基因治疗存在问题与伦理学

基因治疗存在问题与伦理学

从前节叙述中，已可看出基因治疗的研究与实践中存在着若干重要问题。

1．导入基因的稳定高效表达外源基因转移入病人体内细胞表达，首先与转移方法有关。化学和物理方法所导入的基因效率低，自然表达也差。选择适当的受体细胞，也是为了导入基因能稳定高效的表达。骨髓作为受体细胞使用最多。反转录病毒载体介导基因，只能对分裂状态时的细胞进行传染，因此采取如5－FU处理，使细胞分裂增强，再用含有目的基因病毒颗粒传染可获较好效果。所以，对骨髓细胞培养、干细胞纯化、培养时使用造血因子等方法，可增加基因稳定高效表达。

2．导入基因的安全性基因治疗的安全性应确保不因导入外源目的基因而产生新的有害遗传变异，这是因为采用反转录病毒载体而引起的问题。因此，应构建相对安全的反转录病毒载体。至于引起插入突变可能失活一个重要基因，或更严重的激活一个原癌基因，这个问题的危险程度到底有多大目前仍不清楚，但至今的实践表明尚未见明显严重问题。

为安全有效地进行基因治疗，任一方案的实施，都要根据严格的技术规程与标准，由有关的行政管理部门批准实施。

与安全性相联系的就是生殖细胞基因治疗。虽然在人类尚未实施，但在动物实验已获成功，这就是转基因的动物出现。这一事实既给人类生殖细胞基因治疗带来了希望，同时也使人们耽心这种遗传特征的变化世代相传，将给人类带来的是福还是祸。因此，许多科学家不仅对此持慎重态度，还有的持反对态度，也就是基因治疗可能具有的潜在危险性。

3．基因治疗与社会伦理道德体细胞基因治疗是符合伦理道德的，但试图纠正生殖细胞遗传缺陷或通过遗传工程手段来改变正常人的遗传特征则是引起争议的领域。从历史上看，科学的发明创造对人类生存发展的影响极其深刻，故遗传学发展到今天，可以进行基因治疗，应该说是符合伦理道德的。重要的问题是取得社会的理解配合。首先是病人及其亲属的配合。因此，宣传基因治疗的科学性与安全性以及人类健康的重要性，以提高人们的认识，同时建立并完善医疗法制与措施也是必要的。

为安全计，在临床试验之前，必须在动物研究中达到三项基本要求：①外源的基因能导入靶细胞并维持足够长期有效；②该基因要以足够的水平在细胞中表达；③该基因应对细胞无害。

基因治疗

基因治疗的慨念

（一）基因治疗的定义

从基因角度可以理解为对缺陷的基因进行修复或将正常有功能的基因置换或增补缺陷基因的方法。若从治疗角度可以广义地说是一种基于导入遗传物质以改变患者细胞的基因表达从而达到治疗或预防疾病的目标的新措施。导入的基因可以是与缺陷基因相对应的有功能的同源基因或与缺陷基因无关的治疗基因。

基因治疗有两种形式，一种是改变体细胞的基因表达，即体细胞基因治疗（somatic gene therapy），另一种是改变生殖细胞的基因表达，即种系基因治疗（germline

gene therapy），从理论上讲，若对缺陷的生殖细胞进行矫正，不但当代可以得到根治，而且可以将正常的基因传给子代。但生殖的生物学极其复杂，且尚未清楚，一旦发生差错将给人类带来不可想象的后果，涉及一系列伦理学的问题，目前还不能用于人类。在现有的条件下，基因治疗仅限于体细胞，基因型的改变只限于某一类体细胞，其影响只限于某个体的当代。

（二）基因治疗的方式

基因治疗的方式（type of gene therapy）主要有3类，一类为基因矫正或置换，即对缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，或以正常基因原位置换异常基因，因此不涉及基因组的任何改变，目前尚无体内成功的报道。另一类为基因增补，不去除异常基因，而是通过外源基因的导入，使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能。再有一类为基因封闭，有些基因异常过度表达，如癌基因或病毒基因可导致疾病，可用反义核酸技术、核酶或诱饵（decoy）转录因子来封闭或消除这些有害基因的表达。除上述3大类外，近日发展其它多种形式，如导入病毒或细菌来源的所谓“自杀基因”或经过改造的条件性复制病毒，只能在p53缺陷的肿瘤细胞繁殖以达到溶解肿瘤细胞。

（三）导入的方式

导入基因有两种方式，一种是体外导入（ex vivo）,即在体外将基因导入细胞内，再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使这种带有外源基因的细胞在体内表达，从而达到治疗或预防的目的。被用于修饰的细胞可以是自体，同种异体或异种的体细胞。合适的细胞应易于从体内取出和回输，能在体外增殖，经得起体外实验操作，能够高效表达外源基因，且能在体内长期存活。目前常用的细胞有淋巴细胞、骨髓干细胞、内皮细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、肌细胞、角朊细胞（keratinocyte）、多种肿瘤细胞等。另一种是体内导入（in vivo），即将外源基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。

外源治疗基因

无论是ex vivo或in vivo导入基因的方式，首先要选择合适的能达到治疗或预防用的目的基因。如导入遗传疾病所缺陷的基因或增强机体免疫的细胞因子基因。目前用于临床试验的治疗基因主要为该基因的c

DNA。一些临床试验用的基因见表21-1

作为外源治疗基因的条件：基因的大小要根据所用载体（vector）能够运载的容量；若为分泌性产物需含信号肽序列；cDNA序列应正确无误；翻译时要求有起始密码子及终止密码子。

载体系统

要有效将治疗基因导入人体细胞内需要靠合适的运送基因的工具，即载体（vector），

载体有两类：一类为病毒载体（viral vector ）,另一类为非病毒载体（non-viral vector）

目前临床636个基因治疗方案所用的载体列于表21-2

目前临床试验用的载体仍然以病毒载体居多，占70%以上，而逆转录病毒载体约占所用全部载体的1/3。非病毒载体以脂质体居多，而裸质粒DNA的应用有逐渐上升的趋势。目前所用的载体尚不尽人意，有些是存在着安全性问题，有些则为效率不高等缺点。下面将讨论几类常用载体的构建极其优点。

（一）逆转录病毒载体

逆转录病毒载体的构建

逆转录病毒(retrovirus)属RNA病毒，通过其本身逆转录酶的作用，形成双链DNA原病毒,然后整合于宿主细胞染色体中, 详细的基因结构及生活史见第十三章。构建载体时以DNA 原病毒为基础，将野生型病毒的3类结构基因gag，pol和env删除，以供外源基因的插入，但是要保存病毒的包装序列（ψ）和双侧的长末端重复（LTR），LTR含有启动子、增强子、整合信号及poly

A信号等多种元件。插入的基因一般为两种或两种以上，一种为标记基因（marker gene）供阳性筛选，常用的为原核细胞的新霉素磷酸转移酶Ⅱ（NPT Ⅱ,neoR基因），该酶能破坏抗生素G418（新霉素的衍生物）的活性。哺乳动物细胞在含G418的培养液中不能生长，若含有neoR基因能产生NPT

Ⅱ，即能在含有G418的培养液中生长，故便于筛选转导基因的细胞。

另一种为供治疗用的基因，治疗基因和标记基因可识别受控于不同启动子，其中一种受逆转录病毒的LTR调控，另一种常需连接另外的启动子序列，或者连接一种称为内核糖体进入位点序列（IRES），使转录成一条多顺反子mRNA，在翻译过程中IRES具有内启动作用，能启动蛋白质的合成，所以同一分子mRNA能合成2种或2种以上不同的蛋白质。

如何包装成含有外源基因的逆转录病毒供治疗用的呢？因为载体本身的3类结构基因已被删除，因此包装所需的结构蛋白质，需要靠一种所谓的包装细胞，如PA317, 提供，这种细胞含有一种缺失包装信号的逆转录病毒，只能产生包装所需的结构蛋白质，但本身的病毒

RNA因缺失包装信号,所以不会被包装成病毒颗粒，这对治疗的安全性很重要，可避免产生有复制潜能的逆转录病毒（RCR）。将上述所构建的载体转染包装细胞PA317，可产生供治疗用的含有治疗基因的逆转录病毒颗粒，见图21-8，这种病毒能高效感染细胞，使治疗基因能够整合至细胞的染色体中，从而能长期表达基因产物，以达到治疗目的。

逆转录病毒载体的优缺点

最大的优点为能准确整合于宿主细胞的染色体中，所携带的外源目的基因及有关序列不会发生重排，因而能长期稳定表达。感染细胞范围较广，感染率比较高，由于结构基因均被删除，因此免疫原性较低。对感染细胞无毒性作用。可附加不同的调控元件来提高外源基因的表达效率，并对之进行调控。

局限性：逆转录病毒只能在核膜尚未形成时，才能进入核内，因此它只能将外源基因转移至增殖分裂的细胞，而对静止细胞转录效果不佳。由于该病毒基因本身不大，故能容纳外源基因的大小有限，应小于8kb。逆转录病毒稳定性较差，难耐受体外的操作，在纯化或浓缩过程常使其感染性降低。病毒颗粒能迅速被补体破坏。因为是随机整合，所以具有插入突变的危险，特别是病毒制剂中污染着RCR。

（二）其他病毒载体

腺病毒

感染人的腺病毒(adenovirus)有50余种血清型，能感染多种组织器官，产生类似感冒或类似流感症状，目前多数采用无致病性的5型及2型腺病毒作为载体。构建载体时ITR及包装信号应保存，其余的部分有些可删除，供外源基因的插入，插入片段的大小可达８kb。腺病毒载体较稳定，能耐受纯化浓缩等操作，可获得高滴度的病毒颗粒，感染宿主细胞范围较广，感染效率高，既能感染分裂相细胞，也能感染非分裂相细胞，但腺病毒不整合于宿主细胞染色体，故只能短暂表达外源基因，最大的缺点为引起机体的免疫反应和毒副作用。

腺相关病毒

属微小病毒科，不致病，为单链DNA约4.7 kb，腺相关病毒(adeno-associated virus)，作为载体最大的优点能感染分裂相和非分裂相细胞，并整合于宿主细胞染色体，能长期稳定表达，无不良反应，适合于一些遗传性疾病如甲型和乙型血友病的基因治疗。但腺相关病毒载体的制备因需要辅助病毒的参与，有污染的可能性。

其他

慢病毒（如HIV）、Ｉ型单纯性疱疹病毒、痘病毒和杆状病毒等都被研究发展作为转移基因的载体。

（三）脂质体

上述病毒载体最大的特点是能高效转移外源目的基因，但是也存在着许多的局限性，特别是

免疫原性强和可能造成细胞突变危险。因此发展非病毒载体倍受基因治疗研究者的注意。借助物理、化学方法或直接将外源基因导入宿主细胞内。

脂质体（liposome）主要是由天然磷脂和胆固醇类衍生物组成类似生物膜的脂质双分子层包围水相形成的闭合囊泡。

脂质体有两类：一类为阳离子脂质体，表面带正电荷，由于DNA带负电，因此借正电荷的作用，可以浓集和缩合DNA，形成脂质体DNA复合物（lipoplex）可携带的基因不受DNA 大小的限制，见图２１－9。目前基因治疗所用的脂质体都是阳离子脂质体。另一类为带负电脂质体，表面带负电，DNA或其他药物被包埋在内部水相中。

由于脂质体具有类似生物膜的性质，因此当脂质体DNA复合物与细胞膜接触后，通过胞吞作用（endocytosis）而进入胞内。

脂质体载体除上述介导外源基因转移不受大小限制外，最大的优点为无生物源性，无毒性，更安全可靠。但是转染效率很低，而且是短暂表达。

（四）裸DNA

裸DNA（naked DNA），即将外源基因构建于真核表达质粒，借助物理的或机械方法直接将其导入宿主组织细胞内。横纹肌和心肌摄取裸DNA的效率较高。若外源基因表达产物可激发机体免疫反应，以防治某些疾病，可称为DNA疫苗（DNA

vaccine），是一种非常有希望的新型疫苗。

直接注射裸DNA转染效率不高，常借助一些物理方法。

基因枪（gene gun），通过高压放电产生强烈的冲击波（shock wave），作用于被金包埋的DNA 微粒，使DNA微粒加速运动，即颗粒轰击（particle

bombardment）而穿透组织细胞，此法不但可用于体外转移基因，而且已用于临床将表达IL-12质粒导入浅表肿瘤组织。

矩形波电穿孔仪（square electroporator）这种仪器能产生低电压的矩形波，使细胞穿孔，让DNA进入，因为产生的仅是使细胞穿孔的矩形波，可避免一般电穿孔仪产生的高电压造成细胞损伤的缺点，电压的范围为5-500Ｖ，加压间隔为100毫秒-1秒。这种仪器可用于体外基因转移，也可用于体内组织器官的基因转移，据报道对肌肉组织的转移效率比直接注射DNA高２个数量级以上，是一种很有前景的基因转移方法。

基因治疗的临床试验

目前临床基因治疗试验的方案已达9百多个，受治疗的患者已有数千例

表21-3可见当前临床基因治疗（gene therapy）或广义地称基因转移（gene transfer）试验，有三种类型，即治疗性、基因标记及非治疗性试验。后者将腺病毒载体注射于健康自愿者的体内，观察机体对腺病毒载体的反应。这些方案的临床试验期（trial

phases）极大多数为Ｉ期临床试验，Ⅲ期者仅仅４个方案。说明基因治疗临床试验尚处于未成熟阶段。

（一）基因标记

目前常用的基因标记方法是将含neoR基因的重组逆转录病毒载体在体外转导细胞，然后回输至病人体内，可以很方便地跟踪这种标记细胞的命运，用来研究许多其他方法不能回答的体细胞移植的生物学问题。

美国第一个被批准基因标记的临床研究计划是NIH的Rosenberg等的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes, TIL）基因标记实验。他将恶性黑色素瘤组织或转移的淋巴结制成单细胞悬液，在IL-2的作用下淋巴细胞可成倍增殖而肿瘤细胞及其他类型细胞则死亡。这种TIL能特异杀伤肿瘤细胞。先在体外将含有neoR基因的逆转录病毒载体转导TIL，该载体能整合至TIL的基因组，故子代的TIL也含有neoR基因，能在含抗生素G418的培养液中生长，便于筛选；也可用PCR检测neoR基因是否存在，以跟踪回输体内的TIL的去处。

将这种基因修饰过的TIL注射于黑色素瘤患者，可以研究TIL在体内各组织器官、血循环细胞、淋巴结、肿瘤组织的分布情况；特别感兴趣的是观察TIL是否能靶向肿瘤组织；同时也可以研究TIL在体内存活期的长短；以及了解这种体外基因修饰过的TIL是否会自主生长和恶变？注射后对人体是否有害？这些问题的阐明可为基因治疗打基础。结果发现基因修饰过的TIL在体外不会自主增殖，说明没有恶变。在注射后的头3周，用PCR可测出外周血存在着含有neoR基因的单核细胞，有的长至60d尚可测出。在注射后3d活检的肿瘤组织也可测出有基因修饰过的TIL的存在。有人对其他细胞如骨髓细胞、肝细胞和细胞毒淋巴细胞等进行标记研究。

（二）单基因疾病

遗传性单基因疾病（monogenic diseases）是基因治疗的理想侯选对象，设计治疗方案时应考虑下列几点因素：⑴对造成该疾病有关的基因应有较详细的了解，并能在实验室克隆适合真核细胞表达的有关基因的cDNA序列，供转导用。⑵经有功能基因转导的体细胞，只要产生较少量原来缺少的基因产物就能矫正疾病。例如腺苷脱氨酶（ADA）缺乏的严重联合免疫缺陷（SCID），由于淋巴细胞缺乏ADA酶，造成腺苷及dA TP的堆积，可破坏免疫功能，患儿很少活至成年。若淋巴细胞ADA恢复至正常水平的5%～10%即能维持免疫系统的功能，对病人症状就有改善，这是第一个基因临床治疗的方案。血友病B，是由于凝血因子Ⅸ缺乏所致。现知只要因子Ⅸ水平达到正常的10%

～20%就能缓解严重的血友病。对血友病A而言，只要因子Ⅷ达正常水平的5%就能缓解症状，血友病已开始基因治疗临床试验。⑶即使导入基因过度表达，对机体应无不良作用。⑷有些遗传疾病是某些特殊细胞基因缺损造成的，但那有关的细胞不易取出供体外基因工程操作用。例如Parkinson症是脑黑质细胞（substantia

nigra）的酪氨酸羟化酶缺乏，不能产生多巴胺（dopamine），给病人注射多巴胺可减轻症状。动物模型试验表明，将酪胺酸羟化酶基因转导成纤维细胞，再移植至脑内，可以减轻动物模型的异常行为。⑸现在采用的以正常有功能的同源基因来增补体内的缺乏基因，因此要求增补的基因在病人寿命期间能稳定表达，或重复治疗，所以应考虑构建能长期持续稳定表达外

源基因的载体，并考虑将外源基因转导干细胞，如造血干细胞以望回输体内后其子代细胞也含有外源基因。

目前应用基因治疗的单基因疾病已有二十多种。

（三）恶性肿瘤

恶性肿瘤属复杂基因疾病(complex genetic diseases)，可能涉及多种基因的异常，发病过程是多步骤的，至今虽有不少有关的基因被鉴定，但肿瘤发病的分子机制尚未清楚，因此治疗时应选择何种靶基因不明确，多数是根据不同的环节，设计不同的治疗策略，目前临床恶性肿瘤的基因治疗策略有十余种之多。见表21-4。

免疫基因治疗(immunogene theray)

分体外转导和体内转导二种。体外转导将一些能刺激免疫反应的细胞因子基因，如

IL-2、IL-12、IFN-γ等转导肿瘤细胞作为基因工程“瘤苗”，给肿瘤患者注射，宗旨为提高肿瘤细胞的免疫原性，有利于被机体免疫系统识别及排斥；由于转导细胞因子基因的肿瘤细胞在体内能持续不断分泌细胞因子，能增强抗肿瘤的特异免疫和非特异免疫反应，在肿瘤局部形成一种较强的抗肿瘤免疫反应微环境，并能通过局部免疫反应，引发全身的抗肿瘤免疫机能，此策略已应用于多种恶性肿瘤的临床试验。本实验室研究了IL-2基因转导的人肝癌和胃癌细胞“瘤苗”，后者已被中国药物管理局批准用于临床研究。另一种策略是将细胞因子基因或MHC

I类基因直接体内注射于肿瘤局部，以促发抗肿瘤免疫反应。

自杀基因系统

自杀基因（suicide gene）来源于病毒、细菌或真菌，例如单纯性疱疹病毒的胸苷激酶（thymidine kinase,TK）基因，能将一种对哺乳动物无毒害的嘌呤核苷的类似物甘苷洛韦（gancilovir, GCV）转变成三磷酸形式，后者可掺入新合成的DNA链，造成DNA链的断裂和抑制DNA 聚合酶的活性，从而造成细胞死亡。所以将HSV-tk基因体内转导肿瘤细胞，然后再给患者服用GCV药物，肿瘤细胞表达TK基因能使无毒的GCV转变成有毒的三磷酸GCV，达到杀伤肿瘤细胞的目的。

抑癌基因(tumor suppressive gene)

抑癌基因p53的突变与多种肿瘤的发生有密切的关系。将野生型(正常)的p53转导

p53缺陷的恶性肿瘤，使其能表达正常的p53产物，后者具有强大的抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，从而达到抗肿瘤效果。

裂解肿瘤病毒（oncolytic virus）

利用基因工程改造过的腺病毒突变体，如EIB基因缺失的腺病毒能选择性在p53缺

陷的恶性肿瘤细胞中进行复制、繁殖，并最终杀伤肿瘤细胞。而正常细胞能表达p53，使这种病毒不能复制和繁殖。

（四）病毒性感染

目前病毒性感染主要治疗对象为人免疫缺陷病毒（HIV）感染的艾滋病，接受基因治疗的患者约4百余例。主要有二种治疗策略。

增强机体的抗HIV免疫反应

抑制HIV的复制

有人研究利用反义核酸来封闭HIV的基因，使mRNA不能翻译蛋白质，并发生降

解，或制备有关的核酶来破坏HIV的mRNA，使HIV不能复制繁殖，确切的疗效尚不能肯定，许多科学家尚在研究其他更有效的抑制HIV复制的方法。

（五）心血管疾病

目前心血管疾病中基因治疗最多的临床方案为外周血管疾病造成的下肢缺血，及心脏冠状动脉阻塞造成的心肌缺血。通过转移血管内皮细胞生长因子（VEGF）或成纤维细胞生长因子（FGF）或血小板衍生生长因子（PDGF）等基因于血管病疫部位，通过这些因子的表达，以促进新生血管的生成，从而建立侧肢循环，改善血供。

（六）问题及展望

基因治疗无疑是近30年来生命科学发展的一种结果。从理论上讲，若能将与疾病

发生有关的基因进行矫正或修复，应是一种有效的根治方法，可惜目前还不能达到此目的，这应是今后研究的一个重要方向。在这当中，其中最具有挑战性的问题是运送治疗基因的载体系统，理想载体应具备下列条件：安全无毒害；不引起免疫反应；高浓度或高滴度；能高效转移外源基因；持续有效表达外源基因；可靶向特定组织细胞；可调控；容纳外源基因可大可小；可供体内注射（包括全身性静脉注射）；便于规模生产供临床应用，可惜目前所应用的载体尚没有一个能符合上述全部的条件。这是今后努力研究的方向。