菌株鉴定流程总结
菌种鉴定方法
1. 菌落形态观察观察菌落的大小、形状、隆起度、边缘、表面性状、颜色与透明度、质地和干湿度。
2. 革兰氏染色按照革兰氏染色方法进行制片、初染、媒染、脱色、复染、干燥、镜检；干燥后，用油镜观察。
3. 鞭毛染色挑取18~30 h新鲜平板培养物制备菌悬液，制片，室温自然干燥。
滴加硝酸银染色A液覆盖3~5 min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴加B液染色约1 min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。
自然干燥后用油镜观察。
菌体呈深褐色，鞭毛显褐色。
4. 糖类分解试验将被检菌接种于糖发酵培养基中，37℃培养2－3天。
如果培养基变黄，说明产酸；如变黄的同时，还有气泡，说明既产酸又产气。
培养基仍呈蓝色，说明未产酸。
选取木糖、葡萄糖、半乳糖和蔗糖。
5. 吲哚（靛基质）试验将待检菌种接种于邓享氏蛋白质的胨溶液中，37℃培养1－2天。
于培养液中加入戊醇或二甲苯2－3ml，摇匀，静置片刻后，沿管壁加入试剂2ml，如出现红色沉淀，表示为阳性。
6. 淀粉水解试验将LB琼脂加热融化，使冷到50℃，加入淀粉溶液，混匀后，倾注平板。
将细菌划线接种于平板上，37℃培养24小时，生长后取出，在菌落处滴加革兰氏碘液少许，培养基呈深蓝色，能水许解淀粉的细菌菌落周围有透明环。
9. V－P试验将被检菌接种于试验培养基中（葡萄糖、K2 HPO4、蛋白胨各5g，溶于1 000ml 水中，分装于试管中，0.075MPa灭菌10分钟），培养2－7天后，于培养物中加入1ml 10％的NaOH，混匀，再加入3－4滴2%氯化铁溶液。
数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性。
10.甲基红（M.R）试验接种细菌，于37℃培养2－7天后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液（0.1g 甲基经溶于300ml 95%乙醇中，加蒸馏水至500 ml），如呈红色，表示阳性。
11. 柠檬酸盐利用试验将被检菌接种到Simmons固体柠檬酸盐培养基上，37℃下培养2－4天，能利用柠檬酸盐的细菌表现为有细菌生长，培养基变为蓝色，不能利用柠檬酸盐的细菌不生长，培养基不变色。
细菌鉴定流程
细菌鉴定流程细菌鉴定细菌形态学鉴定16S rDNA 鉴定生理生化鉴定一、细菌形态学鉴定1.从-80˚Ϲ冰箱中取出菌株放4˚Ϲ复苏，轻柔混匀后用接种环接一环菌液在培养基平板上划线活化，根据菌株来源选择适宜的培养基。
2.放入培养箱倒置培养，实验室一般采用28˚Ϲ培养，特殊菌株依据该菌最适条件（时间、温度）培养24-48h。
3. 纯化：从活化培养基平板上挑取单菌落继续划板培养。
4. 观察记录菌落形态特征：大小（mm）、形状、干湿、透明度、颜色、边缘整齐还是，，，，，，，形状干湿透明度颜色边缘细菌大小（mm）注意事项：①接种划线应在酒精灯旁边操作②培养时应倒置培养，防止污染二、革兰氏染色1.涂片固定将纯化后的菌株进行革兰氏染色，滴一滴生理盐水于载玻片上，无菌条件下用接种环挑取少量菌落均匀涂布水滴中，使其自然干燥，菌面向上，经火焰固定。
注意事项：菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定。
固定时通过火焰1~2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2.染色一般包括初染、没染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：（1）加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。
（2）加上碘液染色1分钟，水洗。
（3）加上95%酒精，摇动玻片，根据涂片厚度，脱色约20~60秒，水洗，吸去水分。
（4）加上蕃红后，染色1分钟，水洗。
（5）吸干或在空气中晾干后，油镜镜检。
3.结果观察：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
以均匀分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，都常呈现假阳性。
注意事项：①标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。
若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。
②玻片通过火焰温度不能太高。
③碘液变透明，则不能使用。
④水洗时动作要轻，沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗，以免把菌体冲掉。
三、16S rDNA 鉴定（16S rDNA只能鉴定到属，需进行生理生化、药敏实验等鉴定到种）1. 细菌复苏、活化、纯化同细菌形态学鉴定3. 挑取单菌落至少2-3个接到含有1ml灭菌纯水的1.5ml离心管中混匀。
maldi-tof-m 鉴定菌株的流程
maldi-tof-m 鉴定菌株的流程
MALDI-TOF-MS （Maldi-Time of Flight-Mass Spectrometry, 耐
抗谱分）
实验材料：
- MALDI-TOF-MS设备
- 培养菌株
- 甲醇
- 三氟乙酸
- 培养基
实验流程：
1. 培养菌株：将需要鉴定的菌株在适当的培养基上进行培养。
2. 菌株处理：从培养基上选择一个单纯的菌落，用无菌平片将其转移到一个干净的Eppendorf管中。
3. 菌株提取：在Eppendorf管中加入少量甲醇和三氟乙酸溶液，使用涡旋混匀片刻，使菌细胞充分裂解释放出内部物质。
4. 预处理：将混匀后的细胞提取液转移到MALDI-TOF-MS设
备的样品板上，并将其蒸发至干燥。
5. 涂覆基质：在样品板上加上MALDI基质（常用的基质有辛
基环磷酸、α-环磷酸、环蛋白等），使其充分覆盖菌株提取液。
6. 激光照射：将样品板放入MALDI-TOF-MS设备中，通过激
光照射基质，产生离子，使菌株提取物中的分子离子化。
7. 飞行时间质谱：离子化的分子通过飞行时间质谱仪进行分析，根据不同分子的质量与飞行时间的对应关系，得到质谱图。
8. 数据分析：将质谱图与已知数据库中的菌株质谱图进行比对，使用专门的软件进行数据分析，确定菌株的种属或进行进一步
分析。
注意事项：
- 携带手套和其他必要的个人防护装备，以避免可能的细菌感染。
- 确保所有使用的材料都是无菌的，防止污染和交叉感染。
- 在进行质谱分析之前，确保MALDI-TOF-MS设备的正常运行和校准。
菌种鉴定流程课件
菌种鉴定是微生物学研究的重要基础工作 ，对于揭示微生物的生态和进化关系、探 索生命科学的基本问题具有重要意义。
02
菌种采集
采集方法
01
02
03
采集方式
根据菌种类型和特性，选 择合适的采集方式，如表 面涂抹、深层挖掘等。
采集工具
根据采集需求，准备适当 的采集工具，如铲子、刀 具、试管等。
采集环境
选择适当的采集环境，如 土壤、水源、动物粪便等 ，并确保环境无污染。
ABCD
稀释分离法
将菌液进行稀释，然后涂布在培养基上，使菌落 分散生长，达到分离纯化的目的。
温度、pH等物理因素分离法
通过调节培养温度、培养基pH等物理因素，使 特定微生物生长繁殖，达到分离纯化的目的。
分离纯化的步骤
采集样品
选择适当的样品，并确保样品无 菌操作。
选择培养基
根据分离的微生物种类选择适宜 的培养基。
采集注意事项
采集安全
在采集过程中，注意个人 安全和卫生，避免交叉感 染。
采集代表性
确保采集的菌种具有代表 性，能够反映该地区的菌 种分布和特点。
采集量控制
根据需求适量采集，避免 过度采集和破坏生态环境 。
采集后的保存
保存容器
选择适当的保存容器，如密封袋 、试管等，并确保容器无菌。
保存环境
选择适当的保存环境，如干燥、阴 凉、避光等，以保持菌种的活性。
和鉴别。
结果分析的注意事项
1 2
准确性
确保鉴定结果的准确性，避免误差和偏差。
完整性
确保鉴定结果的完整性，涵盖菌种的所有相关信 息。
3
可重复性
确保鉴定结果的可重复性，以便于验证和复现。
细菌鉴定的一般步骤
新属的判定依据
16S rRNA序列同源性在95%以下 拥有该科的共有特性 与相邻属的脂肪酸组成及含量有显著差异 生理生化差异明显 极性脂成分有差异 注意：判定依据要根据实际情况而定
七、几个发育树例子的分析
地衣芽孢杆菌模式种的生理生化特性
分类在一个支上，同源性大于99%，初步判定 为地衣芽孢杆菌
细菌鉴定的一般步骤
办公室：综合楼B419 邮箱：
一、确保菌株的纯度
在鉴定菌株之前首先确保菌株的纯度。 假若菌株没有纯化好，将会做大量的无用功
二、PCR扩增16S rRNA片段
菌落直接PCR 菌体新鲜、加菌量少、阴性菌较阳性菌容易、 退火温度要高点
DNA扩 PCR 高盐法或CTAB法提取细菌总DNA DNA量不要加太多
五、发育树的构建及作用
确认目标菌株跟模式菌株间的遗传距离 确认目标菌株的分类定位 同源性较低，认定可能为新种或新属，有必要重新扩
增序列克隆测序
六、序列同源性差异分析
16S rRNA序列同源性在大于97% 慎重考虑
16S rRNA序列同源性在97%以下 有做新种的意义
16S rRNA序列同源性在95%以下 有可能是新属
Lm et al. IJSEM (2006), 56, 2409–2414Ancylobcter rudongensis
IJSEM (2004), 54, 385–388
Angulomicrobium amanitiforme
IJSEM (2004), 54, 651–657
生理生化性质
IJSEM (2004), 54, 651–657
选择模式种进行实验
菌种 15561 Angulomicrobium amanitifo 培养基编号： 1 830
菌种鉴定方法及步骤
菌种鉴定方法及步骤菌种鉴定是微生物学中的重要研究内容之一，它主要是通过对菌株的形态、生理生化特性以及分子生物学特征进行综合分析，来确定菌株属于哪一类别。
菌种鉴定的准确性对于微生物学研究和应用都具有重要意义。
下面将介绍菌种鉴定的一般方法及步骤。
一、形态学鉴定1.菌落形态观察：将菌株接种在合适的培养基上，培养一定时间后，观察菌落的形态特征，包括菌落的形状、颜色、质地等。
2.细胞形态观察：将菌株制备成适当的涂片，使用显微镜观察菌体的形态特征，包括细胞的形状、大小、排列方式等。
二、生理生化特性鉴定1.生长条件观察：菌株在不同培养条件下的生长情况对其鉴定有重要意义。
可通过调节培养基的pH值、温度、营养成分等条件，观察菌株在不同环境下的生长情况。
2.代谢产物检测：菌株的代谢产物可以通过化学方法检测，如氧化酶、酸碱指示剂等。
三、分子生物学特征鉴定1.16S rRNA序列分析：16S rRNA是细菌特有的序列，通过测序并与数据库中已知的16S rRNA序列比对，可以确定菌株的亲缘关系。
2.DNA指纹图谱分析：通过PCR扩增菌株的DNA片段，然后使用凝胶电泳或者高通量测序技术进行分析，可以得到菌株的DNA指纹图谱，从而进行鉴定。
菌种鉴定的方法及步骤主要包括形态学鉴定、生理生化特性鉴定和分子生物学特征鉴定。
其中，形态学鉴定主要通过观察菌落和菌体的形态特征来确定菌株的分类；生理生化特性鉴定则是通过观察菌株在不同环境条件下的生长情况和代谢产物来进行鉴定；分子生物学特征鉴定则是通过分析菌株的DNA序列以及DNA指纹图谱来确定其亲缘关系。
这些鉴定方法可以相互补充，提高鉴定的准确性。
在实际应用中，可以根据不同需求选择合适的方法进行菌种鉴定，以确保准确性和可靠性。
菌种鉴定方法及步骤
菌种鉴定方法及步骤菌种鉴定是指通过对菌株样本进行系统学、形态学、生理学和生化学等各方面的观察与检测，以确定其属、种分类地位的过程。
菌种鉴定方法及步骤如下：2.制备纯培养物：分离并得到纯培养菌株，避免混杂的现象。
3.形态学观察：观察菌株的形态特征，包括菌落形态、菌落颜色、菌丝生长特征等。
4.微观形态学观察：观察菌株的细胞形态、孢子形态、菌丝形态等。
5.分类地位确定：通过对菌株的形态特征进行比对和研究，确定其属、种分类的地位。
1.生长条件观察：观察菌株在不同的生理因素（如温度、pH值、氧气含量等）下的生长情况。
2.营养需求观察：观察菌株在不同营养物质（如碳源、氮源等）的利用情况，以及对不同抗生素和化学物质的敏感性。
3.生化特征检测：进行生化试验，如氧化酶试验、氧化发酵试验、内酯酶试验等，以检测菌株的生化特征。
4.产物检测：检测菌株的代谢产物，如抗生素、酶等，以判断其代谢途径和功能。
1.提取菌株基因组DNA：通过细菌培养物提取菌株的基因组DNA。
2.PCR扩增：使用特异性引物进行PCR扩增，选择适当的靶基因进行扩增。
3.DNA测序及分析：对扩增的DNA产物进行测序，利用生物信息学方法对测序结果进行分析和比对。
4.基因序列比对：将测序结果与数据库中已知菌种的基因序列进行比对，以确定菌株的分类地位。
四、传统鉴定方法的优缺点1.优点：传统鉴定方法操作简单，成本低廉；不需要复杂设备，适用于一般实验室进行菌株鉴定。
2.缺点：传统鉴定方法对菌株鉴定仅限于形态学、生理学和生化学等方面的观察，鉴定结果存在一定的主观性和局限性；需要较长的时间才能得到鉴定结果。
五、分子生物学鉴定方法的优势1.高精确性：分子生物学鉴定方法通过对菌株的基因序列进行比对，可得到较高的精确性，减少了主观性和局限性。
2.快速性：分子生物学鉴定方法在提取DNA和PCR扩增等步骤后，可以迅速得到鉴定结果，节省了时间。
3.可靠性：分子生物学鉴定方法的结果具有较高的可靠性，有助于解决传统鉴定方法在分类地位判断方面的困难。
标准菌株验证鉴定步骤
1.1 金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌标准菌株：挑取部分干粉溶解于0.9% 无菌氯化钠溶液中，划线接种于营养琼脂平板上，36℃±1℃培养18-24 小时。
并观察菌落形态。
a. 金黄色葡萄球菌：菌落凸起，圆形，不透明；b. 大肠埃希氏菌：菌落稍凸，圆形，湿润，乳白色；c. 铜绿假单胞菌：菌落扁平，圆形，边缘不整齐，光滑湿润，可产生蓝绿或黄绿色素；d. 枯草芽孢杆菌: 表面粗糙不透明，镜检菌体有芽孢。
1.2白色念珠菌：挑取部分干粉溶解于0.9% 无菌氯化钠溶液中，划线接种于改良马丁琼脂培养基平板或PDA 琼脂平板上，30℃-35℃培养24-48 小时。
本菌细胞呈卵圆形，很象酵母菌，比葡萄球菌大5～6 倍，革兰氏染色阳性，但着色不均匀。
黑曲霉：挑取部分干粉溶解于0.9% 无菌氯化钠溶液中，划线接种于改良马丁琼脂斜面培养基上，23℃-28℃培养48-96 小时。
菌丛呈黑褐色，粗糙。
1.2 生孢梭菌：挑取部分干粉溶解于0.9% 无菌氯化钠溶液中，接种于硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃～35℃培养18-24 小时；或在厌氧条件下接种于哥伦比亚琼脂上，30℃～35℃厌氧培养18-24 小时。
2、菌种鉴定：2.1金黄色葡萄球菌：革兰氏染色试验：革兰氏阳性菌(紫色)，葡萄状排列，球菌。
兔血浆试验：接种1 个单菌落于1 支兔血浆溶液中，30℃-35℃培养至6 小时，每半小时观察一次。
凝固为阳性。
金黄色葡萄球菌为阳性反应。
2.2大肠埃希氏菌：革兰氏染色试验：革兰氏阴性杆菌，红色。
IMVC 生化试验：2.3铜绿假单胞菌：革兰氏染色试验：革兰氏阴性杆菌，红色A。
氧化酶试验：将氧化酶试纸用蒸馏水浸湿，用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落，涂在试纸上。
在60s 内变为蓝色或蓝紫色为阳性，不变色为阴性。
绿脓菌素试验：取斜面培养物接种于PDP 琼脂培养基斜面上，培养24 小时，加三氯甲烷3～5 ml 至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。
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学习总结各位领导好，从5月25号开始，在周老师的实验室已经进行了十多天的培训，让我学到很多。
现将我在实验室学习的情况总结汇报。
一、细菌鉴定流程：1.表观观察鉴定：培养24h的菌落观察，如：菌落形态（圆形、椭圆形等）、大小（直径多少）、表面光滑度（光滑和粗糙）和隆起情况（扁平，隆起，凸起等）、边缘整齐、菌落的透明度、菌落（菌落颜色及是否产生色素等）及培养基的颜色（培养基是否变色）等菌落的描述。
显微观察，观察单个菌的形态（杆状，圆形，椭圆形，螺旋形等），是否有芽孢，荚膜的情况。
染色观察，革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色。
2.分子鉴定：细菌DNA的提取（试剂盒法）⑴将菌种接在适宜的液体培养基中，进行液体发酵，180rpm/min，24h培养。
⑵将摇瓶发酵的菌液加到1.5ml离心管中，10000rpm离心1min，倒掉上清液。
⑶向菌体沉淀中加入200ul缓冲液GA，震荡，至菌体悬浮。
如果是革兰氏阳性菌，则向菌体中加入120ul的Tris盐酸缓冲液，再加入80ul溶菌酶，37℃，30min以上。
⑷向离心管中加入20ul蛋白酶K溶液，混匀。
⑸加入220ul缓冲液GB，震荡15s，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
⑹加入220ul无水乙醇，充分震荡混匀15s，可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
⑺将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个离心柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑻向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑼向吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑽重复操作步骤⑼。
⑾ 将吸附柱CB3放入收集管中，12000rpm 离心2min ，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
⑿ 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加50-200ul 洗脱缓冲液TE （或ddh H 2O ），室温放置2-5min ，12000rpm 离心2min ，将溶液收集到离心管中，-20℃保存。
PCR 扩增和电泳检测细菌扩增引物（16SRrDNA ）为：27F ：5'-AGAGTTTGA TCCTGGTCAGAACGAACGCT-3'； 1492R ：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3'。
扩增体系：10 x buffer 5μl dNTP 4μl Mg2+ 3μl 引物1 1μl 引物2 1μl Taq 酶 0.4μl 模板 2μl 双蒸水 33.6μl 总体积50μlPCR 的扩增条件：Lid temp ：99℃预变性温度：95℃ 5min 变性温度 ：94℃ 1min 退火温度 ：58℃ 30s 延伸温度 ：72℃ 90s 最后延伸 ：72℃ 10min 保温 ：4℃ ∞电泳凝胶检测：基因组的在2.3kb 处，扩增引物在1.5kb 处，如在23kb 和1.5kb 处出现亮条带，则操作成功。
送去测序（华大基因测序和博尚生物测序）35个循环DNA分子拼接，由测序公司拼接或者自己用DNAMAN拼接在NCBI上进行核苷酸序列比对以及用MEGA软件构建系统发育树。
3.生理生化鉴定根据分子鉴定的结果（已鉴定到属），对照常见细菌鉴定手册进行生理生化的鉴定。
常规生理生化的鉴定：3.1糖醇类发酵，产酸产气一般细菌以休和利夫森二氏培养基，芽孢菌用芽孢菌专用培养基或用休和利夫森二氏培养基进行培养观察。
葡萄糖以被测1%糖、醇代替。
主要包括：D-葡萄糖、乳糖、半乳糖（麦芽糖替代）、蔗糖、D-甘露醇、肌醇、D-山梨醇、D-木糖、D-果糖、甘油。
以幼龄斜面培养物穿刺接种于上述培养基，适温培养，1，3，5天后观察，如指示剂变黄，表示产酸，为阳性;不变或变蓝则为阴性。
3.2甲基红、V.P测定甲基红（M.R）和V.P测定的实验使用相同的培养基，甲基红测定是在培养2、6天时滴加一滴甲基红试剂观察颜色变化，红色为阳性，黄色为阴性。
V.P测定同甲基红相同，只是加入的试剂不同，V.P测定是加入肌酸来鉴定的，反应10min，培养基中有红色出现为阳性，有时需放置更长的时间。
3.3吲哚实验使用1﹪胰胨水溶液培养基，在培养1,2,4,7天的培养液中加入3～5mm高的吲哚试剂于培养基表面，在液层界面发生红色为阳性。
若颜色不明显，可加入4～5滴乙醚至培养液，摇动，静置片刻，再加入吲哚试剂。
3.4明胶、淀粉的水解将加入明胶的培养基分装于试管中，灭菌，穿刺接种，20℃培养2，7,10,14和30天。
在20℃以下的室温观察生长情况和明胶是否液化。
如菌已生长，明胶表面部分或全部变为可流动的液体，则为明胶水解阳性。
菌落在加入可溶性淀粉的肉汁胨培养基上划线，培养2～5天，形成明显菌落后，在平板上滴加卢哥氏碘液，菌落周围有不变色透明圈者为阳性，仍是蓝黑色为阴性。
3.5硝酸盐的利用包括硝酸盐还原，亚硝酸还原，反硝化，产氨反应四个实验将菌种分别接在硝酸盐还原和亚硝酸还原实验得培养基上面，硝酸盐还原实验培养1,3,5天，而亚硝酸还原实验培养1，3，7天，加入格里斯氏试剂A液和B液进行观察，记录颜色变化，根据颜色变化判断阳性和阴性。
硝酸盐还原实验无红色出现，且滴加二苯胺试剂不呈蓝色，为阴性。
亚硝酸盐还原实验，滴加格里斯氏试剂A液和B液，为红色是阴性。
反硝化实验需密封培养，有气泡产生为阳性，不产气泡为阴性。
在产氨培养基上培养1,3,5天，滴加Nessler试剂，出现黄褐色沉淀为阳性。
3.6接触酶和氧化酶实验接触酶实验是将幼龄培养物与过氧化氢接触，有气泡者为阳性，无气泡者为阴性。
氧化酶实验是将培养24h的菌苔涂抹在被1﹪盐酸二甲基对苯撑二胺水溶液湿润的滤纸上，观察颜色变化，10s内菌苔现红色者为阳性10～60s现红色者为延迟反应，60s以上现红色者不计，记为阴性。
3.7纤维素分解在无机盐基础培养基中加入优质滤纸条，能将滤纸条分解成一团纤维或将滤纸条折断或变薄者为阳性，滤纸条无变化者为阴性。
3.8酯酶实验（Tween80）菌种在加了Tween80的培养基上划线，培养7天，每天观察。
在生长的周围有模糊的晕圈者为阳性，没有晕圈者为阴性。
3.9脲酶实验将加了尿素的培养基制成斜面，接种培养，分别于2h，4h过夜观察，培养基呈桃红色者为阳性，培养基颜色不变化着为阴性。
二、真菌鉴定流程：1．表观鉴定查看菌丝的特征，孢子头的特征，足细胞的特征，然后对照微生物真菌守则来查看真菌大概属于哪类，再进行分子鉴定。
2．分子鉴定2.1、真菌DNA提取（试剂盒法）⑴样品（新鲜/冷冻样品）准备：将样品收集在1.5或2ul的微量离心管中，用镊子夹管在液氮中冷冻。
用磨杵磨碎，也可以使液氮蒸发后存于-70℃备用。
杵棒在用过一次后最好放入漂白溶液中直到干净（高压灭菌）⑵收集已磨碎样品100mg于微量离心管中（4～6个）立即加入FG1 600ul充分涡旋混匀。
分散所有块组织。
⑶65℃10min培养时，颠倒混合样品两次。
⑷FG2 140ul涡旋混匀离心≥10000g 10min。
⑸小心吸出上清夜于新离心管中，注意别吸入碎片，异丙醇（0.7v）420ul涡旋使DNA沉淀（大多情况可以吸出600ul上清液，需加入420ul异丙醇即大约0.7volume，但加入量可依吸出量改变）⑹快速离心，10000g 2min 使DNA呈颗粒状。
⑺吸出去除所有上清液保证不破坏沉淀物，可倒转离心管在纸上吸干液体。
⑻加入无菌水300ul，65℃涡旋使DNA溶解（可保温65℃加速溶解）加入RNase 4ul混匀（勿剧烈）⑼加入FG3 150ul无水乙醇300ul充分混匀，尽量同时加入勿产生沉淀，若产生，反复抽打10～15次（勿剧烈）⑽将离心管内所有物质转移到过滤柱中，放入一个2ml的离心管中，离心10000g/min，弃去管及液体，只留柱子。
⑾将柱子放入第二个离心管中，加入Wash Buffer（已加入无水乙醇）700ul，离心10000g/min，弃去液体，管柱留用⑿重复上一步骤，再加入700ul Wash Buffer，离心，弃去液体，管柱留用⒀将上一步空管柱在离心最大速(13000g)2min使其干燥，此步很关键，去除残余的酒精，否则会将DNA洗脱影响下面步骤。
⒁将柱子转移入干净的1.5ml管中，加入已预热65℃Elution Buffer（或无菌水）100ul室温反应2～3min，离心10000g/min，洗脱DNA。
⒂重复上一步，加入100ul Elution Buffer，可用另一个管收集来保证第一次收集浓度高。
2.2、PCR扩增和电泳检测真菌扩增引物（ITS序列）为：ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；ITS4：5'-TCCTCCGCTTA TTGA TA TGC-3'。
真菌PCR扩增体系：10×buffer 5μL Mg2+ 4μL dNTP 4μL 引物1 2μ 引物2 2μL Taq 酶 2μL 模板 4μL 双蒸水 29μL 总体积50μLPCR 的扩增条件：预变性温度：94℃ 3min 变性温度 ：94℃ 50s 退火温度 ：50℃ 1min 延伸温度 ：72℃ 90s 最后终延伸：72℃ 10min 保温 ：4℃ ∞电泳凝胶检测：基因组的在2.3kb 处，扩增引物在700bp 处，如在23kb 和700bp 处出现亮条带，则操作成功。
2.3 测序（华大基因测序和博尚生物测序）2.4 DNA 分子拼接，由测序公司拼接或者自己用DNAMAN 拼接 2.5 在NCBI 上进行核苷酸序列比对以及用MEGA 软件构建系统发育树。
三、总结该细菌鉴定方法是一个简便，快捷的菌种鉴定方法，rRNA 序列是揭示微生物系统发育关系的进化计时计系统发育：研究生物的进化历史。
16S rRNA 序列同源性是确定属的关键指标，但是16S rRNA 序列的属种鉴定的方法并不是完全可行，已知已发现同种内个别菌株序列差异很大，而不同属菌株序列相似性很高的问题。
在这个基础上就需要很多其他的鉴定方法来验证和其别。
35个循环。