基因治疗

cap基因－－编码病毒结构组分 ITRs序列－－反向末端重复，定义基因的开始和 结束，制约DNA序列大小，包裹入 衣壳。
细胞对AVV病毒的亲和力高，AVV载体适用范围广泛。
3、选择靶细胞
选择原则: （禁止使用生殖细胞，只能用体细胞）
1、较坚固，耐受处理，易于由人体分离，便于输 回体内。 2、具有增殖优势，生命周期长，能存活几个月或几年， 至病人的整个生命。 3、易于受外源遗传物质的转化。 4、在选用病毒载体时，目的基因具表达最好具有组织特异 性的细胞
3、基因增补－－将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常 基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达 产物补偿缺陷基因的功能或使原有功能得以加强。
4、基因失活－－利用反义技术特异封闭基因表达，抑制有害基因 的表达。
5、免疫调节－－将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内， 改变病人免疫状态，达到预防和治疗的目的。
基因治疗只要 1 次给药, 蛋白表达量逐渐上升, 几乎恒定不变.
基因治疗研究历史回顾




60年代Lederberg设想基因治疗遗传病 1980年，美国Cline 主持了β－地中海贫血的基因治疗, 引 发社会风波 1980-1989年, 美国 Anderson 为首的科学家争取社会和政 府的支持理解，FDA和RAC制定了基因治疗审批管理方案 1989年 美国Rosenberg 经FDA批准主持肿瘤患者标志基 因转移临床试验. 1990年, 美国 Culver/Blease 主持世界首例ADA缺乏症基 因治疗临床试验.
逆转录病毒
宿主细胞
RT
cDNA 病毒RNA 双链 插入 基因组 DNA
病毒RNA
RT
逆转录酶
逆转录病毒感染过程
逆转录病毒生活周期:
1、感染靶细胞 2、利用自身编码的逆反转录酶，以RNA为模板合成DNA。 3、将病毒DNA转运至宿主细胞核 4、病毒DNA整合到宿主染色体 5、以病毒DNA为模板转录RNA 6、在细胞中翻译Gag、Pol和Env蛋白 7、形成衣壳，RNA单链和反转录酶一起包装进衣壳。 8、形成病毒颗粒并分泌到胞外。
2、肌肉专一性表达：肌苷激酶的调控片段 3、乳腺专一性表达： β酪蛋白，乳清酸蛋白 4、黑色素专一性表达: 酪氨酸和酪氨酸相关蛋白（TRP) 5、胶质瘤专一性表达：鞘磷酸碱性蛋白基因上游片段 6、肺癌专一性表达： 人表面活性蛋白A
呈待解决的问题：
外源基因表达效率
外源基因表达调控
遗传性疾病面临的免疫问题 反转录病毒载体随机插入的外源基因，若
外源基因表达及检测
1、选择治疗的目的基因
治疗基因的来源：
1、野生型基因： -----单基因缺陷遗传病基因 -----反义核酸封闭活化的原癌基因 -----转入相关的抑癌基因，抑制肿瘤 2、重组DNA和分子克隆技术，人工合成特异 基因。
用于基因治疗的基因应满足以下条件：
（1）体内仅少量表达就可显著改善症状。 （2）该基因的过量表达不会对机体造成危害、
骨髓细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、肌细胞
常用细胞：
1、骨髓细胞：最被重视和常用的靶细胞。
优点：⑴易接受各种处理、⑵已积累丰富经验，⑶多数遗传疾病 涉及骨髓细胞、⑷源自骨髓的细胞遍布全身。 缺点： -骨髓干细胞含量少（占骨髓细胞0.1%） -治疗基因在核骨髓细胞表达时间短（几个月）。 -只有部分干细胞有活性 -造血干细胞分化可能导致基因失活。 -有些遗传疾病与骨髓干细胞无关。
基因治疗- 新的医学革命
与传统治疗区别:

基因治疗的特异性: 针对性强;

药物本质为DNA; DNA在人体细胞体内表
达成为蛋白质;

基因治疗作用的持续性.
图 1
普通药物治疗药物动力学曲线
药物需要不断给予,才能维持有效浓度, ,药物浓度不断变化,或无效,或生副作用.
图 2. 基因治疗药物动力学曲线
（3）在抗病毒和抗病原体的基因治疗中，所选 择的靶基因应在病毒和病原体的生活史中 起重要作用，并且该序列是特异的。
2、选择基因载体：
理想的载体具有以下特征：
1、容易生产--- 商业化生产，广泛应用，易运输，易保存 2、持续表达--- 一旦转入体内，应能在一定时间内持续表达基因产 物，或能通过某种方法精细调节其表达。 3、弱免疫源--- 转入后不应引起免疫反应。 4、组织靶向性--- 定向输入某种细胞。 5、包装容量载体对转染基因的大小应没有限制。 6、复制、分裂和整合能力：特异性定位整合，或以游离基因形式 存在于细胞核内。 7、能感染分裂期细胞和未分裂期细胞
基因载体：
非病毒载体 （裸DNA、脂质体）
分类：
优点： 大量生产，毒性小，低免疫性 缺点：效率低。
病毒载体 （反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒）
优点：多数病毒可感染特异细胞，不易降解， RNA病毒能整合到宿主染色体，表达 水平高等。
病毒介导的基因转移
1、逆转录病毒：正链RNA病毒
LTR ψ
基因组组成：
6、调节性基因治疗： 导入编码调控蛋白的基因，治疗 基因表答异常的疾病 7、化疗保护性基因治疗： 导入单相或多相细胞毒性药 物的抗性基因，使正常细胞耐受化疗药物的能力大 大提高。
8、特异性细胞杀伤性基因治疗：利用DNA重组技术构建 特异性杀伤靶细胞为目标的“奇异弹头”，“弹头”部分是 分子重组的各种生物细胞毒素，它们以酶催化方式发挥 抑制蛋白合成作用，造成细胞杀伤。 9、生殖细胞基因治疗：生殖细胞或胚胎干细胞补偿性治疗
插入不当，可能破坏另一个基因的表达或 激活其它基因（潜在的危险）。
基因治疗首个成功案例

在20世纪八十年代末期，美国国家卫生研究院的安德生（French Anderson）、布利兹 （Michael Blaese）与罗森堡（Steven Rosenberg）等人共同提出了基因治疗的临床试验 申请，治疗的对象是一种罕见的遗传疾病──严重复合性免疫缺陷症。
构建逆转录病毒载体：
（1）构建重组野生性病毒：插
入相关外源基因，改造成 DNA载体（包括插入选择性 标记），替代病毒的编码基 因。 （2）制备辅助细胞（293T细 胞），为载体DNA提供其丧 失的功能。 （3）载体DNA导入辅助细胞， 产生病毒载体。 （4）用病毒载体感染细胞，外 源基因在宿主细胞中表达。
转染细胞后的筛选：
方法：
1、标记基因筛选法： 2、基因缺陷型受体细胞的选择性 3、基因共转染技术
4、分子生物学方法:
原位杂交 Southern杂交 斑点杂交
目的基因或 标记基因作 为探针。
5、外源基因表达的检测：
方法： （目的基因和标记基因的表达）
原位杂交、 Nouthern杂交、 RNA点杂交（检测mRNA的转录）、
人体取出的缺 陷T淋巴细胞 改造后的正 常T细胞
人体
反转录病毒改造 的ADA基因
世界上第一例基因治疗病例



人类历史上第一例基因治疗方案应用于一患腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症的4岁 女孩Ahsanti DeSilva。ADA 缺陷将导致T淋巴细胞和B淋巴细胞发育受阻，病人 发生重症联合免疫缺陷。 患儿血细胞中的单个核细胞在体外进行培养增殖并用携带ADA基因的逆转录病毒 转染，数日后将细胞输回患儿体内。在10个半月中，患者注入10亿个遗传修饰 的T淋巴细胞, 约每月1次, 连续1年, ADA水平从1%上升到20%, 淋巴细胞数量正 常, 免疫功能正常患儿共接受了7次携带ADA基因的逆转录病毒转染的自体细胞 输注，免疫功能增强，临床症状改善。 单个核细胞群中ADA含量的PCR分析表明，在血液中约有相当于正常人的20%~25% 的ADA基因转染细胞。患儿基因治疗生效后较少发生感染，且未见由细胞输注和 ADA基因转移自身带来的副作用。
LTR（long terminal repeat）即长末端重复序列，其长度从 100bp到5kb不等。是存在于LTR反转录转座子（LTRs）两 侧翼的长末端重复序列。LTR反转录转座子和非LTR反转录 转座子都是真核生物中一类可移动因子，因其转座需经由 RNA介导的反转录过程而得名。LTR反转录转座子一高拷贝 在生物界广泛分布，可以通过纵向和横向分别在世代之间和 不种间进行传递，同一家族的反转录转座子具有高度的异质 性。反转录转座子在一些生物和非生物的逆境条件下可以被 激活。利用LTR的特点，基于LTR的分子标记相继发展起来。 并且在引物开发、基因作图、生物遗传多样性和系统进化、 品种鉴定等方面具有广泛的应用前景。
基因治疗基本程 序;
方法： 1、体外法
将受体细胞在体外培养，转入外源基因，经 适当选择系统，将重组的受体细 胞回输患者 体内，以改善症状。（普遍采用）
直接将外源基因导入体内有关的组织器官,使其 进入相应的细胞并转录、表达而发挥治疗作用。
2、体内法
基本程序： 选择目的基因
基因转移
选择基因载体
选择靶细胞 回输体内
这次治疗也由此成为 世界基因疗法 历史上标志性的事件， 并由此拉开了基因疗法 研究和开发的序幕， 基因疗法也从此点燃了 人类战胜疾病的新希望。
基因治疗成功范例(II)

血友病B基因治疗: 血友病是一种由于人凝血因子缺陷导致的遗传 性出血疾病. 1991年, 复旦大学遗传学研究所采用反转录病毒介导 的自体皮肤成纤维细胞对2例血友病B患者进行了世界首次血友病 基因治疗临床试验, 患者体内凝血因子浓度和活性上升, 出血症状 减轻, 取得了安全有限的结果. 1999年美国UP和Avigen 公司合作 采用AAV途径进行了血友病B基因治疗, 患者治疗后出血症状显著 改善.
逆转录病毒载体的缺陷：
1、只能转染处于增殖状态的细胞 2、所携带的外源基因不能太大。 3、感染依赖靶细胞表面受体的限制 4、理论上不扩散其它细胞，但某些情况会造成 野生型病毒爆发。 5、有致细胞癌变的可能。 6、逆转录病毒不能耐受纯化和浓缩过程。