第7章化学发光法
临床生物化学检验-第7章 临床酶学检验技术
酶活性的国际单位定义； 酶活性测定的连续监测法的概念、计算和分 类；酶活性测定的影响因素及最适条件的确定原则。
血清酶变化的病理机制；酶动力学参数的含义；电泳法和免疫抑制法 测定同工酶的原理。
酶蛋白质量测定的优点；定时法测定临床常用诊断酶的原理和评价； 同工酶的其他检测方法。
2
第一阶段（1908 ~ 1950） ：利用化学和有机化学的反应原理测定酶促反应生成量或底物消耗量定 时法测定AMY (1908年， Wohlgemuth)、 LPS、ALP、ACP等几种酶。
2. 国际酶学委员会将每种酶用4个数字加以系统编号： 数字前冠以EC ，数字之间用黑点 隔开。第一个数字表示酶的类别 ，第二个表示亚类 ，第三个表示亚-亚类 ，第四个表示 酶的编号序数：如EC1.1.1.27 LD (乳酸脱氢酶)。
3. 同工酶：催化相同化学反应， 但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的
心梗、肌病、颅脑损伤、肿瘤 心梗、肌病、肺梗死、肝病、肿瘤 肝胆疾病、骨病、妊娠、结肠炎、肿瘤
红细胞、前列腺、溶酶体 γ-GT1、 γ-GT2、 γ-GT3、γ-GT4
前列腺癌、血液病、骨肿瘤 肝癌、梗阻性黄疸
P-AMY(P1、P2、P3)、S-AMY(S1、 S2、 S3、S4) ALT、 mALT AST、 mAST
18
连续监测法（continuous monitoring assay）： 在多个时间点连续测定产物生成量或底物消耗量 ，选取线性期的速率来
计算酶活性 ，又称速率法。将酶与底物在特定条件 (缓冲液、温度等) 下孵育 ，每隔一定时间 (2s∼60s) 连续测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信 号的变化 ，从而计算出每分钟的信号变化速率 ，求 出酶活性浓度。 尤其适合在自动化分析仪上使用
仪器分析知识点复习
第一章绪论1.解释名词：（1）灵敏度（2）检出限（1）灵敏度：被测物质单位浓度或单位质量的变化引起响应信号值变化的程度。
（2）检出限：一定置信水平下检出分析物或组分的最小量或最小浓度。
2.检出限指恰能鉴别的响应信号至少应等于检测器噪声信号的（C ）。
A.1倍B.2倍C.3倍D.4倍3.书上第13页，6题，根据表里给的数据，写出标准曲线方程和相关系数。
y=5.7554x+0.1267 R2=0.9716第二章光学分析法导论1. 名词解释：（1）原子光谱和分子光谱；（2）发射光谱和吸收光谱；（3）线光谱和带光谱；（1）原子光谱：原子光谱是由原子外层或内层电子能级的变化产生的，表现形式为线光谱。
分子光谱：分子光谱是由分子中电子能级、振动和转动能级的变化产生的，表现为带光谱。
（2）吸收光谱：当电磁辐射通过固体、液体或气体时，具一定频率(能量)的辐射将能量转移给处于基态的原子、分子或离子，并跃迁至高能态，从而使这些辐射被选择性地吸收。
发射光谱：处于激发态的物质将多余能量释放回到基态，若多余能量以光子形式释放，产生电磁辐射。
（3）带光谱：除电子能级跃迁外，还产生分子振动和转动能级变化，形成一个或数个密集的谱线组，即为谱带。
线光谱：物质在高温下解离为气态原子或离子，当其受外界能量激发时，将发射出各自的线状光谱。
其谱线的宽度约为10-3nm，称为自然宽度。
2. 在AES、AAS、AFS、UV-Vis、IR几种光谱分析法中，属于带状光谱的是UV-Vis、IR，属于线性状光谱的是AES、AAS、AFS。
第三章紫外-可见吸收光谱法1. 朗伯-比尔定律的物理意义是什么？什么是透光度？什么是吸光度？两者之间的关系是什么？2. 有色配合物的摩尔吸收系数与下面因素有关系的是（B）A.吸收池厚度B.入射光波长C.吸收池材料D.有色配合物的浓度3. 物质的紫外-可见吸收光谱的产生是由于（B）A.分子的振动B. 原子核外层电子的跃迁C.分子的转动D. 原子核内层电子的跃迁4. 以下跃迁中那种跃迁所需能量最大（A）A. σ→σ*B. π→π*C. n→σ*D. n→π*5. 何谓生色团和助色团？试举例说明。
第七章 临床生化检查
硬化斑块
☆LDL为致动脉粥样硬化因子
【参考值】 ≤3.12mmol/L
【临床意义】
增高：与冠心病发病呈正相关；遗传性高脂蛋白血症
甲减，肾病综合征，阻黄，肥胖症。
减低：无β脂蛋白血症，甲亢，吸收不良，肝硬化，
低脂饮食，运动
Chapter7 临床常用生化检查
血糖 代谢 血脂 检查 无机 元素
(三) 脂蛋白与载脂蛋白测定
铁是人体不可缺少的微量元素，参与 Hb合成，是细胞色素C，过氧化物酶 的重要组成部分。 主要包括：血清铁，
血清总铁结合力， 血清铁蛋白。
甲功 检查
Chapter7 临床常用生化检查
血糖 1.血清铁测定
代谢 【原理】 是指与运铁蛋白结合的铁量。为铁转
血脂 检查
运池的一部分，不能完全代表体内总
铁水平。 【参考值】 成年男性11～30μmol/L
2.HDL-Ch测定 【原理】 HDL密度最大,含ApoA1。将肝以外组织CHO
运到肝分解→使血清FC在HDL中转化为CE →阻止FC在动脉壁和其他组织中积聚
☆HDL被称为抗动脉粥样硬化因子
【参考值】 ＞1.04mmol/L
心肌 标志 甲功 检查
【临床意义】 HDL与TG呈负相关，与冠心病呈负相关
1.增高：少量饮酒,长期体力活动,绝经前女性,慢性 肝炎,原发性胆汁性肝硬化。
血中脂肪的存在形式：
甘油三脂（TG）
磷脂（PL）
胆固醇及胆固醇脂（CHO及CE） 脂肪酸（FA）
(一)血清总胆固醇测定
(二)血清甘油三酯测定
(三)脂蛋白与载脂蛋白测定
Chapter7 临床常用生化检查
血糖 (一)血清总胆固醇测定（TC）
代谢 血脂 检查
化学发光检测
第一章化学发光技术一、免疫学检测发展阶段免疫学检测主要是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段,由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显示,因此常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。
我国免疫学的检测基本历经了以下几个过程,如图1。
1所示。
20世纪60年代70年代90年代时间图1.1免疫学检测发展阶段尽管免疫诊断在临床诊断中占据着非常重要的地位,但是从我国临床免疫诊断现状来看,无论是临床应用方面，还是产业化角度，都处于相对比较落后的状态,亟待改进.下表１.１就此做一比较：表1.1 中国免疫诊断现状由以上分析不难看出，化学发光免疫检测是大势所趋；而取代进口，发展我国的化学发光检测事业，正是临床检验界着手发展的方向。
由此,我公司自1998年立项至今，致利于化学发光检测方案设计,自行开发了具有国内领先水平的化学发光底物，与国外知名检测仪器生产商联合开发了化学发光全自动、半自动检测仪，并自行设计开发了化学发光管理软件，而今形成了仪器、试剂、软件全面配套，为我国的临床检验界提供了一套完善的解决方案。
二、化学发光免疫分析技术【概述】本世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析，利用发光的化学反应分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质.目前，这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段.化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术.其检测原理与放射免疫（RIA）和酶免疫（EIA）相似,不同这处是以发光物质代替放射性核素或酶作为标记物，并藉助其自身的发光强度直接进行测定。
化学发光免疫分析既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作。
且测试中不使用有害的试剂,试剂保持期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作,成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。
第七章分子发光荧光与磷光详解演示文稿
i1
kF、 kp主要取决与荧光物质的分子结构； st系间窜跃效率。
ki主要取决化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。
大多数的荧光物质的量子产率在0.1~1之间；
例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，F=0.55； 荧光素 F=1
化合物
F 0.11
第三十一页，共69页。
第十二页，共69页。
S1
外转移
荧光
反系间 窜跃 系间 窜跃
１. 辐射跃迁的类型
共振荧光：10-12 sec 荧 光：10-8 sec 磷 光：1~10-4 sec 迟滞荧光:102~10-4 sec
２. 无辐射跃迁的类型
振动弛豫: Vr 10-12sec T1 外 转 移:无辐射跃迁回
迟
到基态
滞
荧 光
lex =290nm (MAX)
l
lem= 620nm(MAX)
镜像规则的解释
大多数吸收光谱的形状表明了 分子的第一激发态的振动能级 结构，而荧光发射光谱则表明 了分子基态的振动能级结构
一般情况下，分子 的基态和第一激发 单重态的振动能级 结构相似，因此吸 收光谱的形状与荧 光发生光谱的形状 呈镜像对称关系。
对于处于S1(T1)电子态的荧光体来说，其平均 寿命()可以左式表示：
F(P)
1
n
kF(P) ki
i1
第三十页，共69页。
3. 荧光(磷光)的量子产率
荧光量子产率的定义：
发射荧光的分子数
F 激发分子总数
发射磷光的分子数
P 激发分子总数
F
kF
n
kF ki
i1
P st
kP
n
kP ki
1. 分子能级与跃迁
第七章__酶联免疫分析法
第一节 酶联免疫分析概述
酶联免疫分析常用酶
酶 辣根过氧化物酶 酸性磷酸酶 碱性磷酸酶 β-D-半乳糖苷酶 葡萄糖氧化酶 脲酶 青霉素酶 过氧化氢酶 葡萄糖淀粉酶 碳酸苷酶 乙酰胆碱酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 溶菌酶 苹果酸脱氢酶 无机焦磷酸酶 荧光素酶 丙酮酸激酶 来源 辣根 动植物 牛肠 大肠杆菌 曲霉菌 Jack豆 — 肝 根霉菌 牛红细胞 — 肠系膜明串细菌 鸡卵白 猪心线粒体 大肠杆菌 发光生物 哺乳动物组织 EC编号 1.11.1.7 3.1.3.2 3.1.3.1 3.2.1.23 1.1.3.4 3.5.1.5 3.5.2.6 1.11.1.6 3.2.1.3 4.2.1.1 3.1.1.7 1.1.1.49 3.2.1.17 1.1.1.49 3.6.1.1 1.3.12.7 2.7.1.40
第二节 酶联免疫吸附分析法
一、光度酶联免疫分析 1、酶联免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）原理 ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面； ②抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或抗体； ③在测定时，使受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步 骤与固相抗原或固相抗体起反应； ④用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与 其他物质分开，结合在固相载体上的酶量与标本中受 检物质的量成一定的比例； ⑤加入酶反应底物，底物被酶催化为有色产物，产物量 与标本中受检物的量相关，用分光光度法进行定量。
第一节 酶联免疫分析概述
2、抗原、抗体与免疫反应 • 抗原是能够引起免疫反应的分子。 • 免疫原性（immunogenicity）指诱导刺激免疫系统产 生抗体或致敏淋巴细胞的能力。 • 具有免疫原性的物质称为免疫原（immunogen）。 • 免 疫 反 应 原 性 （ immunoreactivity ） 或 抗 原 性 （ antigenicity），指能与相应抗体或致敏淋巴细胞发 生特异性结合，引起免疫反应的性能。 • 具备上述两种特性的物质为完全抗原，仅具有免疫反 应性的物质被称为半抗原（hapten）。
第七章 分子发光分析
如8-巯基喹啉在下列四种不同极性溶剂中的情况
溶剂 介电常数 四氯化碳 2.24 氯仿 5.2 丙酮 21.5 乙腈 38.8
荧光峰λ/nm 荧光效率
390
0.002
398
0.041
405
0.055
410
0.064
22:50
③ 溶液pH值对荧光强度的影响 不同的pH值，化合物所处状态不同，不同的 化合物或化合物的分子与其离子在电子构型上有 所不同。 对于金属离子与有机试剂形成的发光鏊合物， 一方面pH会影响鏊合物的形成，另一方面还会 影响鏊合物的组成，因而影响它们的荧光性质。 如：苯酚在酸性溶液中呈现荧光，但在碱性 溶液中，无荧光。
浓度范围为：10-5μg/ml～100μg/ml 。对于较 浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光 强度和浓度不呈线性关系,将向浓度轴偏离。
22:50
（2）影响荧光强度的因素 ① 溶剂对荧光强度的影响 一般来说，随着溶剂介电常数的增大，荧光 峰的波长越大，荧光效率也越大。 ② 温度对荧光强度的影响 温度上升使荧光强度下降。
22:50
① 碰撞猝灭 处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰 撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方 式回到基态，产生猝灭作用。 。
② 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧 光的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液 吸收光谱的改变。
22:50
③ 氧的猝灭作用 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三 重态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们 在与其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭 效应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的 荧光物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子 和三重态的荧光物质分子，使荧光猝灭。
第章 化学发光免疫试验
化学发光免疫试验概述化学发光免疫试验（chemiluminescent immunoassay, CLIA）是近年来发展起来的一种基于免疫反应的高灵敏度、高特异性检测方法。
它是以化学发光为信号输出的一种免疫學方法，是在传统免疫吸附、酶联免疫吸附、放射免疫分析等法则之外发展起来的新技术。
CLIA作为一种高灵敏度检测技术已被广泛应用于生物学、医学、环境、食品卫生、工业监测等领域。
原理CLIA常用的化学发光反应体系主要包括过氧化物作为发光中介体、碱性磷酸酶作为标记酶、4-氯-1-萘醌（CN）作为放大剂等，化学发光反应过程中形成活性氧、自由基等物质，体系瞬间发出蓝、绿、紫、黄等颜色的光辐射。
其中，酶标测定和非酶标测定是CLIA的两种常见形式。
酶标测定酶标测定中，免疫分析物与特异性抗体结合，在反应系中剩余的抗体与标记酶结合，随后用底物激活酶标记，使得化学反应体系中产生光辐射。
根据光信号强度反推出免疫分析物的含量。
非酶标测定非酶标测定中，则是使用荧光物质等标记物质，将样本中的目标抗原与标记物质竞争结合在一起，然后用乳化剂等物质诱导荧光化学发光反应进行测量。
优势相较于传统的免疫测定方法，CLIA具有如下优势：1.灵敏度高：CLIA的检测限度达到亚纳摩尔左右。
2.特异性高：由于化学反应的特性，CLIA能区分出高度相似的生物分子。
3.抗干扰性强：CLIA使用物质为化学中介体和荧光标记，避免了干扰物质对分析物的影响。
4.操作简单：CLIA的整个检测过程完全自动化，操作简单，重复性好。
5.安全可靠：CLIA最大程度避免了有害物质的使用，减少了对操作人员的危害。
应用CLIA目前已广泛应用于生物学、医学、环境、食品卫生等领域。
其中包括：1.临床药学：用于检测临床标志物的含量，如病毒、细菌、癌细胞、药物等。
2.免疫学研究：用于鉴定和检测生物分子，如单克隆抗体、蛋白质等。
3.环境监测：用于检测空气质量、水质质量等污染物的含量。
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发光机理有待进一步研究 定性能力差
2. 化学发光分析的基本原理
2.1.化学发光反应的基本条件
发光反应必须满足以下条件 1. 化学反应必须产生足够的化学能 化学发光基于化学反应提供足够的能量
A + B → C* +D 产物接受反应能被激发 在可见光区观察化学发光，需170~300kJ·mol-1激发能。具 有过氧化物中间产物的氧化还原反应可满足要求。化学反应 多是在有O3、H2O2等参加的高能反应中。 2. 处于激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态
C* → C + h
2.2.化学发光效率和发光强度
激发光
激发态
化学反应
激发态 基态
基态Leabharlann 化学发光与荧光的主要区别： 受激发时所需的能量来源不同
化学发光：需要化学反应过程中所提供的化学能激发 而发光 荧光：光源激发而发光
1.2.化学发光分析具有以下特点
（1）灵敏度高——例：用荧光素酶和三磷酸腺苷ATP 的化学发光反应，可测定低至2×10-17 mol·L-1 ATP
第7章化学发光法
秋夕
杜牧
银烛秋光冷画屏， 轻罗小扇扑流萤。 天阶夜色凉如水， 坐看牵牛织女星。
1.概述
1.1.基本原理
化学反应
激发态 基态
化学发光是由化学反应提供的能量激发物质所产生的光 辐射。生物发光是指产生于生物体系中的化学发光。基于这 类发光现象的分析方法，称为化学发光（或生物发光）分析 法。
（≥600nm） 常温下产生化学发光，灵敏度可达1ng·mL-1 测定范围0.01~10000 g·mL-1 CO + O（原子氧） →CO2* CO2* → CO2 +h
（=300~500nm） 灵敏度为1ng·mL-1
2.4.化学发光分析仪器
2.4.1. 分立取样式
——是一种在静态下测量发光信号的装置，它利用移 液管或注射器取一定量的试剂与试样加入发光反应池中混 合，化学发光反应立即发生，发光信号通过光电倍增管检 测，记录下发光强度。根据发光峰面积的积分值或峰高进 行定量分析。
NH2 O NH NH
[ 氧化剂 OH-
NH2
COO
]*
O
COO
3 –氨基苯二甲酰环肼
NH2 COO
+hv
COO
425 nm
反应产生的化学能被产物氨基邻苯二甲酸根 吸收，处于激发状态，返回基态时发射荧光
可检测低至10-9 mol·L-1 的H2O2
• 鲁米诺与H2O2的化学反应，可以被一些痕量的过 渡金属元素所催化，使发出的光大大增强，由此 可测定Co（Ⅱ）,Cu（Ⅱ）, Ni（Ⅱ）, Cr（Ⅲ）， Fe（Ⅱ Ⅲ ），Ag（Ⅰ），Au（Ⅲ ），Mn (Ⅱ) ， Hg（Ⅱ ）Os（Ⅲ ⅣⅤ），Ru（Ⅵ），V（Ⅳ）， Ir（Ⅳ）等金属离子，检测限由0.01~40 g·mL-1 不等
——研究和应用的比较广泛的有鲁米诺（Luminol） 光泽精、没食子酸、洛粉碱、过氧草酸盐等。
• 鲁米诺是最常用的发光试剂，它可以测定Cl2、I2、 HOCl、OCl-、H2O2、O2和NO2，产生化学发光反 应时量子效率为0.01~0.05。
• 鲁米诺（3 –氨基苯二甲酰环肼）在碱性溶液中和 H2O2等氧化剂反应生成最大波长为425 nm的光辐 射。
• 化学发光强度 ICL（t）与反应速度、化学发光效 率有如下关系
ICL(t)
CL
dc dt
ICL随时间和反应物的消耗逐渐减小
对下列化学发光反应 A +B →C* +D
C + h
A + B →C* +D
• A为待测物质，C为发光物质，当反应物B的浓度 远远过量于待测物浓度时，B的浓度可认为是常 数。因此，发光反应可视为一级反应
No Image
I
2000 1800 1600 1400 1200 1000
800 600 400 200
0 0
20000
40000
根据峰高计算含量
60000
T/ms
80000
100000
120000
谢谢观赏
dcA dt
k1cA
IC(Lt)CL ddA ctCL k1cA
t 时刻的发光强度与该时刻的分析物浓度成正比 化学发光总强度与分析物浓度呈线性关系。根据
已知时间内的发光总强度来定量分析。
发光总强度 SICd L t CLd dA c d t t CL cA
2.3.化学发光反应的类型
2.3.1. 液相化学发光
• 利用鲁米诺发光体系可以测定50余种元素和大量 有机和无机化合物，灵敏度都比较高。
• 鲁米诺化学发光体系还可用于许多生化反应研究， 常常涉及到H2O2的产生或H2O2参加反应。
2.3.2.气相化学发光
——广泛应用于大气污染监测、可监测空气中的O3； NO；NO2；SO2；H2S；CO；乙烯等。
• 在原气子相氧中 也O能3氧能化氧N化ON、OS、O乙2、烯C等O产等生产化生学化发学光发，光 例： NO + O3 → NO2* + O2 NO2* → NO2 +h
激发态分子的化学效率
• 化学发光效率CL
发射的光子数
激发态分子的发光效率
CL参加反应的分子 数 r f
激发态分子数发射的光子数 参加反应的分子激数发态分子数
r 取决于发光所依据的化学反应本身 f 与荧光效率的影响因素相同，既取决于发光体 本身的结构和性质，也受环境的影响。
化学发光强度
• 具有高效率的化学发光是生物体中。亦称生物发 光。如：萤火虫发光反应的效率几乎接近100%。 非生物体的化学发光效率一般不超过1%
发射的光子数
CL参加反应的分子数r f
激发态分子数发射的光子数 参加反应的分子激数发态分子数
注射器
光电倍增管
仪器具有设备简单，造价低，体积小，灵敏度高等优点。 缺点：手工进样重复性差，测定精密度不高；难以实现 自动化，分析效率低。
2.4.2. 流动注射式
是动态测量法， 试液和试剂通过蠕 动泵传送，并在流 动中进样混合，恰 好流动至盘管中反 应发光，流动注射 式发光分析的自动 化程度、精密度和 准确度都比较高， 分析速度快，适用 于批量试样的测定。