菠萝蛋白酶
菠萝蛋白酶纯化方法总结
菠萝蛋白酶的提取方法：（1）沉淀法沉淀法是粗提酶蛋白的方法之一，主要用于前期酶的初步分离和浓缩，常用的方法有盐析法，有机溶剂沉淀法，聚乙二醇沉淀法，等电点沉淀法等。
用新型吸附洗涤沉淀法和单宁沉淀法也可以提取菠萝蛋白酶，操作简单，产率也较高，但酶的产量与单宁的用量密切相关，而且所含单宁有毒，导致这种方法逐渐被淘汰了。
以酒精为沉淀剂提取菠萝蛋白酶时，酒精的加入量会对菠萝蛋白酶产生较大的影响，酒精的浓度太低时，不能使菠萝蛋白酶沉淀下来，浓度太高容易使酶变性失活。
酒精的浓度为80%时，酶的收率最高。
从茶叶中提取的多酚类物质茶多酚也可用于菠萝蛋白酶的分离，用0.5%的茶多酚提取物对菠萝汁中菠萝蛋白酶进行沉淀最多可达78%，其最大沉淀率明显比单宁法高。
（2）离子交换色谱法离子交换色谱层析法是蛋白质研究领域内比较高效的纯化技术，目前国外用于分离菠萝蛋白酶常用的离子交换剂有Sephacryl S-200柱、Mono S阳离子交换剂、S-Sepharose、弱酸性阳离子交换树脂、CM-纤维素阳离子交换柱、Q阴离子交换柱。
国内常用的有羧甲基纤维素（CMC）、二乙胺乙基纤维素（DEAE），酶的纯化过程通常是将若干色谱纯化技术联合使用来实现的。
Ota最早用SephadexG-75结合CM-SephadexC-25柱层析分离得到5种茎酶的组分。
用DEAE-52离子交换柱层析结合Sephadex G-75分子筛柱层析色谱法纯化果酶，能获得比活力为12.5U/mg的单一电泳纯酶制剂。
（3）固定化金属离子亲和色谱法固定化金属离子亲和色谱法是以普通凝胶作为载体，连接上合适的螯合配体和足够暴露的金属离子，制成亲和吸附剂，进行分离纯化蛋白质的方法。
此法介于高特异性的生物亲和分离法和低特异性的离子交换色谱法之间，对组氨酸基团有特异性。
Huali Nie 等（2008）首次应用固定化金属亲和膜（IMAM）—肽-尼龙膜，这是一种将七肽共价固定到复合膜上作为配体的新型尼龙膜，用其从菠萝中分离和提纯菠萝蛋白酶，可使菠萝蛋白酶纯化15.4 倍，回收率达94.6%，而且不会造成任何变性。
菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶
三、菠萝酶和木瓜酶的市场现状
木瓜蛋白酶的生产和销售相对来说有较长的历史和较多 的经验，而菠萝蛋白酶的生产则起步较晚，两者都有很 大的发展空间。
国内酶应用水平低，销售的大部分是粗制酶，精制 酶大部分销往国外，国外市场潜力较大。
该类企业存在的问题 ➢ 规模较小，资金有限 ➢ 生产企业精品意识差，核心竞争力低 ➢ 国际市场劲敌多，如印度、泰国，其蛋白酶产量大
，品质好，品牌较响，市场份额大。
四、国内产业分布与发展情况
• 木瓜和菠萝在我国主要分布于广东、海南、广西、云南与 福建等热带省区，而木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶的厂家主要 集中在广东和广西。
• 但超滤法浓缩有机溶剂提取生产工艺和操作比上述两种方 法复杂
• 因此，建议：若超滤浓缩液不用有机溶剂提取工艺, 而采 用高岭土法或单宁法提取, 可大大节约其他辅助原料, 总生 产成本减少, 且产品酶活力提高, 酶活总回收率也有所提高 ; 对环境造成污染程度减小，经济效益明显比传统工艺好 。
菠萝蛋白酶的提取新工艺
广西 集中于南宁地区，生产经验较为丰富，销售渠道较为成熟 资源优势使其成为全国产量最大的地区，约占60%市场份额
广东
蛋白酶工厂起步较晚，发展却比较迅速，主要集中在徐闻和 广州。 徐闻菠萝产量大，但经济不发达，主要生产粗酶 广州酶工厂设立于郊区，交通便利，经济发达，销售渠道广
五、工厂发展方向
一、增加技术投资和设备投资，提高酶的纯化技术和固定 化、微胶囊化技术，以高质量的酶产品占领市场先机。
• [2]王平诸 孙君社 李魁. 菠萝蛋白酶三种生产工艺的比较 [J].河南化工， 2002(7)：1-3
菠萝蛋白酶市场分析报告
菠萝蛋白酶市场分析报告1.引言1.1 概述概述部分的内容应该包括对菠萝蛋白酶市场的简要介绍和概况。
菠萝蛋白酶是一种重要的蛋白水解酶，在食品、医药和美容等领域有着广泛的应用。
随着人们对健康和美容的关注度不断提升，菠萝蛋白酶市场需求逐渐增加。
在本报告中，我们将对菠萝蛋白酶市场进行深入分析，旨在为相关行业提供市场发展的参考依据和决策建议。
1.2 文章结构文章结构部分的内容:本报告分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分主要概述了菠萝蛋白酶市场分析报告的背景和意义，介绍了文章的结构和目的，并对报告进行了总结。
正文部分包括菠萝蛋白酶的定义与作用、市场现状分析以及市场发展趋势预测，旨在全面分析菠萝蛋白酶市场的现状和发展趋势。
结论部分总结了市场分析报告的主要内容，提出了对菠萝蛋白酶市场的建议，并展望了未来发展的趋势。
通过以上分析，读者能够全面了解菠萝蛋白酶市场的现状和发展趋势，并对未来的市场走向有所把握。
1.3 目的本报告旨在对菠萝蛋白酶市场进行全面的分析和研究，以了解其当前的市场现状和发展趋势。
通过对菠萝蛋白酶的定义、作用和市场现状的分析，可以为相关企业和投资者提供决策参考，同时也可以为行业内的研究人员和从业者提供行业发展的参考和借鉴，有助于推动菠萝蛋白酶市场的健康发展。
通过对市场发展趋势的预测，可以为相关企业制定战略规划提供有益的信息，同时也可以为市场参与者提供参考，以把握时机，促进市场的良性发展。
最终目的是为了推动菠萝蛋白酶市场的发展，促进相关产业的健康快速发展。
1.4 总结本文对菠萝蛋白酶市场进行了全面深入的分析与预测，通过对市场现状的分析，我们可以清晰地看到菠萝蛋白酶市场的发展趋势。
随着人们对健康和营养需求的增加，菠萝蛋白酶将有更广阔的市场前景。
同时，本文还针对市场现状提出了一些相关建议，希望能够为菠萝蛋白酶行业的发展提供一些参考。
展望未来，菠萝蛋白酶市场的发展将更加繁荣，为消费者提供更多更好的产品和服务。
菠萝蛋白酶提取
菠萝蛋白酶提取菠萝蛋白酶提取一．实验目的:1.了解菠萝蛋白酶的基本性质，设计提取方法并测性其蛋白总量及酶活性；2.计算从菠萝中提取菠萝蛋白酶时每步的回收率，判断提取方法的优劣。
二．实验原理：菠萝蛋白酶外观为白色至浅棕黄色无定形粉末；可溶于水，水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚；属糖蛋白。
主要作用原理是使多肽类水解为低分子量的肽类，尚有水解酰胺基键和酯类的作用。
其作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化,啤酒澄清,还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂,对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。
提取菠萝蛋白酶的传统工艺是高岭土吸附法和单宁沉淀法。
高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂,原材料消耗多,所需设备也多,酶活总回收率低,但产品质量较好,纯度较高,单宁沉淀法工艺和操作比高岭土法简单,原材料消耗少,所需设备少,但酶活回收率低。
有些研究用超滤法对传统工艺进行了改革,不仅使菠萝蛋白酶产品更纯,而且酶粉得率比传统工艺高,但超滤法生产工艺和和操作比上述两种方法复杂,工人素质要求高,且设备一次性投资大。
本实验采用新型吸附法提取菠萝蛋白酶,步骤简单,产率比传统方法有所提高,是一种有发展的方法。
在新型吸附沉淀法提取菠萝蛋白酶中,所使用的锌离子对酶有激活作用,乙二胺四乙酸是一种螯合物,可有效地螯合原料中某些重金属离子,以避免其与酶结合而使酶失去活性,抗坏血酸则具有还原性,分子上的活泼羟基氢可使酶活性中心保持还原状态,从而有效地保持酶活性,其中以EDTA 和L2半胱氨酸组合,效果最佳。
单宁用量多少会直接影响酶产量,一般范围0. 15 %～0. 25 %的浓度。
采用Folin-酚法测定蛋白酶含量，发生双缩脲反应的蛋白中酚基（酪氨酸），在碱性条件下将磷钼酸和磷钨酸还原成钼酸和钨酸，呈蓝色，在650nm和66onm处有最大吸收值。
Folin-酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。
菠萝蛋白酶
四、前景
菠萝蛋白酶的应用已有很长的历史，随着 提取纯化技术的进步，它将有更广泛的应用。 我国菠萝资源丰富，年产菠萝100万吨以上， 每年都有大量的菠萝皮、茎被浪费掉。同时， 我同对菠萝蛋白酶的需求量逐年增多，特别是 高活性的菠萝蛋白酶。因而，对菠萝蛋白酶分 离纯化技术进行深入研究，提取高质量的菠萝 蛋白酶具有重要的实用价值。
三、菠萝蛋白酶在食品加工中的 应用
肉类：菠萝蛋白酶将肉类蛋白质的大 分子蛋白质水解为易吸收的小分子氨 基酸和蛋白质，令肌肉肌丝和筋腰丝 断裂，使肉类变得嫩滑，使人体食用 后易于消化吸收,可广泛地应用于肉制 品的精加工。
酸豆乳:利用菠萝蛋白酶的蛋白水解活 性，将豆乳中的蛋白质部分水解成为 功能性多肽，再添加发酵剂制成酸豆 乳。顾仁勇等采用正交实验法，以蛋 白质水解度为评价指标，确定最佳酶 解条件为：菠萝汁用量15％；pH=7.0； 温度45℃；时间70min。
2.菠萝蛋白酶的理化性质
菠萝蛋白酶的分子量为30000～33000，酶液 的最大吸收波长为280nm，0.051%浓度的酶液 在280nm的光吸收值达0.984%。分子中有4个 N-乙酰化的氨基己糖，含糖 2.1%，分子中含 有285个氨基酸残基，含氮量为15.88%。 一般认为，菠萝蛋白酶无毒、无副作用，少 数人会对菠萝蛋白酶起过敏反应及轻微的肠胃 反应。
溶解：将粗酶放入溶解罐中，加入10倍水。用 NaOH溶液调pH值至7.0～7.5，搅拌使其溶解， 过滤除杂，收集滤液。 沉淀、干燥：在搅拌下用1:3的盐酸凋节上述 滤液的pH值至4.0，静置1小时使酶析出，用离 心机分离出沉淀物，冷冻真空干燥或减压干燥 即得菠萝蛋白酶精品。
2、单宁沉淀法
菠萝蛋白酶 -
孤岛颠人贵阳医学院gudaodianren@菠萝蛋白酶的研究应用孤岛颠人摘要：菠萝蛋白酶是一种纯天然植物蛋白酶，菠萝蛋白酶主要提取于菠萝中茎和果质中，采用超滤方法进行过滤浓缩，低温冷冻干燥而得的，应用于食品、医药、美容业、饲养等多个领域。
关键词：菠萝蛋白酶的提取，特性，应用前言：菠萝蛋白酶（Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素）是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。
首次成功分离出菠萝酶的历史纪录是委内瑞拉的化学家文森特‧马卡罗（Vicente Marcano）在1891年时从菠萝的果实中分离出该酶。
随后，人们对菠萝蛋白酶进行了一系列研究，发现这些蛋白酶不是单一的成分，而是由多种不同分子量和分子结构的酶系组。
粗菠萝蛋白酶是各种成分的混合物，除了蛋白水解酶系外，有的还含磷酸酯酶、过氧化物酶、纤维素酶、其它糖苷酶及非蛋白物质。
过去在临床上，大多数使用的是非单一成分的酶。
品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工，采用超滤方法进行过滤浓缩，低温冷冻干燥而得的，可广泛应用于食品、医药等行业中。
一、菠萝蛋白酶的种类及主要特性菠萝蛋白酶主要的两种蛋白酶为菠萝茎酶（存在于茎部）和菠萝果酶（存在于果质中）。
菠萝蛋白酶为白色至浅棕黄色无定形粉末。
溶于水，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。
分子量约33000，等电点为9.55。
菠萝蛋白酶为巯基蛋白酶，其活性中心为巯基（—SH）能进行蛋白水解等各种生化反应，热分解可排出刺激烟雾。
在一定温度、PH值及底物浓度下，菠萝蛋白酶能够水解蛋白质生成蛋白胨、多肽及氨基酸等物质，尚有水解酰胺基键和酯类的作用。
（一）温度对菠萝酶的影响菠萝蛋白酶有一个较高的最适反应温度，介于55～60℃，温度再升高，酶的热失活增强，反应速度下降(图1)（二） PH对菠萝蛋白酶的影响菠萝蛋白酶的最适pH在6．5～7．5，在7．1附近达到最大值。
菠萝中的菠萝蛋白酶
菠萝中的菠萝蛋白酶菠萝中的菠萝蛋白酶1、抑制血小板聚集；2、溶解纤维蛋白；3、消炎；4、抗肿瘤；5、调节细胞因子和免疫；6、对皮肤清创的特性；7、促进其它药物的吸收；8、溶解粘液；9、助消化；1、0促进伤口愈合；11、改善心血管循环系统。
菠萝蛋白酶口服易于吸收，有可靠的证据表明大剂量给药可以提高治疗效果。
虽然所有的相关机理还没有完全搞清楚，但菠萝蛋白酶已被证明是一种安全有效的药物。
在大鼠试验中，服用一定剂量的菠萝蛋白酶会降低血清纤维蛋白原水平，高浓度的菠萝蛋白酶维可明显延长凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血酶时间(APTT)。
一定剂量下的菠萝蛋白酶通过刺激ADP、肾上腺素、前列腺素前体，可加强抑制血小板聚集的作用。
在体内和体外，菠萝蛋白酶都是一种有效的纤维蛋白溶解剂在消炎试验中，菠萝蛋白酶和强的松有相似的消炎作用。
具有免疫刺激作用曾有专利认为菠萝蛋白酶的某一组分可用于治疗免疫系统受抑制的病症或作为疫苗佐剂。
菠萝蛋白酶具有免疫刺激作用，血液中丙种球蛋白缺乏症病人的吞噬细胞表现出对这种刺激特别敏感。
体内外的研究表明，通过对辅助细胞的刺激作用和对T细胞的直接抑制反应，菠萝蛋白酶可以增强和抑制T细胞的免疫反应。
抑制毒素分泌实验证明菠萝蛋白酶能降低毒素结合活性并能抑制热不稳定毒素、霍乱毒素及热稳定毒素的分泌效应。
用于烧伤脱痂菠萝蛋白酶能选择性地除去死皮，使新皮移植得以尽早进行。
动物实验证明，菠萝蛋白酶对邻近的正常皮肤无不良影响。
局部使用抗生素不影响菠萝蛋白酶的效果。
用其制备的菠萝蛋白酶脱痂制剂治疗深2度和3度烧伤，可在3-4小时完成脱痂。
全过程无需麻醉，脱痂十分彻底，对于功能部位的烧伤治疗具有更重要的意义。
消炎作用菠萝蛋白酶在各种组织中能有效地治疗炎症和水肿（包括血栓静脉炎、骨骼肌损伤、血肿、口腔炎、糖尿病人溃疡及运动损伤），能在体外激活鼠巨噬细胞和自然杀伤（NK）细胞。
因此，对于免疫缺失的个体，菠萝蛋白酶具有激活炎症反应的潜力。
菠萝蛋白酶的制备及活性测定
菠萝蛋白酶的制备及活性测定背景菠萝蛋白酶(Bromel ain)，别名菠萝酶，是存在于菠萝(AnanaCOmOSl2S)植株中的蛋白质水解酶，为浅黄色无定形粉末，微有异臭。
菠萝的果、茎、柄和叶片中都含有菠萝蛋白酶。
一般从菠萝果中提取的称为果菠萝蛋白酶，从菠萝皮、茎中提取的为茎菠萝蛋白酶。
八成熟的菠萝果汁含有约0．4％的菠萝蛋白酶，成熟的菠萝果汁含有O．3％左右的菠萝蛋白酶，茎汁含8．7％的菠萝蛋白酶(Murach i，et a1．，1964)。
1981年，Marcan o首先发现菠萝汁中含有蛋白水解酶，随后Will statt er，Bergma nn和Ma rtin相继指出，菠萝蛋白酶存在于果、皮和茎部中，存在于茎部的称为茎酶(Stembr omela in E．C．3．4．22．4)，存在于果汁中的酶称为果酶(Fruitbromel ainE．C．3．4．22．5)。
Murach i和Neu rath、E1．G harbaw i和Whi taker采取层析法分离提取了菠萝蛋白酶并研究了它的活性成分。
结构特性研究表明，果菠萝蛋白酶是酸性酶，等电点为pH4．6，茎菠，约为33，000，等电点为pH9．5，其活性中心的氨基酸顺序和催化机理与木瓜蛋白酶相似，并确定茎菠萝蛋白酶为糖蛋白。
Ota S et aL研究指出，茎菠萝酶分子量为36000，末端氨基酸残基是丙氨酸，果酶分子量为30000，末端氨基酸残基也为丙氨酸，碳水化合物分析与Mur aclli 的分析结果相似。
1988年，T．L．迈诺特等由十二烷基硫酸钠．聚丙烯胺凝胶电泳(SDS．PAGE)测定果菠萝蛋白酶分子量22200．25080，等电点3．8~4．8。
菠萝蛋白酶是各种酶的混合物，已知菠萝蛋白酶粗品中包含至少五种蛋白水解酶，也包含非蛋白水解酶，包括酸性磷酸酶和过氧化物酶，并含有淀粉酶和纤维素酶活性，还存在其他成分。
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果实菠萝蛋白酶 活力单位的规定
在35℃ pH7.2条件下，果实菠 萝蛋白酶水解酪蛋白所产生 的溶于三氯乙酸的小肽在 275nm的吸收为0.0145，定为 1个单位（unit U）。
CAU.ZHAOWULING
2
凝胶过滤的原理
葡聚糖凝胶是一些小珠，具有交联的网 状结构。 混合的蛋白质溶液通过这些小珠时，大 分子不能进入网格，直接从小珠的间隙 中流出。小分子可以进入网格，减慢了 流出的速度。 可以根据分子量把不同大小的蛋白质分 开。
果实菠萝蛋白酶 米氏常数的测定
CAU.ZHAOWULING
目的
学习凝胶过滤的方法 学习酶促动力学的测定
CAU.ZHAOWULING
1
测定果实菠萝蛋白酶 酶活力的原理
果实菠萝蛋白酶可以将蛋白质底物水解 成大小不同的片段。加入三氯乙酸后， 较大的片段形成不溶性沉淀，较小的片 段可以溶解在三氯乙酸中。 这些溶于三氯乙酸的小肽在275nm有吸 收，测定蛋白酶水解液在275nm的吸收就 可以计算出酶的活力。
3
分离纯化
称 取 果 实 菠 萝 蛋 白 酶 20g ， 用 0.002M pH6.0磷酸缓冲液100ml溶解，放置15分 钟后，离心。 离心：12 000rpm，20分， 4℃ 。 离心结束后，记录上清液的体积。 留一部分溶液作为样品1，-20℃保存备 用。样品1反映的是酶在溶解时的状态。
CAU.ZHAOWULING
斜率
0'
10'
20'
30'
40' 50' 60'
Time
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9
4
上样、收集
柱子平衡好之后，放出缓冲液， 使缓冲液接近柱床的平面。 取3ml样品，用滴管沿管壁轻轻 加入，待样品完全进入柱床后， 再加缓冲液。开始洗脱。 加样后立即开始收集。
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蛋白质含量的计算公式
蛋白质含量（mg/ml） = 1.45×A280-0.74 ×A260
酶活力的计算公式
CAU.ZHAOWULING
凝胶装柱
已经冲洗好的凝胶倒掉一些水， 用玻棒搅起，灌入层析柱中。后 面可以用滴管装柱。 装好的柱床应该均匀，不断裂， 没有气泡。
讲义中要求一次装好，并不是说要把所有的 凝胶一次倒入柱子中，而是说，在装柱的同 时，不要安排其他的工作，装好柱子以后， 再去做其他的工作。
CAU.ZHAOWULING
酶活力（U/ml）= A275/0.0145 ×稀释倍数 10分钟
CAU.ZHAOWULING
5
酶活力测定1
样品
2%酪蛋白 EDTA-Cys缓冲液 酶液 三氯乙酸 1.5ml 0.5ml 保温10分钟 0.1ml 反应10分钟 2.5ml
对照
1.5ml 0.5ml
2.5ml 酶液 0.1ml
静置30分钟后过滤
余下的样品分装在几个透析袋中， 在0.002M pH6.0的磷酸缓冲液中透 析5小时，透析温度为4℃。 将透析过的上清液转入离心管； 离心：12 000rpm，20分，4 ℃ 离心后测量上清液的体积。 这一步得到的样品为样品2，反映了 样品在透析这一步的状态。 将样品2分装，-20℃保存备用。
CAU.ZHAOWULING
CAU.ZHAOWULING
洗脱曲线
用所得到的数据作图，作出洗脱 曲线。
蛋白质的曲线和酶活力曲线要画 在一个图中。
横坐标是管号，纵坐标用双坐 标：一个纵坐标是蛋白质的含 量；一个纵坐标是酶的活力。
CAU.ZHAOWULING
6
合并洗脱液
根据洗脱曲线，合并具有酶活 力的洗脱液，这就是样品3。
样品3反映了酶纯化的情况。
测定样品3的体积、蛋白质浓 度、酶活力，计算比活力， －20℃保存备用。
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米氏常数的测定
配制不同浓度的底物； 测定不同底物浓度下的反应 速度； 计算KM和Vmax 。
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ห้องสมุดไป่ตู้
7
配制底物
用0.025 M pH7.2的磷酸缓冲液配 制8个不同浓度的底物。 配制时要计算好需要的底物和缓 冲液的量，分别加入，混匀。
不要用系列稀释的方法，系列稀释的 方法可能会使误差放大。
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简化的方法测定速度
只用不同底物浓度下反应的初速 度作为反应的速度，测定反应的 初速度只需要反应进行10分钟就 可以了。 所用的方法就是我们测定酶活力 的方法。
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8
测定Vmax和KM
以A275对时间做 图，用所得的斜 率计算反应速 度。 所得的速度是在 这个底物浓度下 的反应速度。 用相同的方法测 定其他底物浓度 下的反应速度。 A275 A275 vs Time