{5S6S现场管理}实验一16SrRNA基因的PCR扩增电泳及系统发育分析
16s rrna报告解读
16s rrna报告解读摘要：1.16s rRNA简介2.16s rRNA报告解读方法3.报告结果分析与应用4.报告的局限性与未来发展方向正文：随着分子生物学技术的发展，16s rRNA报告已成为微生物学、生态学等领域的重要研究手段。
16s rRNA是细菌核糖体的一部分，具有种属特异性，可通过高通量测序技术对微生物群落进行定性和定量分析。
本文将介绍16s rRNA报告的解读方法、结果分析与应用，以及报告的局限性与未来发展方向。
一、16s rRNA简介16s rRNA存在于细菌细胞中，负责蛋白质生物合成。
由于不同细菌物种的16s rRNA序列存在差异，可通过测定该序列对微生物进行分类和鉴定。
目前，16s rRNA测序已成为微生物多样性研究的主要手段。
二、16s rRNA报告解读方法1.序列分析：将测序得到的原始数据进行质控、比对、组装等处理，得到序列。
然后，通过序列之间的相似性分析，对微生物物种进行分类和鉴定。
2.生物信息学分析：基于序列数据，进行物种多样性、群落结构、代谢途径等分析。
常用的生物信息学工具包括MetaPhlAn、Kraken等。
3.统计分析：对生物信息学结果进行统计，评估样本间的差异性和相似性，为实验结果提供依据。
三、报告结果分析与应用1.物种多样性分析：通过统计不同物种的序列数量，评估样本中的微生物多样性。
2.群落结构分析：分析不同物种在样本中的相对丰度，揭示微生物群落的组成和变化。
3.功能基因分析：基于代谢途径和基因功能，分析微生物群落的代谢活性。
4.应用：16s rRNA报告可用于医学、环境、农业等领域的微生物学研究，为疾病诊断、环境保护、农业生产等提供科学依据。
四、报告的局限性与未来发展方向1.局限性：16s rRNA报告无法区分共生和病原微生物，且受样本制备和测序深度等因素影响。
2.未来发展方向：发展更高效的测序技术、生物信息学方法，以及整合多组学数据进行综合分析，提高报告的准确性和应用价值。
16sRNAPCR扩增及凝胶电泳分析实验报告
16sRNAPCR扩增及凝胶电泳分析实验报告16sRNA PCR 扩增及凝胶电泳分析微生物学 20092474 王紫枫一、实验目的1．熟悉细菌活化及培养过程2．掌握PCR扩增技术及方法3．掌握凝胶电泳分析技术二、实验原理rRNA进化缓慢，具有高度保守性。
不同微生物的rRNA的基因序列在某些位点以不同的几率发生突变。
同时，小核糖体亚基16sRNA 分子量大，携带信息量大，可作为属种鉴定的基础。
通过筛选的细菌，做活化培养后，细菌在缓冲液酶解，通过细胞破壁、裂解、离心得到RNA相关序列，在经过设定PCR相关条件。
温度、循环次数，将裂解液加入到体系中进行扩增。
在完成循环后进行凝胶电泳、拍照、序列分析。
三、实验用品供试菌种53种、编号试管每株两个LB固体和液体培养基、Mg2+、无菌水、EB Buffer、TE离心管、移液枪四、实验步骤1．将供试菌株编号，没人分得3个菌株。
2．将菌株接入固体培养基进行活化，培养24小时。
3．将活化后的菌株挑一环，接入5ml液体培养基内振荡培养16小时得到菌悬液。
4．取1.5ml菌悬液于离心管，10000转5分钟弃上清。
5．用无菌水洗涤一次，沉淀悬浮于150ul TE Bufler。
6．将上述悬液在沸水上煮10分钟，水浴10分钟，10000转5分钟离心后，上清液于-20℃保存。
7．取上述上清液1ul于PCR中。
8．3小时PCR扩增。
9．将扩增后的序列取1ul于EB，并注入电泳槽中。
10．经过电泳后的凝胶，取出于紫外荧光灯中显色，拍照并分析。
五、实验结果经过拍照，仅有2、3、6、9、22、38、39、40号扩增出了新的序列显色明显。
其他没有扩增出来的原因可能是提取过程中丢失。
另外第三块胶板没有明显变化的主要原因可能是电泳时入缓冲液使用了旧的缓冲液，并未出现预期的结果。
六、注意事项1．预制固体培养基琼脂要加够量，否则很难凝固。
2．在转接时，挑取的一环尽量多一些，肉眼可看见的状态为宜，生长期长一些。
16SrDNA+直接测序+鉴定实验过程
一、基因组提取及电泳检测1．基因组提取过程：按照生工SK1201-UNIQ-10 柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取。
说明书附见SK1201.PDF文档。
2．基因组电泳分析图谱：二、PCR反应1．PCR体系建立（50ul）：Template （基因组）10pmolPrimer up (10uM) 1ulPrimer down (10 uM) 1uldNTP mix (10Mm each) 1ul10*Taq reaction Buffer 5ulTaq (5u/ul) 0.25 ul加水至50ul2.PCR 程序设定预变性98℃ 5mim ;循环 95℃ 35S , 55℃ 35S , 72℃ 1min 30s , 35个循环，延伸 8min3．PCR产物电泳图谱4．引物序列：27f 5’AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG 3 ‘ 20bp1492r 5’ GGTTACCTTGTTACGACTT 3’ 19bp三、DNA琼脂糖切胶纯化由PCR产物电泳结果切割所需DNA目的条带，纯化方式见附见说明书SK1131胶回收PDF文档.四、DNA 测序（见测序图谱）五、主要实验仪器PCR反应扩增仪（加拿大BBI公司）；3730测序列分析仪( 美国ABI 公司)SW-CJ-1D洁净工作台（江苏苏洁净化设备厂）；DK-8D型电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）；DYY-8型稳压稳流电泳仪（上海琪特分析仪器有限公司）；YXJ-2离心机（湘仪离心机仪器有限公司）H6-1微型电泳槽（上海精益有机玻璃制品仪器厂）；凝胶成像系统（Gene Genius公司），U-3010紫外-可见分光光度计(Hitachi公司)；移液器（范围100-1000μl，20-200μl，0.5-10μl）（加拿大BBI公司）；。
基因组提取16SRNAPCR及连接转化资料
一、实验材料菌种：某浸矿混合菌。
设备：eppendorf管、移液枪、台式高速离心机、电泳仪、水浴锅、PCR仪、无菌操作台、牙签、枪头、酒精灯。
试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒、LB液体培养基、LB固体平板培养基、TE 缓冲液（pH 8.0）、切胶回收试剂盒、Taq DNA polymerase，10 mM dNTPmix，引物，双蒸水，琼脂糖、溴乙锭EB、电泳缓冲液（50×TAE电泳缓冲液：取Tris 24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/L EDTA（pH8.0）20ml，加蒸馏水至100ml）、pGM-T 克隆试剂盒、Hind III、石蜡。
二、实验步骤1 细菌基因组DNA提取1.1 样品收集菌种培养至OD600为1-1.5，此时1 mL 菌液中约含1.0×109细胞，用灭过菌的1.5mL离心管去菌液1 ml，室温10,000 rpm离心1 min，收集菌体。
1.2 基因组DNA的提取（使用前先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积参照瓶上的使用说明。
）1.向菌体沉淀中加入200 μl 缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮；2.向管中加入20 μl 蛋白酶K溶液，混匀；3.加入220 μl 缓冲液GB，振荡15秒，70℃放置10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；若溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯；4.加入无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；6.向吸附柱CB3中加入500 μl 缓冲液GD，12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3 放入收集管中；7.向吸附柱CB3中加入700 μl 漂洗液PW，12,000 rpm 离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中；8.向吸附柱CB3中加入500 μl 漂洗液PW，12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；9.将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；10.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μl 洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000 rpm 离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
乳酸杆菌及嗜热链球菌的种水平鉴定_16SrRNA基因PCR扩增及序列分析
近年来，食品新资 源 的 开 发 利 用 导 致 了 新 的 益 生 菌 菌 种 不断涌现，其安全性 问 题 也 日 益 受 到 重 视。 由 于 益 生 菌 对 人 体的作用具有株的特 异 性，即 同 种 不 同 株 的 益 生 菌 其 作 用 是 不同的，即使是传统认 为 安 全 的 益 生 菌 菌 种 也 不 能 保 证 种 内 所有菌株均安全，一些投产时认为安全的优良菌种，其遗传 特 性在长期的保存过程中也会发生变化甚至遗传标记的丧失， 由此导致其固有良好性能的丢失。鉴于目前食品生产中使用 益生菌种类的多样性，来源的多渠道，可用于生产食品类别 和 形式的广泛性，食用人群的敏感性等，使益生菌的安全状况 越
DONG Yinping，CUI Shenghui，LI Fengqin，YU Hongxia
Institute for Nutrition and Food Safety，China CDC，Beijing 100021，China
Abstract：Objective To develop a PCR method for identifying the 16S rRNA of Lactobacillus and Streptococcus thermophilus at the species level. Methods Optimizing the method for DNA extraction and the conditions for PCR amplification. Joining the PCR amplification products from 16S rRNA to plasmid puc18-T and detecting the sequence. Results All 50 isolates recovered from yoghourt products were characterized by 16S rRNA sequence analysis and 7 groups were identified as L. bulgaricus （ 24 strains） ，S. thermophilus （ 12 strains） ，L. acidophilus （7 strains） ，L. casei （ 3 strains ） ，L. delbrueckii （ 2 strains ） ，L. fermentum （ 1 strain ） and S. lutetiensis （ 1 strain） . Conclusion 16S rRNA PCR method developed in this research is a sensitive and reliable method for the identification of both Lactobacillus and Streptococcus thermophilus.
16SrDNA 实验原理
一、实验原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分子量太大，分析较困难。
而16S rRNA相对分子量在2kb左右，较为适合PCR 扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16S rDNA鉴定细菌，其技术路线如下：PCR实验原理即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
二、主要器具及试剂PCR、电泳系统、DNA提取体系、Taq Polymerase、DNA Marker，溶菌酶、dNTP和E.coli JM109感受态细胞、pMD18-T Vector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE（pH 8.0）三、操作方法1. 细菌基因组总DNA的提取接种纯化的菌株于LB液体培养基中，180 r/min，37 ℃培养过夜，按以下的方法提取细菌基因组总DNA。
16srrna鉴定菌株的标准操作规程
16srrna鉴定菌株的标准操作规程1. 准备工作：清洗实验室器具、准备培养基和试剂、保持操作环境的无菌状态。
2. 提取细菌样品：从菌落、液体培养基或环境样品中选择一个菌落较纯净的菌株。
使用无菌操作工具，在无菌条件下，用菌液或菌落均匀涂抹于无菌平板上。
3. 培养菌株：将无菌平板培养基转移到适合该菌株生长的培养条件下。
通常情况下，大多数菌株可以在37℃下培养24小时后获得足够的菌量。
4. 提取菌株的16S rRNA基因：使用合适的菌株提取方法提取菌株的总DNA，并使用PCR方法扩增16S rRNA基因。
PCR 反应条件可根据实验室的标准方法或相关文献进行设置。
5. 准备电泳样品：将扩增的16S rRNA基因产物与DNA分子量标记物一同混合，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和检测。
6. 电泳分析：将准备好的电泳样品注入琼脂糖凝胶孔中，进行电泳分析。
根据相对位置和迁移速度，确定16S rRNA基因的大小。
7. 分离目标DNA带：使用无菌操作工具，在琼脂糖凝胶上切割目标DNA带。
8. 提取目标DNA带：使用合适的目标DNA提取方法，从琼脂糖凝胶上提取目标DNA带。
9. DNA序列测定：将提取的目标DNA带进行测序，可以委托测序机构进行测序，也可以使用实验室的测序设备进行测序。
10. 序列分析：使用生物信息学工具对测序结果进行分析，包括序列比对、物种鉴定和进化分析等。
11. 物种鉴定结果的确认：将测序结果与数据库中的已知序列进行比对，确定菌株的物种鉴定结果。
12. 数据和结果的解释：根据测序结果和数据库比对结果进行数据分析和结果解释。
上述是针对16S rRNA基因进行鉴定的一般操作流程，具体操作规程可能因实验室的要求和设备的不同而有所差异。
实施过程中应始终保持无菌操作，确保结果的准确性和可靠性。
PCR扩增16SrDNA实验原理、材料和操作步骤以及常见问题分析
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•浓度：应适当,过高导致非特异性增加,过低则扩
增产物太少
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三、反应体系对PCR扩增的影响
反应Buffer
Mg 2＋浓度
dNTP Mixture
•••••过过稳浓p易H高低定度值生非无剂适w,特扩盐物,当增w异增离强w性产子.剂e严物浓b重度
¾ 现象：空白对照出现目的扩增产物
1. 操作时应小心轻柔，防止将靶序列 吸入加样枪内或溅出离心管外；
对 策
2. 除酶及不能耐高温的物质外，所有 试剂或器材均应高压消毒。所用离 心管及加样枪头等均应一次性使用。
3. 各种试剂最好先进行分装，然后低 温贮存。
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问题二：非特异性扩增
1. 2. 3. 4. 5.
原
om 因
e.c 引物特异性差
物 bio 模板或引物浓度过高
生 w.e 酶量过多
对
易 w Mg2+浓度偏高
策
w 退火温度偏低
1. 重新设计引物或者使用巢 式PCR
2. 适当降低模板或引物浓度 3. 适当减少酶量 4. 降低镁离子浓度 5. 适当提高退火温度或使用
1. 纯化模板或者使用试剂盒提取 模板DNA或加大模板的用量
2. 更换Buffer或调整浓度 3. 重新设计引物（避免链间二聚
4. 反应条件：退火温度太高，延 策
体和链内二级结构）或者换一
伸时间太短
管新引物
4. 降低退火温度、延长延伸时间
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•避免反复冻融
ddH2O
pcr基因扩增实验报告
pcr基因扩增实验报告PCR基因扩增实验报告引言：PCR（聚合酶链反应）是一种体外DNA复制技术，通过特定引物和DNA聚合酶酶活，可以在短时间内扩增特定DNA片段。
PCR技术广泛应用于基因工程、疾病诊断和法医学等领域。
实验目的：1.掌握PCR技术的基本原理和操作方法；2.通过PCR扩增特定基因片段，验证扩增效果；3.了解PCR技术在基因工程中的应用。
材料与方法：1.实验材料：PCR试剂盒、DNA模板、引物、PCR仪、电泳仪等。
2.实验步骤：（1）提取DNA模板；（2）配置PCR反应体系；（3）设置PCR反应条件；（4）进行PCR扩增；（5）检测扩增产物；（6）进行电泳分析。
结果与讨论：1.提取DNA模板：从样本中提取DNA模板是PCR扩增的前提，本实验采用常规的酚/氯仿法提取DNA模板，提取后的DNA浓度为X ng/μl，纯度良好，满足PCR 扩增的要求。
2.配置PCR反应体系：根据PCR试剂盒的说明书，按照一定比例配置PCR反应体系，包括DNA模板、引物、dNTPs、聚合酶等。
反应体系中的每个组分都有其特定的浓度和作用，合理配置反应体系可以提高PCR扩增效果。
3.设置PCR反应条件：PCR反应需要设置一系列温度和时间参数，包括变性、退火和延伸等步骤。
本实验设置的PCR反应条件为：预变性95℃，30s；变性95℃，5s；退火60℃，30s；延伸72℃，30s，共循环30次。
4.进行PCR扩增：将PCR反应体系加入PCR管，放入PCR仪中进行扩增反应。
根据设定的PCR反应条件，PCR仪会自动控制温度和时间，反复循环进行扩增。
本实验扩增后的PCR产物为明亮的条带，表明PCR扩增成功。
5.检测扩增产物：为了验证PCR扩增的准确性，我们对扩增产物进行测序分析。
结果显示，扩增产物与目标基因序列完全匹配，证明PCR扩增的准确性和可靠性。
6.进行电泳分析：将PCR产物与DNA分子量标记物共同进行电泳分析，根据PCR产物的大小和标记物的位置，可以确定PCR产物的大小。
实验一、16SrRNA基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析
贮液浓度 ——
Mg2+ Plus 2.5mmol 10pmol/μl 10pmol/μl 100μg/ml
5U/μl
使用量(20μl体系) 14μl 2μl 0.5μl 1 μl 1μl 1μl 0.5μl
操作步骤
循环次数
1 30
1 1
反应条件
95℃（10min） 94℃；30s 58℃ ；1min
Ribosomal RNA Sequences 核糖体RNA序列与进化
小核糖体亚单位RNA（16S rRNA，18S rRNA）
（1）具有重要且恒定的生理功能； （2）普遍存在于原核生物和真核生物中，而且在系统发育上具有适当的
保守性； （3）分子量大小适中，在细胞中含量度变化的序列区域，适用于进化距离不同
72℃ ；1min30s 72℃ ；10min
72℃ (10min)
琼脂糖凝胶电泳：
(1) 称取琼脂糖，用适当的电泳缓冲液(常用1×TAE)配成所需 浓度的胶；10×TAE 缓冲液配制：0.4M Tris-乙酸；0.02M EDTA，pH8.0 (2) 置微波炉中加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解； (3) 按照每20ml胶加入1µl Goldview/20ml； (4) 凝胶溶液冷却至50℃左右，倒入电泳胶盘，避免出现气泡， 室温放置，至胶凝固； (5) 小心拔出梳子，将胶盘放到有1×TAE 缓冲液的水平电泳槽 中； (6) 样品中加入1/5 体积的6×loading buffer，混匀，用移液器小 心加到点样孔中，以稳定电压(4-5V/cm) 电泳；6×加样指示剂 配方:0.25% 溴酚蓝;40%(W/V) 蔗糖水溶液； (7) 取出凝胶，紫外灯下观察电泳结果，如有必要，拍照记录。
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72℃ (10min)
琼脂糖凝胶电泳：
(1) 称取琼脂糖，用适当的电泳缓冲液(常用1×TAE)配成所需 浓度的胶；10×TAE 缓冲液配制：0.4M Tris-乙酸；0.02M EDTA，pH8.0 (2) 置微波炉中加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解； (3) 按照每20ml胶加入1µl Goldview/20ml； (4) 凝胶溶液冷却至50℃左右，倒入电泳胶盘，避免出现气泡， 室温放置，至胶凝固； (5) 小心拔出梳子，将胶盘放到有1×TAE 缓冲液的水平电泳槽 中； (6) 样品中加入1/5 体积的6×loading buffer，混匀，用移液器小 心加到点样孔中，以稳定电压(4-5V/cm) 电泳；6×加样指示剂 配方:0.25% 溴酚蓝;40%(W/V) 蔗糖水溶液； (7) 取出凝胶，紫外灯下观察电泳结果，如有必要，拍照记录。
在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离 子化状态的——叫做多聚阴离子。方向：负→正
种类：
普通DNA RNA
水平
琼脂糖
垂直
聚丙烯酰胺
小分子量 核酸
二、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖：线性多糖聚合物、从红色海藻产物琼脂中提取而来。 加热→凝固：网孔状的电泳介质，密度由琼脂糖的浓度决定。
琼脂糖
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的能力
实验内容
♣16S rRNA基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析 ♣染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 ♣ 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导表达 ♣ 利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性 ♣ 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取
16S rRNA基因的PCR扩增、电泳 及系统发育分析 窦桂铭
实验目的
1. 掌握PCR的原理，增强对PCR重要性的认识； 2. 掌握电泳技术及系统发育分析的方法，为将来课题
Ribosomal RNA Sequences 核糖体RNA序列与进化
小核糖体亚单位RNA（16S rRNA，18S rRNA）
（1）具有重要且恒定的生理功能； （2）普遍存在于原核生物和真核生物中，而且在系统发育上具有适当
的保守性； （3）分子量大小适中，在细胞中含量大(约占细胞中RNA的90%) （4）高度保守、中度保守和高度变化的序列区域，适用于进化距离不
研究奠定基础。
PCR技术的反应原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链 反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序
设想—实现—改进与完善
94℃
55℃
72℃
PCR循环
PCR技术的反应原理
5´
DNA或RNA模板
DNA引物
5´
DNA聚合
5´
酶dNTPs
基因组DNA Taq酶
贮液浓度 ——
Mg2+ Plus 2.5mmol 10pmol/μl 10pmol/μl 100μg/ml
5U/μl
使用量(20μl体系) 14μl 2μl 0.5μl 1 μl 1μl 1μl 0.5μl
操作步骤
循环次数
1 30
1 1
反应条件
95℃（10min） 94℃；30s 58℃ ；1min
同的各类生物亲缘关系的研究。
16S rRNA的系统发育分析
1 AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG GACGAACGCT GGCGGCGTGC TTAACACATG CAAGTCGAGC 61 GGTAAGGCTC CTTCGGGAGT ACACGAGCGG CGAACGGGTG AGTAACACGT GAGTAATCTG 121 CCCTCCACTT TGGGATAAGC CTCGGAAACG AGGTCTAATA CCGAATACGA CCACTTCCTG 181 CATGGGATGG TGGTGGAAAG TTTTTTCGGT GGGGGATGTG CTCGCGGCCT ATCAGCTTGT 241 TGGTGGGGTA ATGGCCTACC AAGGCTTCGA CGGGTAGCCG GCCTGAGAGG GTGACCGGCC 301 ACACTGGGAC TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTGGGG AATATTGGAC 361 AATGGGCGGA AGCCTGATCC AGCAACGCCG CGTGAGGGAT GACGGCCTTC GGGTTGTAAA 421 CCTCTTTCAG CGGGGACGAA GCGCAAGTGA CGGTACCCGC AGAAGAAGCA CCGGCCAACT 481 ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGG TGCGAGCGTT GTCCGGAATT ATTGGGCGTA 541 AAGGGCTCGT AGGCGGTTTG TCGCGTCGGG AGTGAAAACA CCGGGCTTAA CTCGGTGCTT 601 GCTTTCGATA CGGGCAGACT AGAGGTATTC AGGGGAGAAC GGAATTCCTG GTGTAGCGGT 661 GAAATGCGCA GATATCAGGA GGAACACCGG TGGCGAAGGC GGTTCTCTGG GAATATCCTG 721 ACGCTGAGGA GCGAAAGTGT GGGGAGCGAA CAGGATTAGA TACCCTGGTA GTCCACACCG 781 TAAACGTTGG GCGCTAGGTG TGGGATCCAT TCCACGGGTT CCGTGCCGCA GCTAACGCAT 841 TAAGCGCCCC GCCTGGGGAG TACGGCCGCA AGGCTAAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGGC 901 CCGCACAAGC GGCGGAGCAT GCGGATTAAT TCGATGCAAC GCGAAGAACC TTACCTGGGT 961 TTGACATACA CCGGAAAGCT GCAGAGATGT AGCCCCTTTT AGTCGGTGTA CAGGTGGTGC 1021 ATGGCTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC 1081 TCGTCCTATG TTGCCAGCAA GCCTTCGGGT GTTGGGGACT CATAGGAGAC TGCCGGGGTC 1141 AACTCGGAGG AAGGTGGGGA TGACGTCAAG TCATCATGCC CCTTATGTCC AGGGCTTCAC 1201 GCATGCTACA ATGGCCGGTA CAAAGGGCTG CGATCCCGTG AGGGGGAGCG AATCCCAAAA 1261 AGCCGGTCTC AGTTCGGATT GGGGTCTGCA ACTCGACCCC ATGAAGTCGG AGTCGCTAGT 1321 AATCGCAGAT CAGCAACGCT GCGGTGAATA CGTTCCCGGG CCTTGTACAC ACCGCCCGTC 1381 ACGTCACGAA AGTCGGCAAC ACCCGAAGCC GGTGGCCTAA CCCTTGTGGA GGGAGCCGTC 1441 GAAGGTGGGG CTGGCGTTTG GGACGAAGTC GTAACAAGGT AGCCGTA
16S rRNA的系统发育分析
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核酸
分子量的大 小
分子状态
物理
电压 缓冲液 温度
电泳指示剂：溴芬兰，距边缘1cm左右停止电泳。 电泳染色剂：溴化乙锭(ethidium bromide,简称EtBr)， 扁平染料， 嵌到DNA或RNA分子的碱基之间，借助紫外灯观察。
DNA Marker
1.2kb 800bp
操作步骤
成分 水
10×GC Buffer dNTPs 16Sp1 16S p2
凝胶浓度
0.5% 0.7% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0%
线形DNA的最佳分辨范围（bp）
1,000～30,000 800～12,000 500～10,000 400～7,000 200～3,000 50～2,000
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围: 0.2-50kb
DNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素 的影响：
5´
退火 引
5´
5´
物5´
5´
5´
延伸
5´
5´
5´ 5´
5´ 5´
一个标准的PCR过程
核酸的时，它们就会以一定的速度移向适 当的电极。
这种电泳分子在电场作用下的迁移速度——电泳的迁移率。 迁移率的影响因素：电场长度、电泳分子的电荷数量、电泳分 子与支持介质的摩擦系数等。
Mg2+（缓冲液） 5´
待扩增DNA区域
5´
变性
94℃ 5 min
1
退火
3´
聚合
3´
5´
55℃
5´
70℃ 3´
3´
5´
循环25-30
次
①
2
目的基因
30个循环：230
5´
变性 加热
5´ 2
目标DNA片段达
5´
退火
5´
延伸
引物 底物
106-107
5´
2
5´
变性－退火－延伸
5´ 5´
变性 加热
5´ 4
5´