细胞基因敲除策略
Hela细胞
Hela细胞在细胞死亡研究中的应用
• 利用Hela细胞模型研究细胞凋亡和自噬等细胞死亡途径
• 通过检测细胞内凋亡相关蛋白的表达和细胞死亡途径的激活，研究细胞死亡途径的
调控机制
Hela细胞在细胞信号传导与通路研究中的价值
Hela细胞在细胞信号传导研究中的应用
Hela细胞研究
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01
Hela细胞的基本介绍与应用领域
Hela细胞的来源与历史背景
Hela细胞来源于一位美国妇女的宫颈癌细胞
• 1951年，美国科学家George Gey和同事从一名宫颈癌患者的活体组
织中分离出Hela细胞
• Hela细胞具有无限增殖的能力，成为生物学研究中常用的细胞模型
敲除
敲入
• 通过基因敲除，研究细胞内基因的功能和调控机制
• 通过基因敲入，研究细胞内基因的功能和调控机制
Hela细胞在基因治疗研究中的潜在应用
Hela细胞在基因治疗研究中的应用
• 利用Hela细胞模型研究基因治疗的方法和效果
• 通过基因治疗，实现对肿瘤细胞的治疗和预防
Hela细胞在基因治疗研究中的潜在问题
Hela细胞在细胞器功能与蛋白质组学研究中的作用
Hela细胞在细胞器功能研究中的应用
• 利用Hela细胞模型研究细胞内细胞器的功能和调控机制
• 通过检测细胞内细胞器相关蛋白的表达和功能，研究细胞器的功能和调控机制
Hela细胞在蛋白质组学研究中的应用
• 利用Hela细胞模型研究细胞内蛋白质的表达和调控机制
巨噬细胞中基因敲除
巨噬细胞中基因敲除
巨噬细胞中的基因敲除是一种基因编辑技术，用于研究特定基因在巨噬细胞中的功能和作用。
这种技术可以通过使用特定的基因编辑工具，如CRISPR-Cas9系统，来精确地删除或失活巨噬细胞中的某个基因，从而观察这个基因缺失后对巨噬细胞功能的影响。
巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，具有吞噬、杀菌、抗原呈递等多种功能。
因此，研究巨噬细胞中特定基因的功能，对于深入了解免疫系统的功能和机制，以及开发新的治疗策略具有重要意义。
在进行巨噬细胞基因敲除实验时，首先需要选择合适的基因编辑工具和实验方法，然后制备巨噬细胞，并将基因编辑工具导入到细胞中。
接下来，通过筛选和鉴定，确定基因编辑是否成功，并观察基因缺失对巨噬细胞功能的影响。
需要注意的是，基因敲除实验具有一定的复杂性和风险性，需要严格遵循实验规范和伦理要求。
同时，由于巨噬细胞在免疫系统中的重要作用，基因敲除实验可能会对机体的免疫功能产生一定的影响，因此需要谨慎评估和控制实验风险。
总之，巨噬细胞中的基因敲除是一种重要的实验手段，可以用于研究特定基因在巨噬细胞中的功能和作用，为深入了解免疫系统的功能和机制提供重要的实验依据。
基因编辑细胞实验，看这篇就够了！
基因编辑细胞实验，看这篇就够了！相信在科研上默默努力的小伙伴一定听过或被安利过CRISPR-Cas9基因编辑技术，小编在初次了解到这个技术时，感觉它太强大了！特别是在基因功能研究中，常常会用到CRISPR-Cas9技术，例如构建基因敲除、基因定点突变和基因敲入的细胞等，方便和高效的标签已经牢牢贴在它的身上。
今天带大家一起回顾CRISPR-Cas9在细胞实验上的帮助吧！1.基因敲除基因敲除（Knock out，KO）是基因功能研究中的“减法”套路，也就是基因功能缺失的研究思路，当目的基因被敲除，基因功能丧失后，所出现的细胞表型变化我们便认为与该基因相关。
同时，这个“减法”套路可以用RNAi技术在转录水平上实现，但RNAi技术的调控原理是靶向mRNA，与CRISPR-Cas9技术的KO在效果上存在差异。
那么，下面给大家回顾一下整个敲除实验的流程和注意细节！首先，使用CRISPR-Cas9进行敲除基因有两种策略——移码敲除和片段敲除。
两种策略各有优缺点，需根据敲除细胞的类型和目的基因信息来综合选择。
设计合理有效的sgRNA是我们最终成功实现基因编辑的重要前提。
这里需要注意的是要尽可能选择切割效率高效和特异性好的sgRNA，避免影响其他基因和脱靶等情况。
获取sgRNA后，我们需要将其和Cas9转导到细胞内，常用的方法有RNP法、质粒法和慢病毒法。
三种方法都各具特点，RNP法简便、快捷和敲除效率较好；慢病毒法的敲除效率高，但存在影响其它基因和脱靶的风险；质粒法方便、简易，但效率较低。
编辑过后的混合细胞池存在各种细胞类型，可通过稀释等方法获得单克隆细胞，然后再通过PCR和测序鉴定基因型，筛选目标基因型的单克隆。
如果使用片段敲除的策略（敲除200bp以上），可通过PCR扩增敲除片段附近的区域，通过比较与野生型的电泳结果，能直观地知道敲除结果。
当然也需要对扩增的PCR产物进行测序，进一步明确基因型。
如果是移码突变策略，则需要扩增靶区域进行测序，明确基因型。
基因敲除技术及其进展
基因敲除技术研究进展及其在代谢工程上的应用The Current Status of Gene Knockout and its Application in MetabolicEngineering天津大学化工学院二零壹六年六月摘要基因敲除技术是20世纪80年代发展起来一项重要的分子生物学技术，在微生物代谢工程，动植物改造以及功能基因研究方面具有广泛的应用。
本文介绍了基因敲除的策略和在代谢工程中的作用，着重介绍了四种新兴的基因敲除策略：RNAi，ZFN，TALENs以及最近研究火热的CRISPR/Cas9。
并在最后展望了基因敲除技术尤其是新兴技术在相关领域的发展趋势，为基因敲除技术的进一步发展提供了参考。
关键词：基因敲除代谢工程同源重组CRISPR/Cas9ABSTRACTGene Knockout is an important molecular biotechnology which has developed sine 1980. It has been proved efficient in microbial metabolic engineering, transform of nimals and plants and functional genomics. In this review, we mainly introduced the strategies of gene knockout and its application in metabolic engineering.And four new strategies RNAi, ZFN, TALENs and CRISPR/Cas9 were highlighted in detail. At last, developing frontiers and application prospects of gene knockout were further discussed.KEY WORDS：gene knockout, metabolic engineering, homologous recombination, CRISPR/Cas9目录第一章基因敲除技术 (1)1.1基因敲除相关背景 (1)1.2基因敲除技术在代谢工程中的应用 (2)第二章基因敲除策略 (3)2.1传统的基因敲除策略 (3)2.1.1利用同源重组进行基因敲除 (3)2.1.2利用随机插入突变进行基因敲除 (4)2.2新兴的基因敲除策略 (5)2.2.1 利用RNA干扰引起的基因敲除 (5)2.2.2 锌指核酸酶基因打靶技术 (5)2.2.3 TALENs 靶向基因敲除技术 (6)2.2.4 CRISPR/CAS9基因敲除技术 (7)第三章前景展望 (9)参考文献 (10)致谢 (11)第一章基因敲除技术1.1基因敲除相关背景随着测序技术的迅速发展，生物体基因功能的研究已经成为当下最热门的课题。
Biomics_CRISPR_Cas9_基因敲除技术
CRISPR/Cas9 基因敲除技术CRISPR （ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats）RNA，是最近几年才发现的原核生物中的调控RNA，用以抵御病毒和质粒入侵。
在II型CRISPR系统中，CRISPR RNA（crRNA）与转录激活crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退火形成的复合物能特异识别基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂（double-strand breaks, DSBs）。
CRISPR-Cas系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。
多个科研小组的研究都显示，与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）相比较，CRISPR-Cas系统介导的基因组靶向实验在真核细胞中具有相似甚至更高的效率。
Biomics专注于RNA基因调控多年，最新推出基因组编辑工具CRISPR/Cas9专家系统，该系统灵活简单、可以对特定基因组位点进行切割置换，特异性高、细胞毒性低。
CRISPR/Cas9系统可广泛应用于基因组工程，如基因抑制，基因敲除，基因敲入，基因修复等。
CRISPR-Cas9体系的RNA-DNA识别机制为基因组工程研究提供了一项简便而强大的工具。
其最重要的优势是Cas9蛋白可在多个不同的gRNA的引导下同时靶向多个基因组位点，起到多靶点调控的作用。
z CRISPR与RNAi的区别目前已经广泛应用的RNAi技术的靶标是mRNA，而CRISPR通过RNA识别DNA序列然后再改变DNA序列，是可以遗传的。
由于编码mRNA的DNA序列只占总DNA的极少部分，因此靶向DNA序列的CRISPR的靶标要比RNAi广得多，更有可能筛选出针对某DNA序列的特异CRISPR靶标。
基因敲除方法的原理应用
基因敲除方法的原理应用1. 概述基因敲除是一种常用的遗传学实验技术，通过将目标基因从细胞或生物体中删除，以研究基因在生物体中的功能和调控机制。
本文将介绍基因敲除方法的原理和常见应用。
2. 基因敲除方法的原理基因敲除方法主要包括两个步骤：构建敲除基因载体和敲除基因导入目标细胞或生物体。
2.1 构建敲除基因载体1.确定目标基因：首先需要确定要敲除的目标基因。
可以通过文献资料和数据库查询，分析基因序列和功能等信息，选择合适的目标基因。
2.设计敲除基因：设计针对目标基因的敲除基因，通常采用DNA重组技术构建。
敲除基因通常包括选择标记基因和目标基因序列特异性引物。
3.构建敲除基因载体：将设计好的敲除基因插入适当的载体中，如质粒或病毒载体。
2.2 敲除基因导入目标细胞或生物体1.选择合适的敲除基因导入方法：根据目标细胞或生物体的特性和要求，选择合适的基因导入方法，常见的方法包括细胞转染、病毒载体导入和转基因动物等。
2.导入敲除基因：将构建好的敲除基因载体导入目标细胞或生物体中，通过基因重组等技术使敲除基因与目标基因发生相应的重组事件。
3. 基因敲除方法的应用基因敲除方法被广泛应用于基因功能研究、药物研发、疾病模型构建等领域。
以下列举几个常见的应用案例：3.1 基因功能研究通过基因敲除方法，可以在细胞或生物体中敲除目标基因，观察其对生物体的影响，以揭示目标基因在生物体中的功能和调控机制。
例如，敲除特定的转录因子基因，可以研究其对基因表达和细胞分化的影响。
3.2 药物研发基因敲除方法可以用于筛选药物靶点和评估药物疗效。
通过敲除潜在的靶点基因，观察其对疾病模型动物的影响，以评价该靶点的重要性和药物的效果。
这对于药物研发和治疗策略的选择具有重要意义。
3.3 疾病模型构建利用基因敲除方法，可以构建基因敲除动物模型，模拟特定疾病的发生和发展过程。
通过敲除与疾病相关的基因，可以研究疾病的发病机制、病理过程和药物治疗的有效性。
基因敲除2
PCR法
PCR方法可以用来筛选基因打靶操作中的阳性克隆。
选择性地扩增发生同源重组的 DNA片段。先在靶载体 中插入neor基因使其突变，然后合成两个引物，它们分别 位于外源靶载体和与靶载体相接处的内源非同源序列上。 将G-418 抗性细胞克隆分别进行PCR。发生同源重组时， 由于两个引物分别从相对的两个方向同时扩增，结果是 DNA片段的拷贝数以指数式增加，得到已知长度DNA双链 片段。与之相反，在随机整合中，由于只有一个引物且为 单方向，所以扩增的片段拷贝数呈线性比例，片段为单链， 长度不定。
正相选择法
在基因敲除载体的目的片段中插入启动子缺失的正向选 择基因neor ，目的基因片段也不包含该基因的启动序列，再 嵌合入打靶载体中与靶位点同源的序列内，将打靶载体转染 进靶细胞，可能出现下面几种情况： 打靶载体不整合入靶细胞基因组，将随传代而丢失； 随机整合，由于neor基因缺失了其自身的启动子和起始码，整 合位点周围亦无启动子，使neor基因的表达受阻； 虽是随机整合，但其整合位点侧翼序列在其它基因的启动子 能启动neor基因的表达； 外源打靶载体与靶位点发生了同源重组，则neor基因可借助靶 基因自然存在的其和起始密码的作用而呈现表达活性。 用G418筛选，则抗性细胞中将只包含③④，根据基因组DNA 酶切图谱的不一致，用Southern印迹杂交可检测出同源重组的 克隆。
筛选方法的特点
PNS及PCR法是对任何靶基因的定点敲除都适用的两 种重要的方法，但它们都有不足之处。 PCR法缺乏直接的选择标记，运用PCR 法进行筛选 时，必须对每个细胞克隆分别进行扩增，因此较为费时费 力，工作量非常大。 PNS法可能是目前应用最广泛的方法，但PNS法要经 过2种药物筛选，有可能对ES细胞产生潜在的影响。 正向选择法适合于敲除那些在细胞中良好表达的基因。
基因治疗中的基因敲除策略与技术
基因治疗中的基因敲除策略与技术【基因治疗中的基因敲除策略与技术】基因敲除是一种基因编辑技术，通过操纵DNA分子，使得特定基因的表达受到抑制或消除，从而对相关疾病产生治疗效果。
在基因治疗中，基因敲除策略和技术发挥着重要作用，为疾病的治疗提供了新的思路和方法。
基因敲除技术的发展源于对基因功能的研究。
人们发现，一些遗传疾病是由于单一基因突变引起的，通过敲除这个突变基因，可以达到治疗目的。
基因敲除的策略主要包括以下几种：首先，使用RNA干扰技术实现基因敲除。
RNA干扰是利用革兰氏阴性细菌发酵得到的双链RNA分子，通过与特定基因的mRNA序列互补配对，导致mRNA 降解或抑制翻译过程，从而抑制特定基因的表达。
这种技术可以在细胞内选择性地降低特定的mRNA水平，实现基因敲除效果。
其次，使用锌指核酸酶（ZFN）技术实现基因敲除。
锌指核酸酶是一种特异性的DNA结合蛋白，可以通过结合到DNA的特定序列上，导致DNA断裂和修复过程中的错误，从而实现特定基因的敲除效果。
这种技术通过将编码锌指核酸酶的基因导入到靶细胞中，可以精确地敲除目标基因。
另外，使用CRISPR/Cas9系统实现基因敲除也是当前较为常见的策略。
CRISPR/Cas9系统来源于细菌的一种天然免疫机制，发现它可以用于基因组编辑。
CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白和导向RNA组成，导向RNA与目标基因的序列互补配对，然后Cas9蛋白通过核酸酶活性切割DNA链，引起DNA修复错误，从而实现基因敲除。
以上所述的基因敲除策略和技术各有优劣。
RNA干扰技术具有操作简单、花费低廉的优点，但是其作用持续时间较短，需要定期给药才能维持基因敲除效果。
而ZFN技术的特异性较高，但是其制备过程较为复杂，成本较高。
相比之下，CRISPR/Cas9技术操作简单、费用较低，而且可以同时敲除多个基因，因此被广泛应用于基因敲除研究和治疗。
基因敲除策略和技术在基因治疗中发挥着重要的作用。
敲低细胞株构建的方法
敲低细胞株构建的方法1.引言1.1 概述细胞株构建是一种重要的实验手段，可以用于研究基因功能、信号通路以及疾病发生机制等方面。
通过敲低目标基因表达，可以实现基因功能研究的定向操作，从而揭示该基因在细胞活动过程中的作用。
敲低细胞株构建的方法主要包括利用RNA干扰技术或基因编辑技术进行基因表达的抑制。
RNA干扰技术通过合成小干扰RNA(siRNA)或制作shRNA表达载体，干扰靶基因的mRNA的转录和翻译过程，从而抑制其蛋白表达水平。
基因编辑技术则是利用CRISPR/Cas9系统，通过设计特异性的引导RNA来指导Cas9蛋白对目标基因进行切割和编辑。
这样可以实现对目标基因的敲低或突变，从而探究其功能。
构建敲低细胞株需要选择合适的敲低方法，并进行合理的实验设计和优化。
通过敲低细胞株构建的研究，可以为我们进一步了解基因的功能和相应的生物学过程提供重要的依据。
此外，敲低细胞株也可以应用于现代医学研究中，例如寻找治疗癌症、遗传性疾病等方面的新靶点，为疾病的诊断和治疗提供新思路。
随着基因组学和生物技术的不断发展，敲低细胞株构建的技术也在不断创新和完善。
在未来的研究中，我们可以期待更高效、更精准的敲低细胞株构建方法的出现，并且将其应用于更广泛的领域，为科学研究和临床应用带来更多的突破。
1.2 文章结构文章结构部分的内容:在本文中，我们将首先在引言部分提供这篇长文的概述，并介绍文章的结构。
接下来，我们将在正文部分探讨细胞株构建的意义以及敲低细胞株构建的方法。
最后，在结论部分，我们将对整篇文章进行总结，并展望未来与细胞株构建相关的研究方向。
通过这样的结构安排，读者将能够全面理解细胞株构建的重要性以及其相关的方法，同时也能够对未来的研究方向产生兴趣。
文章1.3 目的部分的内容:在本文中，我们的主要目的是介绍敲低细胞株构建的方法。
敲低细胞株构建是一种重要的实验手段，它可以通过降低或抑制目标基因的表达水平来研究该基因在生物体中的功能和作用。
基因敲除技术在微生物中的应用
基因敲除技术在微生物中的应用王雪; 黄建忠; 李力【期刊名称】《《微生物学杂志》》【年(卷),期】2019(039)004【总页数】7页(P100-106)【关键词】基因敲除技术; 微生物; 研究进展; 成功案例【作者】王雪; 黄建忠; 李力【作者单位】福建师范大学生命科学学院福建福州 350108【正文语种】中文【中图分类】Q939.9基因敲除技术，又名基因打靶，自20世纪80年代发展起来，主要建立在同源重组的基础上，属于一种新型分子生物学技术。
经典的基因敲除技术是指通过同源重组原理将标记基因定点地整合入目标细胞基因组上某一特定的位点，以达到细胞内某一目的基因敲除的一种技术。
基因敲除技术已经广泛应用于动植物、微生物，应用形式多种多样，主要有同源重组法、随机插入突变法、RNA干扰法、ZFNs法、TALEs法，此外，还有目前热点研究的CRISPR/Cas9系统介导的基因敲除技术。
基于同源重组的基因敲除技术主要有RecA系统同源重组法、Red系统同源重组法、基于自杀载体的同源重组法、基于温敏型质粒的同源重组法。
这四种方法各有优缺点，要根据不同的微生物不同的条件选择不同的方法，其基本原理如图1。
基因敲除技术的热门也使得一大批发明专利涌现。
本文对几种广泛应用于微生物的基因敲除方法进行介绍，并提供一些成功案例及发明专利，各种方法的比较见表1。
图1 同源重组法进行基因敲除的一般原理Fig.1 Ceneral principles of gene knockout by homologous recombination表1 基因敲除方法的比较Table 1 Comparison of gene knockout methods方法来源动力常见质粒特点RecA系统大肠埃希菌功能蛋白-同源臂长,反应条件苛刻,操作复杂Red系统λ噬菌体功能蛋白pKD46同源序列短,相对简单自杀型载体其他生存压力pK18mob、pSVP202同源序列较短,重组效率高,简单温敏型质粒其他生存压力pKC1139、pBV220操作简单,应用范围广CRISPR/Cas系统细菌、古细菌Cas蛋白-编辑效率高,靶向性强,操作简单,脱靶效应注：“-”表示无特定质粒1 基因敲除技术原理1.1 RecA系统同源重组法RecA同源重组系统是大肠埃希菌中的内源性同源重组机制，组成它的蛋白质包括RecA蛋白和RecBCD等[1] 。
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细胞基因敲除策略
细胞基因敲除是一种常用的遗传学实验技术，可以通过改变细胞基因组的DNA序列，进而研究基因的功能和调控机制。
下面将介绍几种常见的细胞基因敲除策略。
1. CRISPR/Cas9系统
CRISPR/Cas9系统是近年来最受关注的基因编辑技术之一。
它利用一种来自细菌的CRISPR RNA (crRNA)和转录后修饰RNA (tracrRNA)以及Cas9蛋白组成的复合物，通过靶向特定DNA序列并引导Cas9蛋白进行双链切割，实现基因敲除。
这种技术具有高效、简便、经济的特点，被广泛应用于细胞和动物模型中。
2. RNA干扰技术
RNA干扰技术是通过使用小干扰RNA (siRNA) 或特殊的小分子RNA (shRNA) 来沉默目标基因的表达。
siRNA或shRNA与目标mRNA序列互补结合，形成RNA诱导沉默复合物(RISC)，导致mRNA降解或翻译受阻，从而实现基因敲除。
这种技术适用于大多数细胞类型，可以有效地抑制基因的表达。
3. 基因敲除质粒转染
基因敲除质粒转染是一种常见的基因敲除策略。
通过构建含有目标基因编码序列的质粒，并将其转染到细胞中，使细胞内产生反义RNA或RNA干扰，从而抑制目标基因的表达。
这种方法简单易行，
适用于多种细胞类型，但效率相对较低。
4. 靶向核酸酶介导的基因敲除
除了CRISPR/Cas9系统外，还有一些其他的核酸酶可以介导基因敲除。
例如，ZFN (锌指核酸酶) 和TALEN (转录激活样效应核酸酶) 等。
这些核酸酶通过特异性结合到目标DNA序列上，诱导DNA双链切割，并引发细胞内的DNA修复机制。
这种方法可以实现基因敲除，但需要设计和合成特异性的核酸酶，相对来说比较繁琐。
除了上述介绍的几种常见的细胞基因敲除策略外，还有许多其他的方法，如病毒介导的基因敲除、基因敲除动物模型等。
这些方法在研究基因功能和调控机制、治疗遗传疾病等方面发挥了重要的作用。
在进行细胞基因敲除实验时，需要注意以下几点。
首先，选择合适的敲除策略，根据研究目的和实验条件进行选择。
其次，设计合适的实验方案，包括合成和构建敲除载体、优化转染条件等。
此外，要进行严密的实验对照组设计，以验证敲除效果的可靠性。
最后，在实验结果的分析和解释中，要避免歧义和错误信息的产生，确保研究的准确性和可靠性。
细胞基因敲除是一种重要的遗传学实验技术，可以帮助研究人员深入了解基因的功能和调控机制。
不同的基因敲除策略各有特点，研究者可以根据自己的需要选择合适的方法。
通过不断的努力和创新，相信细胞基因敲除技术在科学研究和医学领域的应用会越来越广泛。