移植性肿瘤动物模型
肿瘤动物模型
1. 肿瘤发生情况参差不齐。
2. 难以短时间内获得大量肿瘤材料，耗时长，耗资大。
3. 发生肿瘤的动物肿瘤生长速度差异大，难以评价。
二、诱发性肿瘤动物模型
定义：使用致癌因素(Carcinogens)在实验条件下诱发动物发生肿瘤的动
物模型。
原理：利用外源性致癌因素引起细胞遗传特性异常而呈现出异常生长和
注：肿瘤模型形成时间较长，需30~40d甚至更长。
在异种移植瘤实验中，还有一种正位移植，即将人癌组织或细胞按其在人 体内的原发部位，接种于相应的器官，有别于通常的皮下接种（异位接种）
免疫功能抑制的大鼠作为移植宿主
实验动物：体重120~160g的Wistar大鼠
操作方法（例：人胃癌细胞株）：
1.大鼠分笼饲养，皮下注射具有免疫抑制作用的阿糖胞苷200mg/kg体重，2d后用 10Gy(1000rad)60Co全身照射，照射后的大鼠饲养于洁净环境中，每日紫外线灯照 射1h，自由摄食饮水，饮水中加土霉素1mg/ml 2.将人胃癌细胞株调至1×106个/ml细胞悬液，台酚蓝拒染法检测癌细胞存活率后， 每只鼠皮下注射0.5ml(含5×105个细胞）细胞悬液 3.接种后每日观察肿瘤生长情况，肿瘤生成后取瘤组织进行组织病理学检查
2.腹水瘤
肿瘤细胞的冻存与复苏
对肿瘤细胞或瘤株进行冷冻保存可以使其得以长期使用，防 止退化或变异，保存不同代细胞的特征。一般在液氮中保存 1~2年，细胞存活率可达80%~90%。 1.冻存方法：取对数生长期增殖旺盛的细胞，胰蛋白酶消化、离心、洗涤，
用含7份培养液、2份小牛血清、1份DMSO配成（1~5）*106个/ml的细胞悬液，转 入细胞冻存管。将冻存管于4℃放置30min,-20℃放置4h，-70℃过夜，然后放入液 氮中。
肿瘤动物模型介绍
肿瘤动物模型介绍
细胞株移植瘤模型（cell derived xenograft, CDX)，即将体外传代培养的肿瘤细胞接种至免疫缺陷小鼠，过去常用的免疫缺陷鼠是裸鼠。
一般在小鼠皮下、静脉或原位注入肿瘤细胞，观察肿瘤的形成、发展及抗肿瘤药物的效果。
CDX肿瘤模型包括：乳腺癌、胶质瘤、骨肉瘤、胰腺癌。
服务内容：各类细胞系肿瘤模型，包括皮下模型和原位模型的建立。
动物的选择：可以选择4-6周龄Nude裸鼠或其他免疫缺陷小鼠。
也提供有自主产权的NSFG小鼠，NOD-SCID，IL2rg基因敲除的小鼠，是目前免疫缺陷程度最高，最适合肿瘤移植的工具小鼠。
接种部位与接种细胞量：接种部位常为皮下，静脉或原位；细胞量一般是5*106个/100ul-200ul，但是不同的细胞系的接种量略有差别。
成瘤时间：皮下接种的细胞一般会在1-2周成瘤，一般不会超过1个月；尾静脉和腹腔接种的细胞一般也是1周左右，会密切观察动物的体重与状态。
人源肿瘤组织来源移植瘤模型（patient derived xenograft，
PDX）,将肿瘤组织以小组织块的形式移植至缺陷程度较高的免疫缺陷小鼠体内，能够保持了肿瘤的异质性、其生物学特性保持的更加完整、与临床相似度更高，是现阶段最优秀的肿瘤动物模型。
PDX肿瘤模型包括：乳腺癌、骨肉瘤、白血病模型。
上图为PDX白血病模型。
肿瘤动物模型构建方法及来源分类
肿瘤动物模型构建方法及来源分类
顾名思义，肿瘤动物模型构建这种模型的建立是将肿瘤细胞或肿瘤组织直接种植在小鼠的皮下。
种植的点也有讲究，一般选择血运淋巴回流丰富的腹股沟和腋窝。
可根据实验设计选择移植点，统一移植点的位置，除了遵守实验统一的条件外，待肿瘤成熟后收集肿瘤时留下照片证据也显得美观。
根据肿瘤动物模型构建方法或者来源分为三大类
1、自发性肿瘤动物模型
优点：发病机制及机理较接近人。
缺点：数量及种类非常有限，无法满足实验的需要。
2、诱发性肿瘤动物模型
优点：发病机制及机理也较接近人。
缺点：诱发剂对人体都有很大的毒性，对实验人员存在较大的风险；实验周期非常长，且诱发成功的时间不一致，无法在同一条件下大批量实验。
3、移植性肿瘤动物模型
优点：可以在同一条件下大批量移植，实验周期较短，对动物的治病机制亦与人类相似，已成为目前应用为广泛的造模方法。
实验中肿瘤动物模型构建关键要细心，尤其是肿瘤细胞选择，肿瘤组织块处理上要仔细认真，这是影响模型成功建立的关键，还有移植手术时更要耐心细致，不要还没有建立就已经失败。
小鼠裸鼠肿瘤动物模型ppt课件
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小鼠肿瘤动物模型和抗肿瘤药物的研究方法
汇报日期
20171214JXD
Mouse model：Powerful research tool
TumorMetabolic diseaseDrug evaluation
四种肿瘤模型
人体肿瘤异种移植性肿瘤模型
移植性肿瘤动物模型
03
二、诱发性肿瘤动物模型
定义：使用致癌因素(Carcinogens)在实验条件下诱发动物发生肿瘤的动物模型。原理：利用外源性致癌因素引起细胞遗传特性异常而呈现出异常生长和高增殖活性，形成肿瘤。
诱发性肿瘤动物模型建立方法
原位诱发致癌物直接与动物靶组织或靶器官接触而诱发该组织或器官发生肿瘤。异位诱发将与致癌物接触后的动物组织或器官埋置于该动物或另一正常动物皮下而 产生的该组织或器官的肿瘤。致癌物致癌物
注射给药
皮内注射：将药液注入表皮与真皮之间。此法多用于免疫、接种、过敏试验等皮下注射：将药液注入真皮之下。
肌内注射：又称肌肉注射，当给动物注射不溶于水而混悬于油或其他溶剂中的药物时，常采用此种方法。
腹腔注射：腹膜面积大，药物进入腹腔后容易扩散和吸收。
静脉注射：不同动物类型应选择不同的静脉血管。
自发性肿瘤动物模型的缺点
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肿瘤发生情况参差不齐。
01
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难以短时间内获得大量肿瘤材料，耗时长，耗资大。
02
因此，自发性肿瘤很少在抗肿瘤药物的常规筛选中应用。
发生肿瘤的动物肿瘤生长速度差异大，难以评价。
裸小鼠作为移植宿主
细胞系移植性肿瘤小鼠模型（CDX）构建
细胞系移植性肿瘤小鼠模型（CDX）构建
细胞系移植性肿瘤模型是最为常见和使用最广泛的小鼠模型，原理是将肿瘤细胞系注射到小鼠皮下或任意想要研究的发病部位，肿瘤细胞将在注射处增殖生长。
常用的移植小鼠品系是裸鼠BALB/c-nu。
（1）皮下移植瘤推荐指数：★★★★优点：成本低、周期短、易操作、重复性好，可进行基因敲除/过表达后的成瘤研究。
缺点：皮下移植难以展现肿瘤原位和转移情况，缺乏肿瘤异质性。
适用研究：几乎适用于所有肿瘤的增殖、发生、耐药研究。
获取方法：选取合适的肿瘤细胞系或敲减/过表达细胞，皮下接种出生4-8周的裸鼠。
（2）原位移植瘤推荐指数：★★★优点：成本低、周期短、重复性好，可进行肿瘤原位和转移观察，可进行基因敲除/过表达后的成瘤研究。
缺点：具有一定操作难度，缺乏肿瘤异质性。
适用研究：肿瘤增殖、转移研究。
获取方法：与皮下移植瘤相似，不同的是在器官原位接种肿瘤细胞，而非皮下。
实验动物移植性肿瘤模型的选择
实验动物移植性肿瘤模型的选择目前肿瘤化疗所应用的大多数药物,都经动物移植性肿瘤试验而被发现,因此它是筛选抗肿瘤新药中最常用模型。
其优点是接种一定量瘤细胞或无细胞滤液(病毒性肿瘤)后,可以使一群动物带有同样的肿瘤,生长速率一致,个体差异较小,接种存活率近100%。
对宿主的影响也类似,易于客观判断疗效,且可以同种或同品系动物中连续移植,长期保留供试验之用,试验周期一般均较短,因此当前抗癌筛选中绝大多数用移植瘤试验,如各种实体型肿瘤,腹水瘤和白血病等均被广泛作用。
但是这类肿瘤生长速度快,增殖比率高,体积倍增时间短,这些都是与人体肿瘤的显著不同点,特别是与人的实体瘤差别更大。
许多国家筛抗癌药物中选用移植瘤株经常改变,主要原因可能也与此有关。
现在世界上有近500种的动物移植瘤,但常用于筛药的不到40种,多数为小鼠肿瘤,其次是大鼠和仓鼠移植瘤,包括小鼠L-1210淋巴白血病,艾氏腹水瘤,Frieha病毒白血病,肉瘤180, Lewis肺癌,腺癌755,白血病615Y, P1534淋巴白血病,P1798淋巴肉肉瘤,LPC-1浆细胞瘤,淋巴瘤8,Gardner淋巴肉瘤,B16或Cloadman黑色素瘤,Ridaway骨肉瘤,肉瘤37,P315白血病,Wagner癌肉瘤,Murhy-sturm淋巴瘤,Jensen肉瘤,Geurin氏癌,仓鼠十二指肠腺癌和人体瘤HSL第1代杂交鼠移植。
(摘自姜承和等.实验动物在肿瘤研究中的选择和应用.见汪谦主编.现代医学实验方法.第1版.北京:人民卫生出版社, 1997.1092-1095)可移植肿瘤模型可移植肿瘤模型应用日益广泛,并是目前研究最多的肿瘤模型。
容易人为操作,动物成瘤稳定,均一性好,发病率高,成瘤时间差异不大,容易施加干扰因素,该模型不能用于病因学、癌前病变和癌变的研究。
但对成瘤、治疗、浸润和转移等研究非常有用。
移植肿瘤可以是肿瘤组织块也可以是细胞株。
Leader和Padgett认为可移植肿瘤的基本条件是:(1)能准确重现所移植的肿瘤;(2)有足够的体积和荷瘤时间供研究者使用;(3)便于推广应用。
常见肿瘤动物模型一览
接种措施（无菌操作）
1.实体瘤
冻存旳瘤株
移入宿主体内
瘤源动物
7~10d
增殖
取得瘤块
制备瘤块
给动物接种
受体动物
实体瘤接种法：瘤块接种法、瘤细胞悬液接种法、培养细胞接种法、活细胞接 种措施等
瘤块接பைடு நூலகம்法
选用接种后7~10d生长状态良好旳瘤源动物，颈椎脱臼处死，消毒操 作部位皮肤。切开皮肤，剥离出接种用旳瘤块，剔除非肿瘤组织和坏死 组织，选用生长良好而无变性坏死、淡红色（黑色素瘤则呈黑色或黑紫 色）、鱼肉装旳瘤组织，在无菌平皿内剪成2mm3小块。平皿放置在冰块 上，平皿内放置少许灭菌旳PBS或其他营养液。
发癌率可达40％ ，DEN总量达1176mg，观 察时间为六个月时，发癌率可达94％ ，其中 支气管鳞状细胞癌占41％。
• ②乌拉坦注后3个月肺腺癌发生率为100％， 且多数为多发性，诱发肺肿瘤旳部位和组织分 型与人类肺肿瘤相近似。
• 2.食管癌（Carcinoma of esophagus)
• [简述]：亚硝胺在体内经过代谢，产生重碳烷， 使核酸或其他分子发生烷化而致癌．不对称亚 硝胺口服或胃肠外给药，均能诱发大鼠食管癌。
二、诱发性肿瘤动物模型
定义：使用致癌原因(Carcinogens)在试验条件下诱发动物发生肿瘤旳
动物模型。
原理：利用外源性致癌原因引起细胞遗传特征异常而呈现出异常生长和
高增殖活性，形成肿瘤。
诱发性肿瘤模型动物选择
用于诱发试验性肿瘤旳动物种类诸多，以啮齿动 物旳使用最多、应用最广，涉及多种大鼠、小鼠、 豚鼠等
瘤细胞悬液接种法
每次接种旳动物数量较多时可采用此法。详细措施是：无菌操作取 出瘤块，将数个瘤块混合后剪成小块，放入玻璃匀浆器中，加无菌生理 盐水向一种方向转动研磨后，经滤网过滤，加生理盐水稀释成1:3~1:4 （肿瘤g：生理盐水ml）旳瘤细胞悬液，用台盼兰染色法计数活细胞数， 用1ml注射器注射到接种部位，每个接种点接种0.2ml(一般含 1×106~1×107个细胞数）。一般接种到腋窝皮下，每只动物可选用多种 接种点。
小鼠结直肠癌生殖器官移植肿瘤动物模型的建立
小鼠结直肠癌生殖器官移植肿瘤动物模型的建立小鼠结直肠癌生殖器官移植肿瘤动物模型的建立【引言】结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，具有高死亡率和复发率。
传统的治疗方法如手术、放疗和化疗等对于晚期结直肠癌患者的生存率较低，因此，开发新的治疗策略和药物显得尤为重要。
近年来，基于动物模型的结直肠癌研究已成为突破性研究的重要手段之一。
本文将介绍一种基于小鼠的结直肠癌生殖器官移植肿瘤动物模型的建立方法。
【材料与方法】1. 实验动物：选用6-8周龄的雄性BALB/c小鼠。
2. 肿瘤组织获取：从结直肠癌患者中获取肿瘤组织，快速进行移植操作。
3. 移植操作：将小鼠分成实验组和对照组，实验组进行肿瘤组织移植操作，对照组注射生理盐水。
4. 术后护理：术后给予适量镇痛和抗生素，观察小鼠的生存率和体重变化。
5. 结直肠癌生殖器官移植肿瘤模型的评估：通过病理分析、免疫组化等方法评估移植肿瘤的生长情况和组织特征。
【结果】1. 移植肿瘤生长：经过一段时间的观察，实验组小鼠的肿瘤开始生长，并随时间逐渐增大；对照组小鼠无肿瘤生长情况。
2. 病理分析：对实验组小鼠的移植肿瘤进行病理学分析，发现肿瘤组织呈现典型的结直肠癌组织形态，并有细胞核的异型性。
3. 免疫组化：免疫组化结果显示实验组小鼠的移植肿瘤组织中存在癌胚抗原（CEA）、细胞角蛋白20（CK20）等结直肠癌特征性标志物的表达，验证了模型的可靠性。
【讨论】本研究建立的小鼠结直肠癌生殖器官移植肿瘤动物模型具有较高的可重复性和可操作性。
该模型可以模拟人体结直肠癌的生长和进展过程，为研究结直肠癌的发生机制、药物筛选以及新型治疗方法的探索提供了平台。
同时，该模型还可以应用于评价抗肿瘤药物的疗效和毒副作用，为药物研发和临床应用提供指导。
【结论】本研究成功建立了一种基于小鼠的结直肠癌生殖器官移植肿瘤动物模型。
该模型可为结直肠癌的研究提供新的实验手段，有望推动该领域的科学发展和临床转化。
未来，还应进一步完善该模型，提高其可靠性和应用范围，为结直肠癌的治疗开发更有效的治疗策略本研究成功建立了一种基于小鼠的结直肠癌生殖器官移植肿瘤动物模型。
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移植性肿瘤动物模型
目前临床所使用的抗肿瘤药物，大多数是通过动物移植性肿瘤实验法筛选而被发现的，移植性肿瘤动物模型是现代肿瘤研究中应用的最广最有价值的模型。
其优点包括：（1）可使一群动物被同时接种同样量的瘤细胞，生长速率比较一致，个体差异较小，接种成活率近100%；（2）对宿主的影响相类似，易于客观判断疗效；（3）可在同种或同品系动物中连续移植，长期保留供试验用；（4）试验周期一般较短，试验条件易于控制等。
但是这类肿瘤生长速度快、增殖比高、体积倍增时间短、肿瘤生命性质简单，与人类肿瘤具有明显不同；特别是与人类的致死性实体恶性肿瘤生命性质、与生长发生机制差异更大。
存在着能够为现代肿瘤基础生命科学研究模拟人类恶性肿瘤综合生命性质的局限性、片面性。
现在世界上保有近500种的动物移植瘤，但常用于筛药的不到40种，多数为小鼠肿瘤，其次是大鼠和仓鼠移植瘤，包括小鼠L1210淋巴白血病，艾氏腹水瘤，Friehd病毒白血病，肉瘤180，Lewis 肺癌，腺癌755，白血病615，白血病P388，Walker-256，吉田肉瘤，肉瘤45，Liol淋巴瘤，Dunning 白血病，白血病L5170Y，P1534淋巴白血病，P1798淋巴肉瘤，LPC-1浆细胞瘤，淋巴瘤8，Gardner淋巴肉瘤，B16或Cloadman黑色素瘤，Ridaway骨肉瘤，肉瘤37，P315白血病，Ｗagner癌肉瘤，Mur hy-sturm淋巴肉瘤，Jensen肉瘤，Geurin氏癌，仓鼠十二指肠腺癌和人体肉瘤HSL第1代杂交鼠移植。
它们对抗癌药作用的敏感性大致可分为敏感，中度敏感，低敏感和不敏感瘤株四类，同样敏感株对抗癌药的疗效水平也不相同。
（1）实验动物的选择：移植性肿瘤常用的动物为清洁级小鼠、大鼠和地鼠等，每批动物都应有一定的微生物及遗传背景，来源明确，根据瘤株的要求选用近交系、远交系或杂交第一代（F1）动物，一般雌雄皆可（乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌必须用雌性动物），但每批实验只用一个性别。
（2）实验一般要求：需在无菌环境下进行。
可在接种罩、层流工作台或无菌室内操作。
动物处死后，新洁尔灭或碘酊、酒精消毒，对每个实体瘤应分别用灭菌的外科器械切取；对腹水瘤应灭菌的空针筒抽吸。
瘤块污染常是接种失败的主要原因。
在高温季节，应注意瘤源的直接降温，可在盛有瘤源的器皿周围放置冰块。
（3）常用的皮下接种部位为右前肢腋下；肌肉接种常注射于大腿肌肉部；腹水型接种于腹腔内。
【肿瘤移植操作步骤】
1.肿瘤的移植
1）瘤悬液移植法：
（1）选择接种后肿瘤生长旺盛且无溃破而且动物健康状况较好的瘤源动物，颈椎脱臼处死，固定于蜡板上，用碘酊、酒精消毒操作部位皮肤（消毒面积要尽可能
大一些）。
切开皮肤，在无菌条件下取下瘤块。
（2）将瘤块去除坏死组织，称重，剪成小块，用玻璃匀浆器或机械匀浆器研磨均匀后放入无菌容器内，按照1：3 ~ 1：4的比例加入生理盐水，稀释成瘤细胞悬液，
使其细胞数为（1~2）*107个/ml。
（3）用碘酊、酒精消毒动物的接种部位，用空针筒抽吸0.2ml细胞悬液，注射于接种部位。
每次抽吸前应将细胞悬液混匀，整个操作应在30min内完成。
2）培养细胞的移植法：
（1）将单层培养的细胞消化脱壁后稀释为一定浓度的细胞悬液
（2）对细胞悬液进行活细胞计数，方法如下：用新配制的0.05％伊红或0.1％台盼蓝生理盐水溶液．将细胞悬液稀释、混匀后在血球计数盘上计数．染色者为死细
胞、不染色为活细胞。
按照计数结果将细胞悬液稀释至每毫升（1~2）*107个细
胞。
（3）用碘酊、酒精消毒动物的接种部位，用空针筒抽吸0.2ml细胞悬液，注射于接种部位。
每次抽吸前应将细胞悬液混匀，整个操作应在30min内完成。
【移植性肿瘤研究法举例】
1.腋皮下接种实体瘤模型：
【实验原理】以小鼠肉瘤S180为实验模型，接种于同种宿主的前肢腋皮下，给予一定剂量的有抗癌活性的药物，可以抑制肿瘤在体内的生长。
本方法也适用于LL、B16、Hep等实体型移植性肿瘤模型，常用于抗肿瘤生长药物的研究。
【操作步骤】取接种于小鼠约7~10天的S180肿瘤，无菌条件操作，剔除包膜和坏死部分，选取完好的瘤块，至于玻璃匀浆器或机械匀浆器内，加入适量的生理盐水，配制成瘤细胞悬液，细胞数为（1~2）*107/ml，接种于同种异体小鼠前肢腋皮下，雄性体重18~22g，雌性体重17~21g，每次实验均用同一性别，每只小鼠注射0.2ml，一般实验可用10只动物为一组。
实验第0天，接种动物。
第一天，将动物称体重及随机分组并开始给药，包括实验用药，阴性对照（相应溶剂）及阳性对照药，可用腹腔或灌胃给药，。
至第11~14天，动物
称体重，并剖取各组动物的肿瘤，称重，最后统计各组动物的抑瘤率。
2.Lewis肺癌自发肺转移模型
【实验原理】Lewis肺癌为一株恶性程度较高的自发性肺内未分化上皮样癌，受体鼠为C57BL/6。
移植瘤主要通过血行散播在肺部形成转移灶。
移植于皮下、肌肉或者足趾等特定部位，移植瘤增殖形成原位瘤，若给予一定剂量的有抗癌活性的药物，则可抑制肿瘤在体内的生长。
随后肿瘤细胞开始侵袭周围的正常组织和血管，继之癌细胞进入血液循环转运至靶器官，粘附于血管壁上并穿过血管，癌细胞增殖成集落，最后形成转移瘤。
上述过程基本类似于人类肿瘤从生长到转移瘤形成所经历的一系列步骤，故称之为癌的自发肺转移模型。
常规接种对药物的敏感性较低，但可向肺自发转移。
如采用其培养细胞或制成的单细胞悬液尾静脉注射接种，则属于人工肺转移，也可在肺部形成肿瘤集落，它可用于肿瘤转移机制的探讨和抗肿瘤生长和转移药物的筛选和研究。
【操作步骤】取皮下接种10~14d的肿瘤作为瘤源，制成（1~2）*107/ml单细胞悬液，进行常规腋皮下接种（2*106~4*106/0.2ml），接种于同种异体小鼠，体重18~24g，6~7周龄。
或者细胞数为2*106/ml，尾静脉接种，每支小鼠0.2ml，接种次日开始治疗。
腋皮下或肌肉接种的实验，其处理方法同S180。
第21~30天结束实验，称动物体重，并剖取动物的肿瘤，称重，统计各组动物的抑瘤率；观察肺转移瘤和小鼠的生命延长效应，数转移瘤集落数，称肺重，计算自发性转移肺集落的抑制率，还可计算肺平均重量。
肺转移率% = （1- 给药组平均肺集落数/对照组平均肺集落数）* 100%
【实验说明】
3.B16小鼠黑色素瘤人工肺转移模型
【实验原理】B16是C57BL/6小鼠耳根部皮肤上发现的自发性黑色素瘤，以后又在该瘤株中筛选出肺部高转移的集落株，小鼠静脉内移植后主要形成肺转移瘤，肺外转移极少。
该瘤细胞注入静脉内，在短时间内直接把大量瘤细胞输入血液循环，不经过癌转移的前几个过程，故称为“人工转移”模型，以区别于“自发性转移”模型。
该模型体现了肿瘤细胞进入血液循环后癌转移的几个步骤，对于研究肿瘤细胞在循环系统中的生成能力，瘤细胞附着、穿越靶器官血管的能力和探讨癌转移的器官特异性则有其独特的优势。
【操作步骤】取体外对数生长期的B16小鼠黑色素瘤细胞，经胰酶消化，以磷酸缓冲液配置成瘤细胞悬液，浓度为2.5*105/ml，，相应宿主尾静脉接种0.2ml/只。
随机分组进行实验，3周后以颈椎脱臼法处死小鼠，称小鼠体重，剖取肺，称肺重，用解剖显微镜计数各
肺叶的转移集落数，转移集落成黑色或灰黑色，相互间不融合。
【结果计算】计算给药组平均肺集落数与阴性对照组的平均肺集落数，计算肺转移抑制率。