基因工程6
基因工程操作的基本步骤
基因工程操作的基本步骤
基因工程是指人为地将外源基因导入到宿主生物体中，并使其在宿主中表达出来的技术。
基因工程的操作一般包括以下基本步骤：
1.确定目标基因：确定想要转入宿主生物体的目标基因，这可能是来自其他生物体的其中一种特定基因。
2.获得目标基因：获得目标基因的DNA序列，通常通过基因重组、合成或从源生物中提取。
3.构建载体：将目标基因插入到一个载体DNA中，以便将其导入宿主生物体。
载体可以是人工合成的质粒或病毒，能够稳定地带有外源DNA。
4.转化宿主生物体：将构建好的载体导入到宿主生物体中，使其接受外源基因。
转化方法可以包括化学方法、电击法、基因枪等。
5.筛选转化体：通过筛选方法，如对转化体进行培养基的筛选、对荧光标记的筛选等，来选出成功转化了外源基因的宿主生物体。
6.验证基因表达：通过PCR、蛋白质表达分析等实验方法验证外源基因是否成功表达。
7.优化表达：根据目的需要，可以通过引入启动子、启动子增强子、终止子等调控元件，优化外源基因的表达。
8.传代培养：将成功表达外源基因的宿主生物体进行传代培养，以使其后代继续表达目标基因。
9.应用研究：将表达目标基因的宿主生物体应用于研究中，如表达重要药物、生产工业化酶、改良农作物等。
基因工程课后习题答案
基因工程课后习题答案基因工程课后习题答案基因工程是一门涉及生物学、遗传学和生物技术的综合学科，它的发展和应用在医学、农业、环境保护等领域具有重要意义。
在学习基因工程的过程中，我们常常会遇到一些习题，下面是一些常见的基因工程课后习题及其答案，希望能对大家的学习有所帮助。
1. 什么是基因工程？基因工程是利用生物技术手段对生物体的基因进行操作和改变的过程。
它包括了基因的克隆、重组、转染和编辑等技术，旨在实现对基因组的精确控制和改造。
2. 请简要介绍基因克隆的步骤。
基因克隆是指将感兴趣的基因从一个生物体中复制并插入到另一个生物体中的过程。
其步骤主要包括：DNA提取、DNA片段的切割、载体DNA的准备、DNA片段的连接、转化和筛选等。
3. 什么是重组DNA技术？重组DNA技术是指将来自不同生物体的DNA片段进行切割，然后通过连接酶将其重新组合成新的DNA分子的过程。
重组DNA技术的应用广泛，可以用于基因克隆、基因表达、基因治疗等领域。
4. 请简要介绍PCR技术。
PCR（聚合酶链反应）是一种体外扩增DNA的技术。
它通过不断重复DNA的变性、退火和延伸等步骤，可以在短时间内大量复制目标DNA序列。
PCR技术在基因工程中被广泛应用于基因克隆、基因检测和DNA测序等方面。
5. 什么是基因编辑技术？基因编辑技术是指通过直接对基因组进行修改，实现对目标基因的精确编辑和改造的技术。
目前最常用的基因编辑技术是CRISPR-Cas9系统，它可以实现高效、精确和经济的基因编辑，对于研究基因功能和治疗基因相关疾病具有重要意义。
6. 基因工程在医学领域有哪些应用？基因工程在医学领域的应用非常广泛，包括基因治疗、药物生产、疫苗研发等方面。
例如，通过基因工程可以将治疗性基因导入患者体内，用于治疗遗传性疾病和癌症等疾病；还可以利用基因工程技术生产重组蛋白药物，如胰岛素和生长激素等。
7. 基因工程在农业领域有哪些应用？基因工程在农业领域的应用主要包括转基因作物的培育和农业有害生物的控制。
基因工程概论(6-7)
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列的影响：
一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效
率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱
基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而 言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅 度降低
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
ori
含有外源启动子活性的重组克隆
启动子
启动子的构建
启动子
PlL
-35 区序列
T T G A C A
-10 区序列
G A T A C T
PrecA
PtraA Ptrp Plac Ptac
T T G A T A
T A G A C A T T G A C A T T T A C A T T G A C A
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
起始密码子及其后续若干密码子的影响： 大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG 三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50% 而UUG只及AUG的25%。除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱 基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5’ 端非编码区
过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物
过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因
基因工程的基本操作
基因工程的基本操作
基因工程的基本操作包括以下几个步骤：
1. 取得目标基因：首先需要获得目标基因的DNA序列。
这可以通过多种方法实现，如克隆、PCR扩增、合成等。
2. DNA切割：将目标基因从DNA样本中分离出来，通常需要用到一种特殊的酶——限制性内切酶。
这些酶可以在DNA的特定序列处切割，从而得到目标基因的DNA片段。
3. DNA连接：将目标基因的DNA片段与载体DNA连接在一起。
载体DNA是一种能够自复制的DNA分子，可以在细胞中稳定存在。
连接的过程通常需要使用DNA连接酶。
4. 转化：将连接好的DNA载体导入宿主细胞中。
这可以通过多种方法实现，如电穿孔、热激击等。
5. 克隆和筛选：选择合适的宿主细胞，并用培养基培养细胞，使其增殖。
通过筛选方法，如抗生素筛选、荧光检测等，筛选出带有目标基因的克隆。
6. 验证：对获得的克隆进行验证，确认目标基因已经成功导入宿主细胞，并且在细胞中表达。
7. 基因表达和应用：利用已经导入细胞中的目标基因进行进一步的研究。
可以通过控制基因的表达水平，探究基因的功能和
调控机制。
同时，还可以利用基因工程技术将目标基因导入其他生物体，实现特定性状的改良和应用。
基因工程的基本步骤
基因工程的基本步骤基因工程是指利用生物学技术对生物体的基因组进行人为操作，使其具备特定的性状或功能。
基本上，基因工程的步骤可以分为六个主要阶段：1.确定目标基因：在基因工程开始之前，需要先确定需要操作的目标基因。
这可以通过研究和了解生物的性状或功能来完成。
目标基因的选择通常是基于改善生物的其中一种属性，提高产量或抗病能力等。
2.基因克隆：基因克隆是基因工程的基本步骤之一，用于将目标基因从一个生物体中复制并放置到另一个生物体中。
这一步骤通常分为几个关键步骤：DNA提取、酶切、DNA连接和转化。
-DNA提取：从源生物体提取DNA，常用的方法是通过细胞裂解将DNA释放出来。
-酶切：用限制性内切酶切割DNA，生成特定的DNA片段。
-DNA连接：将目标基因与载体DNA连接，通常是通过DNA连接酶的作用。
-转化：将连接好的DNA导入宿主生物体中。
常用的转化方法包括化学法、电穿孔法和冲击法。
3.重组DNA的构建：一旦目标基因被克隆到载体中，可以通过多种方法进行DNA的重组构建，以进一步优化基因工程的效果。
这包括基因片段的串接、引入启动子或选择标记等。
4.基因表达：一旦重组DNA被构建完成，下一步就是将其表达出来。
这通常涉及将重组DNA导入宿主细胞中，并使用适当的启动子、增材剂和培养条件来促进基因的表达。
通常使用细菌、酵母、植物细胞或动物细胞等作为宿主。
5.选择性筛选：在基因表达后，筛选和选择性培养可以帮助确定哪些宿主细胞成功地表达了目标基因，并且可以通过对宿主细胞进行筛选和选择来鉴定这些细胞。
6. 验证和分析：一旦基因工程完成，需要将其验证和分析，以确保达到预期的结果。
这可以通过PCR分析、Southern印迹等方法来检测目标基因的存在和表达。
需要注意的是，这只是基因工程的基本步骤，实际操作可能有所不同。
此外，随着技术的不断发展，基因工程领域正在不断创新和进步，可能会有新的方法和技术被应用，以提高基因工程的效率和精度。
基因工程基本操作步骤
基因工程基本操作步骤
1、目标基因的选择。
这是进行基因工程的第一步，目标基因可以是已知的具有特定功能的基因，也可以是未知的探索性研究对象，在选择时需要考虑多个方面，如所需功能、适用范围、安全性等。
2、克隆目标基因。
这一步骤包括提取DNA、使用限制性内切酶将DNA切割成特定长度、连接载体（如质粒、病毒等）以及转化宿主细胞（如大肠杆菌、哺乳动物细胞等）。
3、构建重组表达载体。
这一步骤包括选择合适的载体、插入目标基因、调节表达（如调节启动子和终止子）等，重组表达载体是将目标基因嵌入到载体中，使其能够在宿主细胞中表达。
4、转染宿主细胞。
这一步骤包括选择合适的宿主细胞、转染重组表达载体、筛选阳性克隆等，转染宿主细胞是将构建好的重组表达载体转移到宿主细胞中，使其能够在宿主细胞中进行表达。
5、目的基因的检测与鉴定。
这一步骤包括分子水平上的检测（如DNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术）和个体水平上的鉴定（如抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等）。
6、分离和纯化目标蛋白。
这一步骤包括破碎宿主细胞、
使用不同的技术对混合物进行分离（如层析、电泳等）。
第6章目的基因的分离克隆(植物基因工程)课件
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14(2) 如何从cDNA中找到所需要的基因？15转录水平上的基因克隆方法
l 差别杂交筛选 l 扣除杂交 l 代表性差别分析 l 差异显示 l cDNA阵列杂交 l 基因表达系列分析 l 抑制差减杂交
筛选目的基因(核酸探针法、免疫结合法)因库应当能包括全部的基因组序 列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总 克隆数目少，常选择能接受较大片段的载体。 令检测是否包括一个完整的基因组序列的公式：
令例:人类基因组3.0x106kb, 以λEMBL作载体， 插入片段的平均长度为17kb ，p为99%时, 基因 库应有8.1x105 个 重组噬菌体。
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n基于EST信息的基因克隆
EST
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由杨树EST库获得基因序列
PCNA
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克隆的核酸酶
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2、基因组水平上的克隆
将ry) ：将某种生物的基因组DNA切割成 一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进 行克隆。这些存在于所有重组
➢差别杂交筛选
含有表达 目的基因
不含有表 达目的基因cDNA 铺平板转膜 转膜提取分离 mRNA
cDNA 探针
提取分离 mRNA
cDNA 探针
比较 分析
用对照样品cDNA作探 针杂交的X光片中没有 而在检测样品cDNA作 探针杂交的X光片中有 的印斑，可对照X光片 从原平板挑出菌落进行 鉴定是否含有目的基因
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菌落杂交技术寻找目标DNA克隆
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文 库 的 抗 体 筛 选
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(2) T-DNA标签克隆基因
人教版高中生物选择性必修第3册 基因工程 基因工程(6)
教案1.纤维素酶的作用机理师生共同回顾选修1中所学的纤维素酶的作用机理。
我们首先回顾一下有关纤维素酶的内容。
纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称。
纤维素酶根据催化功能的不同分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三类。
[3]我们来一起了解一下纤维素酶的作用机理。
图1从图1中我们可以看出，内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶在发挥催化功能时，切断纤维素的β-1，4糖苷键，将纤维素多糖的长链切成短链，进而产生纤维二糖、纤维糊精等产物。
之后β-葡萄糖苷酶将纤维二糖等继续水解为葡萄糖。
不同种类的生物产生的纤维素酶会有一些差别。
2.纤维素酶在实践中的应用遇到的问题教师提出问题1：从生物体中提取的纤维素酶是否可以直接用于生产呢？教师提供资料：生产中应用纤维素酶时的实际实验资料。
图2这张曲线图2，体现的是纤维二糖对纤维素水解的影响。
由此可见，在实际生产中，外切葡聚糖酶催化纤维素水解产生的产物纤维二糖会抑制酶的活性，从而减少小分子糖的生成速率。
出现这样的问题，限制了天然的纤维素酶在生产中的应用。
3.纤维素酶的改造教师提出问题2：如果要找出产物抑制酶活性的原因，你有什么思路呢？教师适当给出思考方向：纤维素酶有怎样的结构，产物和酶结构之间有怎样的相互作用？怎样去除纤维二糖等等。
图3图4图3中左侧是外切葡聚糖酶的结构图，外切葡聚糖酶是蛋白质，是由氨基酸脱水缩合形成的肽链构成的，肽链盘曲、折叠，形成有一定空间结构的蛋白质分子。
右侧是外切葡聚糖酶的结构简图。
从图中我们可以看出，外切葡聚糖酶分为催化区域、纤维素结合区域、以及二者的连接区三个主要部分。
进一步的了解一下外切葡聚糖酶的催化区域的结构。
图4中灰色的部分代表外切葡聚糖酶催化区域的肽链，黄色的结构代表酶催化区域的第248位的精氨基酸和第385位酪氨酸的侧链基团（R基），橙色分子代表产物纤维二糖。
右侧是精氨酸和酪氨酸的结构图，观察两种氨基酸的R基，如果二者的侧链基团接近，就会产生相互作用。
(参考)基因工程 第六章 DNA重组的操作
(三) 酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
2. 酶联（enzyme-link）： 二抗上携带一种酶能催 化无色底物转变为有色的物质（或发光），再通 过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而
其中载体介导的转化方法是目前植物基因工程中使用最多、 机制最清楚、技术最成熟的一种转化方法，而转化载体中 又以Ti质粒转化载体最为重要。
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（三）重组DNA导入动物细胞
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 磷酸钙沉淀法 脂质体介导感染法 显微注射法 病毒感染法 DEAE葡聚糖转染技术 电击法 血影细胞介导法
为了克服以上弊端，目前对平末端连接常采用同 聚物加尾法、衔接物连接法和DNA接头连接法等改 进方法。
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三、PCR产物的连接
PCR扩增是获得目的基因的重要途径 PCR产物的连接是基因工程实验中经常性的工作， 其主要方法有：
引入酶切位点克隆法、T-A克隆法和平末端克隆法等
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（一）引入酶切位点连接法
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电转化的原理图（引自孙明，2006）
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（二）感染 将以λ噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒 颗粒，使其感染受体菌的过程称为感染，由噬菌体 和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导 （transduction）
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二、重组DNA导入真核细胞的方法
常用的方法有电击法、磷酸钙沉淀法、脂质体 介导法等； 进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基 因组中，也可以在染色体外存在和表达。
高中生物必修二《6-2基因工程》课件
质粒
质粒是基因工程 最常用的运载体，它 广泛地存在于细菌中， 是细菌染色体外能够 自主复制的很小的环 状DNA分子，大小只 有普通细菌拟核DNA 的百分之一。
大肠杆菌质粒的分子结构示意图：
DNA 大肠杆菌细胞 目的基因插入位点
“标记基因”
氨苄青霉素 抗性基因
质粒
有切割位点
复制原点 有标记基因的 存在，将来可 能复制并带着插入的 用含青霉素的 质粒一般有几个到几百个基因，控制细菌的 目的基因一起复制 培养基鉴别。
在生物体内进行有 性生殖过程中，控 制不同性状的基因 重新组合
同一物种的不同 基因
按人们意愿，把一种 生物的某种基因提取出 来，修饰改造后放到另 一种生物的细胞里，定 向改造生物遗传性状
不同物种间的不同基因
繁殖方式
有性生殖 小
无性生殖 大
变异大小
意义
是生物变异的主要来源， 使人类有可能按自己意愿 对生物进化有重要意义 定向培育新品种
利用基因工程方法制造“工程菌”，可高效率地 生产出各种高质量、低成本的药品。
基因 工程 药品
药品
干扰素 白细胞介素 疫苗 凝血因子
乙肝疫苗 狂犬病疫苗 百日咳疫苗
（三）基因工程与环境保护
利用转基因细菌分解泄漏的石油，降解有毒有害 化合物，吸收环境中的重金属，处理废水等
五、转基因生物和转基因食品的安全性
四、基因工程的应用 （一）基因工程与动植物育种 1、培育高产、稳产、优质和抗逆性 的转基因作物新品种
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密码子
密码子偏爱性对外源基因表达的影响
外源基因全合成 按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适 宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在 大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法
6 大肠杆菌基因工程
C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略
包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
+、galT+ +、galK-的大肠杆菌受体菌株 转化galE+
终止密码子 Aprr pKO1 galK
ori
含有外源启动子活性的重组克隆
启动子
启动子的构建
启动子 P L L PrecA recA PtraA traA Ptrp trp Plac lac Ptac tac -35 区序列 T T G A C A T T G A T A T A G A C A T T G A C A T T T A C A T T G A C A -10 区序列 G A T A C T T A T A A T T A A T G T T T A A C T T A T A A T T A T A A T
包涵体型异源蛋白的表达
以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点
包涵体表达形式的优点： 能简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体 经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂 解物中分离出来 能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组 蛋白的稳定性已构不成威胁
Ptrp trp 除去色氨酸
Otrp trp 或加3-吲哚丙烯酸 （IAA） 高效转录
终止子
强化转录终止的必要性
外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑 过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物 过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因 本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或 DNA 功能区域，如选择性标 记基因和复制子结构等，则 RNA 聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生 物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源 基因编码产物的翻译效率
X2 2
Xn n
X
Ag
Ag
Ag
Ag
在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为 无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人 工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作
包涵体型异源蛋白的表达
包涵体的变性与复性操作
包涵体的溶解与变性： 包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键 在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。能有效促进 包涵体溶解变性的试剂和条件包括： 清洗剂 促溶剂 SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化 盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发 形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应 廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应
密码子
生物体对密码子的偏爱性
不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码 子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是： 生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体 X174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC 丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子 占90%以上的绝对优势 密码子与反密码子相互作用的自由能 性中等强度规律 如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少； 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多； 细胞内tRNA的含量
基因工程
上海海洋大学食品学院 孙晓红
6 大肠杆菌基因工程
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略 D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
6 大肠杆菌基因工程
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势
包涵体型异源蛋白的表达
包涵体及其性质
在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它 们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不 溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。富含蛋白质的包涵 体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些 氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从 而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成 非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式 存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和 脂多糖等非蛋白分子
Ptac tac = 3 Ptrp trp = 11 Plac lac
启动子
启动子的可控性
乳糖启动子Plac lac的可控性：
野生型的Plac 与其控制区Olac lac lac 偶联在一起，在没有诱导物 存在时，整个操纵子处于基 底水平表达；诱导物可以使 启动子Plac 介导的转录大幅 lac 提高 P O 高效转录 P 乳糖 异丙基--D-硫 代半乳糖苷（IPTG） 诱导 O 基底水平转录 阻遏蛋白
6 大肠杆菌基因工程
B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
启动子
启动子最佳距离的探测
E A
目的基因 E
目的基因 E E筛选
采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段 克隆到启动子探针质粒pKO1上 受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质 粒上报告基因galk的表达产物联合作用， 可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质
终止子
强终止子的选择与使用
目前外源基因表达质粒中常用的终 止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的 rrnT1 T 2以及T7噬菌体DNA上的T。对 1 2 于一些终止作用较弱的终止子，通常 可以采用二聚体终止子串联的特殊结 构，以增强其转录终止作用 终止子也可以象启动子那样，通过 特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因 组DNA中克隆筛选
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列与起始密码子之间的序列的影响： SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而 CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻 AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌-半 乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或 CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20 倍
包涵体型异源蛋白的表达
包涵体的变性与复性操作
蛋白质变性复性的动力学原理： N U C A I X
天然状态的蛋白质 变性状态的蛋白质 共价修饰的蛋白质 集聚状态的蛋白质 有效变复性过程中的中间状态 脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态 U I1 1 In n N C1 1 C2 2 Cn n C
X1 1
包涵体型异源蛋白的表达
以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点
包涵体表达形式的缺点： 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通 过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具 有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产 物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白 分子中的半胱氨酸残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当 低，一般不超过30%
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
起始密码子及其后续若干密码子的影响： 大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG 三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50% 而UUG只及AUG的25%。除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱 基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5’ 端非编码区形 成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有 与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的
密码子
密码子偏爱性对外源基因表达的影响
由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程 大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高 效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略 可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达： 外源基因全合成（更换同义密码子） 同步表达相关tRNA编码基因
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列与起始密码子之间的距离的影响： SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体 上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P 位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG 之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均 会导致翻译起始效率不同程度的降低
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列的影响： 一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效 率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱 基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而 言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅 度降低
启动子
启动子的可控性
乳糖启动子Plac lac的可控性：