1在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂的目的是对分离的菌种作进一步的鉴定2制备土壤悬液，需用无菌水浸润土壤，然后从土壤稀释液底部取样3全营养培养基中含有较多菌落，而尿素培养基上含有少量菌落，最可能的原因是全营养培养基被污染4尿素固体培养基配制后需要在1211kg/cm2压力下灭菌15min5分离以尿素为氮源的微生物实验中的LB培养基和尿素培养基均为固体培养基6筛选微生物时要根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找，如筛选分解尿素的细菌要用尿素作为唯一氮源答案1234562.xx浙江名校协作体联考下列有关“分离以尿素为氮源的微生物”实验的叙述，正确的是A.对尿素溶液要使用70酒精浸泡灭菌B.分离出的菌落继续在固体培养基中扩大培养C.划线分离法比涂布分离法更易获得单菌落D.培养基中需加琼脂糖作为凝固剂答案D解析对尿素溶液要通过G6玻璃砂漏斗过滤进行灭菌，A项错误；分离出的菌落需要在液体培养基中进行扩大培养，B项错误；涂布分离法比划线分离法更容易获得单菌落，相比较而言，后者操作简单，C项错误；由于琼脂中含有氮元素，因此在分离以尿素为氮源的微生物实验中，凝固剂采用琼脂糖，D项正确。