百里醌抑制体外骨肉瘤细胞转移的实验研究

百里醌抑制体外骨肉瘤细胞转移的实验研究目的：探讨百里醌抑制体外骨肉瘤细胞转移的作用及其机制。

方法：本研究应用不同浓度百里醌作用人骨肉瘤SaOS-2细胞后，观察百里醌对体外骨肉瘤SaOS-2细胞迁移和侵袭的作用；Western blotting检测骨肉瘤细胞中MMP-2和MMP-9表达的变化。

结果：百里醌可呈浓度依赖性抑制体外人骨肉瘤骨肉瘤SaOS-2细胞迁移和侵袭，同时百里醌可下调骨肉瘤SaOS-2细胞中MMP-2和MMP-9的表达。

结论：百里醌可抑制体外骨肉瘤细胞转移，该作用可能通过下调MMP-2和MMP-9的表达而实现。

百里醌（Oridonin）是从唇形科（Labtea）香茶菜属（Rabdosia）植物中分离出的一种贝壳杉烯二萜类（ent-kaurene diterpenoid）天然有机化合物，目前研究结果表明，百里醌能够抑制如前列腺癌、宫颈癌、肝癌和肺癌等多种肿瘤细胞增殖，并对细胞转移有一定抑制作用[1-6]。

但目前尚未有百里醌对骨肉瘤转移的抑制作用的研究报道，为此本研究将观察百里醌对体外人骨肉瘤细胞转移的作用，并初步探讨其可能机制。

1 材料与方法1.1 主要药品和试剂胰酶、胎牛血清和RPMI-1640培养基购自美国Gibco 公司；MMP-2、MMP-9和β-actin抗体购自美国Epitomics公司；Transwell小室购自美国Corning公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒和结晶紫染色试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司；人工重组基底膜（matrigel）和百里醌购自美国Sigma 公司，百里醌用含30%DMSO的灭菌三蒸水配成5 mmol/L母液，置-20 ℃保存，应用时加RPMI-1640培养基稀释成目标浓度（DMSO的终浓度<0.1%，该浓度对细胞无明显毒副作用。

1.2 细胞株及细胞培养人骨肉瘤细胞株SaOS-2购自ATCC，培养在含l0%胎牛血清、质量浓度1×105 U/L青霉素和100 mg/L链霉素、2 mmol/L谷氨酰胺和1.5 g/L碳酸氢钠的RPMI-1640培养液中，置于37 ℃、5%的CO2的培养箱内培养，2～3 d换液1次，细胞单层贴壁生长至70%～80%融合时胰蛋白酶消化传代。

1.3 细胞迁移实验将对数生长期的SaOS-2细胞制成单细胞悬液，不同浓度百里醌（10、20、40 μmol/L）作用2 h后，在培养皿上用200 μL枪头小心刮出2 mm×2 cm 刮痕，经PBS冲洗2次，在显微镜下见刮痕内无细胞残留后放置培养箱继续培养24 h，置于倒置显微镜下观察细胞划痕并计算各组细胞的划痕修复率，实验重复3次，取平均值。

划痕修复率（%）=[（0 h划痕宽度-24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度]×100%。

1.4 细胞侵袭实验不同浓度百里醌（10、20、40 μmol/L）作用骨肉瘤细胞2 h后，用无血清RPMI-1640培养基将细胞制成单细胞悬液，取1×104个细胞置于Transwell小室的上室，下层加500 μL含20%胎牛血清的培养基，放置细胞培养箱中培养24 h后取出滤膜，用棉签小心擦去小室内膜上未穿过膜的细胞，细胞固定后用结晶紫染色，置于倒置显微镜下观察染色后的细胞并计数，随机计数20个视野，计算平均值。

1.5 Western印迹检测细胞中MMP-2和MMP-9的表达裂解细胞并分离细胞蛋白质，用Bradford法测量蛋白浓度后取等量蛋白质样品（20 μg/孔），常规8% SDS-PAGE电泳，半干转膜仪转膜，5%脱脂奶粉封闭，加入特异性一抗（1∶1000）于4 ℃下孵育过夜，HRP标记的羊抗兔IgG为第二抗体（1∶2500）室温孵育1 h，ECL显色，条带曝光强度用Quantity One 4.6.2（BIO，RAD）软件分析，以β-actin为内参，通过与内参的灰度比得出目的条带的相对表达水平。

1.6 统计学处理采用SPSS 11.0软件包进行统计学处理，计量资料用（x±s）表示，正态分布变量多组间比较用方差分析，两组间比较用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果2.1 百里醌对体外骨肉瘤细胞迁移的作用百里醌可呈浓度依赖性显著抑制SaOS-2细胞迁移（图1）。

百里醌（10、20、40 μmol/L）作用SaOS-2细胞2 h 后，细胞划痕修复率分别为（65.42±7.82）%、（52.66±6.37）%和（40.95±5.37）%，与对照组的（86.05±8.34）%相比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 百里醌对体外骨肉瘤细胞侵袭的作用百里醌可呈浓度依赖性抑制体外骨肉瘤SaOS-2细胞侵袭（图2）。

百里醌（10、20、40 μmol/L）处理SaOS-2细胞 2 h后每高倍镜（×200）下侵袭细胞数分别为（21.5±3.8）、（22.9±2.8）和（17.5±3.1），与对照组的（45.4±5.7）相比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

为验证百里醌对SaOS-2细胞迁移和侵袭的作用并非由于百里醌的细胞增殖抑制作用所造成，预实验表明，高浓度百里醌（40 μmol/L）作用SaOS-2细胞2 h后对SaOS-2细胞增殖无明显抑制作用。

2.3 百里醌对SaOS-2细胞中MMP-2和MMP-9表达的影响如图3所示，不同浓度百里醌（10、20、40 μmol/L）作用SaOS-2细胞48 h后，Western印迹表明，相对较低浓度（10 μmol/L）的百里醌对SaOS-2细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达无明显影响，但高浓度（20～40 μmol/L）的百里醌作用SaOS-2细胞后，细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平开始下调，以40 μmol/L百里醌作用后对MMP-2和MMP-9蛋白表达下调效应最显著。

3 讨论在本研究中，为检验百里醌对体外骨肉瘤细胞转移的抑制作用，笔者采用划痕试验和Transwell小室试验模拟骨肉瘤细胞体外转移过程，结果表明在本次实验浓度和实验时间下的百里醌未表现出对骨肉瘤SaOS-2细胞明显的增值抑制作用，与文献[7]报道相符，同时在该浓度和作用时间内百里醌可明显抑制SaOS-2细胞的体外迁移运动和侵袭行为，从而首次在体外实验中验证了百里醌抗骨肉瘤细胞转移的效应，表明百里醌作为一种低毒高效的肿瘤转移抑制剂应用于骨肉瘤治疗的巨大前景。

肿瘤转移是一个十分复杂的动态连续的过程，三步骤学说是当前肿瘤转移的权威学说[8-11]，三步骤包括如下，（1）分离：肿瘤细胞之间黏附能力下降，肿瘤细胞开始脱离原发灶；（2）降解：肿瘤细胞开始分泌水解酶，从而降解细胞外基质（ECM）成分以及基底膜中的蛋白成分；（3）移动：癌细胞通过水解基底膜后形成的组织间隙从而向周围组织浸润甚至进入淋巴管和/或血管，最终实现远处转移。

在肿瘤转移的过程中，细胞穿过细胞外基质从而实现肿瘤细胞侵袭是肿瘤转移过程中最重要的环节，而基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是在细胞侵袭和远处转移等多种恶性生物学行为中发挥了关键作用，MMP-2和MMP-9作为MMPs家族中最重要的成员，在正常生理条件下，MMP-2和MMP-9蛋白能够降解细胞外基质成分，调节细胞间黏附，同时MMP-2和MMP-9蛋白还可作用于细胞外成分或其他蛋白成分而启动其潜在生物学功能，并直接或间接参与胚胎发育、组织模型再塑及创伤修复等正常生理功能。

在病理情况下，MMP-2和MMP-9蛋白可破坏基底膜成分和降解细胞外基质中胶原成分，使得肿瘤细胞突破原发部位正常基底膜而发生侵袭和转移[12-15]。

MMP-2和MMP-9在肿瘤细胞中过度表达并分解细胞外基质，使肿瘤细胞向深层组织浸润并突破血管和淋巴管而进入相应管腔中，造成恶性肿瘤的血行和淋巴转移，同时MMP-2和MMP-9蛋白还可以调控血管内皮生长因子（VEGF），从而在促进血管生成中发挥了一定作用。

因此，抑制MMP-2和MMP-9的表达能有效抑制恶性肿瘤转移。

在本研究中，百里醌可抑制MMP-2和MMP-9蛋白在体外SaOS-2细胞中表达，同时百里醌对体外SaOS-2细胞迁移和侵袭有显著的抑制作用，从而提示百里醌可能部分通过抑制MMP-2和MMP-9的表达从而抑制SaOS-2细胞转移。

总之，本次实验结果表明百里醌可显著抑制体外SaOS-2细胞转移，同时百里醌还可以抑制MMP-2和MMP-9蛋白在SaOS-2细胞中的表达。

因此，笔者推断百里醌可能通过抑制MMP-2和MMP-9从而抑制体外SaOS-2细胞转移，但还需大量工作研究百里醌抑制SaOS-2细胞转移的更多机制。

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