蛋白消化流程

有还原烷基化蛋白质消化操作流程

1.将所选择的胶点用1.5mm切胶笔切下，置于eppendorf (EP) 管或96孔PCR板

中,并记录点号及相应的位置；

2.加50μL DD.H2O 洗两次，10min/次；

3.加50 mM NH4HCO3/乙腈=1：1溶液(考染脱色液)50μL，超声脱色5min或37℃

脱色20min，吸干；(若为银染, 一般不需要脱色; 若必须脱色,使用15mM K3Fe(CN)6/50mM Na2S2O3 , 轻摇直到变为淡黄色透明,再用水反复洗至无色)

4.重复步骤3，直至蓝色褪去；

5.加乙腈50μL脱水至胶粒完全变白，真空抽干10min；

6.加10 mM DTT（10μL 1M DTT，990μL 25mM NH4HCO3配制） 20μL，56℃

水浴1hr；

7.冷却到室温后，吸干，快速加55 mM IAM （55μL 1M IAM，945μL 25mM

NH4HCO3配制）20μL，置于暗室45min；

8.依次用25 mM NH4HCO3 ( 2X10分钟)、25 mM NH4HCO3 +50％乙腈溶液( 2X10

分钟)和乙腈洗(10分钟)，乙腈脱水到胶粒完全变白为止，真空抽干10min；

9.将0.1μg/μL的酶储液以25 mM NH4HCO3稀释10~20倍，每EP管加2~3μL，

稍微离心一下，让酶液充分与胶粒接触，4℃或冰上放置30min，待溶液被胶块完全吸收，加25mM NH4HCO3 至总体积10-15μL置37℃，消化过夜；

10.加入甲酸终止反应，使甲酸终浓度为0.2％，振荡混匀，离心。

说明:

1.每加一次溶液都要漩涡振荡，胶粒要完全浸没在溶液中，进行下一步操作前要把溶液吸走。

2．如果胶粒超过1.5mm3,把胶粒分成约为1.5mm3大小再进行脱色，使用的各种溶液的量也相应增加。

3．实验过程中一定要注意使用的溶液和器具的洁净，防止角蛋白污染，并带

口罩和帽子。

4．银染蛋白质点胶内消化不要脱色，步骤3、4省略。

5. 所有在洁净台外的操作必须用封口膜密封好96孔板, 尽量避免蛋白质点和相关溶液与外界空气接触, 避免可能造成的污染.

全蛋白溶液消化操作规程

一、 试剂：

1．变性缓冲液：6M Guanidine-HCl，50mM Tris-HCl,(pH8.0)或6-8M 尿素，50mM Tris-HCl,(pH8.0)

2．1M DTT

3．1M IAM

4．50mM NH4HCO3(pH7.8)

5．Trypsin酶

二、 操作步骤：

1．将蛋白溶解于6M Guanidine-HCl或6-8M 尿素或0.1% SDS, 50mM Tris-HCl,(pH8.0);

2．往溶液中加入1M DTT至终浓度2-5mM;

3．95℃加热15-20min或者60℃加热45-60min，冷却至室温；

4．加入1M IAM至终浓度10-25mM，室温暗处孵育45min；

5．加入50mM NH4HCO3(pH7.8)稀释Guanidine-HCl或尿素至终浓度不超过1M；

6．按Trypsin酶与底物蛋白的量之比在1：20-1：100之间，加入酶液，37℃孵育8-12Hr;

7．再次加入同等剂量的Trypsin酶溶液，室温孵育24Hr；

8．浓缩样品到合适的体积。

三、 注意事项：

样品中避免存在以下常见的胰蛋白酶抑制剂

Antipain (50μg/ml), antithrombin (1unit/ml), APMSF (0.01–0.04mg/ml),

aprotinin(0.06–2μg/ml), leupeptin (0.5μg/ml), PMSF (17–170μg/ml), TLCK

(37–50μg/ml) trypsin inhibitors (10–100μg/ml).