外显子组测序
全外显子组测序的具体方法及步骤
全外显子组测序的具体方法及步骤
全外显子组测序（Whole Exome Sequencing，WES）是指利用序列捕获或者靶向技术将全基因组外显子区域DNA 富集后再进行高通量测序的基因组分析方法。
与全基因组重测序相比，全外显子组测序只需针对外显子区域的基因序列测序，覆盖度更深、数据准确性更高，更加简便、经济、高效。
技术优势
高性价，强分析，快速交付
外显子组测序主要用于识别和研究与疾病相关的编码区的基因组变异。
结合大量的公共数据库提供的外显子数据和正常人群数据库, 有利于更好地排除无害突变及解释变异信息之间的关联和致病机理。
技术路线
技术参数
样本要求。
wes全外显子测序原理
wes全外显子测序原理WES（全外显子组测序）是一种高通量测序技术，可以高效地检测人类基因组中的所有编码蛋白质的外显子区域。
WES的基本原理是使用特定的引物（半万通量、数百个碱基对）引导DNA聚合酶在DNA模板上扩增外显子区域，并将扩增片段测序获取DNA序列信息。
WES使用两个主要的步骤：DNA片段化和文库制备、测序和数据分析。
DNA片段化是WES过程中的第一步。
在这个步骤中，科学家将DNA切割成小片段，以便将其放入文库中。
这些DNA片段通常是相对较小（100-300bp）的，这样可以提高测序的覆盖率和可靠性。
在该步骤中，使用不同的酶切割，例如剪刀酶，谷氨酰胺酰化酶等。
文库制备、测序和数据分析是WES过程的第二步。
在这个步骤中，科学家将切割好的DNA片段与引物匹配，每个引物匹配一个外显子。
一些引物刻意设计为靠近外显子边缘，以提高捕获的精密度和覆盖率，使测序产生的数据内容更为丰富。
在测序过程中，DNA片段经过PCR扩增和链分析，得到大量的读取长度为50nt-300nt的测序数据。
随后，这些测序数据经过对比分析，人们可以重建出原始DNA的序列，从而识别具体基因并分析其序列。
数据分析可以使用各种软件和工具进行。
相对于基因组测序，WES具有一些优势。
首先，外显子仅占人类基因组的1%-2%，相对于基因组，WES测序时间相对较短。
其次，外显子通常比内含子更加功能性，这些区域通常是与特定疾病相关的。
WES可以检测的区域是与人类疾病之间的关联更加密切。
最后，WES通常是更经济和有效的，因为需要处理的DNA量较小。
但是，WES方法也有一些限制。
首先，WES仅限于已知的外显子和靶区域，对于一些变异位于外显子间区域或非编码序列区域，他们将无法被检测到。
其次，WES在检测某些类型的变异时，如重复序列的扩增，G-富集区域和GC含量高的区域时可能不是非常敏感。
最后，由于WES是针对外显子进行测序的，不能覆盖整个基因。
在一些研究中，必要时，研究人员需要选择其他技术或方法来检测某些特定的基因区域。
全外显子测序检验的临床意义与样本要求
全外显子测序检验的临床意义与样本要求在当今医学领域，全外显子测序检验正逐渐成为临床诊断和治疗中不可或缺的重要工具。
全外显子测序是一种高通量的基因组测序技术，能够对所有外显子区域进行全面的检测和分析，从而帮助医生发现患者潜在的遗传变异和突变，为疾病的诊断和治疗提供更精准的信息。
针对全外显子测序检验的临床意义和样本要求，本文将从多个角度进行探讨，并共享个人观点和理解。
一、全外显子测序检验的临床意义1. 诊断和治疗指导：全外显子测序能够为医生提供全面的遗传变异信息，帮助精准诊断疾病类型和确定治疗方案。
尤其对于罕见遗传病、癌症等复杂疾病的诊断和治疗指导具有重要意义。
2. 遗传沟通和家族风险评估：通过全外显子测序检验，可以帮助患者进行遗传沟通，评估患病风险，并为家族成员提供相关遗传信息，帮助他们进行风险评估和健康管理。
3. 个性化医学：全外显子测序检验为个性化医学提供了重要的基础数据，可以根据个体的基因组信息，制定个性化的预防、诊断和治疗方案，实现精准医疗。
二、全外显子测序检验的样本要求1. 样本类型：全外显子测序通常需要采集患者的血液样本，获取其中的DNA进行测序分析。
对于一些特定疾病或研究项目，还可能需要获取肿瘤组织样本等特定样本。
2. 样本质量：样本的质量直接影响着全外显子测序的准确性和可靠性。
在采集和保存样本时，需要注意避免血液凝块和样本污染等情况，保证样本的纯度和完整性。
3. 样本数量：通常情况下，全外显子测序需要一定数量的DNA样本才能进行测序分析。
对于不同的实验项目和测序评台，样本数量的要求可能会有所不同，需要根据具体情况进行调整。
三、个人观点和理解全外显子测序作为一种新型的基因组测序技术，对于临床诊断和治疗具有重要意义。
通过对个体基因组的全面检测，我们能够更好地了解疾病的遗传基础，为精准医学提供数据支持。
然而，在进行全外显子测序检验时，我们也需要考虑样本的要求和质量，以确保测序结果的准确性和可靠性。
外显子测序原理
外显子测序原理
外显子测序是一种基因组测序技术，它的原理是通过对DNA中编码蛋白质的外显子区域进行测序，来揭示个体基因组的遗传信息。
外显子是基因组中编码蛋白质的部分，相对于整个基因组来说，外显子只占据了很小的比例，但却包含了大部分人类疾病相关的变异。
外显子测序的原理主要包括以下几个步骤，DNA提取、文库构建、高通量测序和数据分析。
首先，从样本中提取DNA，然后将DNA片段通过特定的方法构建成文库，接着进行高通量测序，获取大量的DNA序列信息。
最后，利用生物信息学分析软件对测序数据进行分析，鉴定外显子区域的变异信息。
在DNA提取过程中，需要保证提取的DNA质量和纯度，以确保后续测序的准确性和可靠性。
文库构建是将DNA片段连接到载体上，形成文库，这一步骤的关键是要避免DNA片段丢失或错位。
高通量测序是通过高通量测序技术对文库中的DNA片段进行大规模并行测序，产生海量的DNA序列数据。
数据分析是将测序得到的原始数据进行质控、比对、变异检测等一系列生物信息学分析过程，最终得到外显子区域的变异信息。
外显子测序技术的应用非常广泛，它可以用于研究人类疾病的发病机制、遗传变异的关联分析、药物靶点的筛选等领域。
通过对外显子的测序，可以发现与疾病相关的致病基因突变，为疾病的早期诊断和个体化治疗提供重要的依据。
同时，外显子测序也可以用于研究种群遗传结构、演化过程和基因型-表型关联等基因组学研究领域。
总的来说，外显子测序技术以其高通量、高效率、高准确性的特点，成为了当前研究基因组学和临床遗传学的重要工具。
随着测序技术的不断发展和成熟，外显子测序的应用前景将会更加广阔，为人类健康和疾病治疗带来更多的机遇和挑战。
外显子组测序技术
外显子组测序技术一、前言外显子组测序技术是一种高通量测序技术，它可以通过对人类基因组的外显子进行测序，来寻找与疾病相关的基因变异。
本文将详细介绍外显子组测序技术的原理、方法和应用。
二、原理外显子组测序技术是一种全基因组测序的变体，它只对基因组中编码蛋白质的区域（即外显子）进行测序。
这种技术可以检测到与疾病相关的单核苷酸多态性（SNP）、插入/缺失（indel）和结构变异等多种类型的突变。
三、方法1. 样品准备首先需要从患者或正常人身上提取DNA样品，并将其分离成片段。
然后使用特定的酶来切割这些片段，使其只包含编码蛋白质的区域。
2. 库制备接下来需要将这些片段连接到适当大小的DNA片段上，并添加适当的标签以便于后续处理。
这个过程称为库制备。
3. 测序完成库制备之后，需要进行高通量测序。
当前可用于外显子组测序的技术包括Illumina、Ion Torrent和Pacific Biosciences等。
4. 数据分析测序完成后，需要对数据进行处理和分析。
这个过程可以使用各种软件来完成，例如BWA、GATK和SAMtools等。
四、应用外显子组测序技术已经被广泛应用于疾病研究和临床诊断。
例如，在肿瘤学中，它可以检测到肿瘤细胞中的突变，并帮助医生选择最佳的治疗方案。
此外，它还可以用于遗传性疾病的诊断和预测。
五、优缺点1. 优点外显子组测序技术具有高通量、高灵敏度和高特异性等优点。
它可以检测到多种类型的基因变异，并且可以同时对多个样品进行分析。
2. 缺点外显子组测序技术的主要缺点是成本较高，并且需要较长的数据处理时间。
此外，由于只对编码蛋白质区域进行测序，因此无法检测到与非编码RNA相关的突变。
六、总结外显子组测序技术是一种重要的高通量测序技术，它可以用于疾病研究和临床诊断。
虽然它有一些缺点，但随着技术的不断发展，相信它将在未来得到更广泛的应用。
外显子测序 生物学重复-概述说明以及解释
外显子测序生物学重复-概述说明以及解释1.引言1.1 概述外显子测序（exome sequencing）是一种基于高通量测序技术的生物学研究方法，其目的是对生物体中的外显子区域进行快速、准确地测序和分析。
外显子是基因组中编码蛋白质的片段，它们占据了整个基因组的仅0.5至1.5的区域，但却承载着80以上的已知致病突变。
因此，外显子测序被广泛应用于寻找蛋白质编码基因的突变，以及与遗传性疾病、肿瘤和其他复杂疾病相关的致病突变的鉴定和研究。
外显子测序的基本原理是使用高通量测序技术对DNA样本进行测序，然后利用生物信息学方法将测序结果与参考基因组进行比对和分析，从而确定样本中外显子的序列和存在突变的位置。
与全基因组测序相比，外显子测序具有较低的成本和更高的效率，因为外显子相对较小且具有较高的功能重要性，可以更准确地筛选和鉴定潜在致病突变。
外显子测序在生物学研究中的应用广泛而重要。
它不仅可以用于研究人类遗传性疾病和肿瘤突变，还可应用于农业、畜牧业和其他生物领域的基因组学研究。
通过对不同个体的外显子进行测序，我们可以了解个体间的遗传差异、突变积累和遗传进化规律，为人类进化和适应性研究提供重要依据。
然而，外显子测序也面临一些挑战。
首先，由于外显子区域相对较小，它只能提供关于外显子的信息，对非编码区域的突变鉴定有限。
其次，外显子测序在处理复杂疾病和疾病相关基因组变异时可能会遇到困难，因为这些变异可能位于基因的调控区域或与功能相关的非编码RNA中。
此外，外显子测序对测序深度和准确性要求较高，因此需要高质量的测序平台和数据分析方法的支持。
总之，外显子测序作为一种高效、准确的测序技术，在生物学研究和临床诊断中发挥着重要作用。
随着技术的不断发展和应用的不断扩大，外显子测序将为我们揭示生物体的基因组变异与功能之间的关系，为疾病的早期诊断和个性化治疗提供更多可能性。
同时，对于生物学重复的研究也为我们提供了全新的视角和理解，有助于揭示生命的奥秘和进化的规律。
全外显子组测序常见问题（上）
全外显⼦组测序常见问题（上）1全外显⼦组测序必须要有参考基因组吗？必须有，如果没有参考因组，要提供近缘物种的序列，但不能保证捕获结果的可靠性。
因为捕获探针是根据提供的参考序列来设计的，如果已知⽬标区域与参考基因组⽐有较⼤出⼊，例如⼤⽚段的插⼊缺失，是不推荐的。
2为什么外显⼦测序在分析时需要跟全基因组⽐对，⽽不是直接与⽬标区域⽐对？第⼀，⽬标区域相对于全基因组⼀般较短，⽽且可能不连续，如果将⽬标区域单独提取出来，会影响区域边缘的序列⽐对效果；第⼆，⽆法评估捕获质量，例如脱靶率、on target⽐例等。
3全外显⼦组测序⼀般建议做多少倍的覆盖？⼀般做100×或150×。
较⾼的覆盖倍数，对于测异质性的遗传变质，可以发现⼩⽐例的突变。
另外，外显⼦测序的覆盖是随机的，这样较⾼的平均覆盖率有利于保证⼤部分的区域有⾜够的覆盖倍数。
4全外显⼦组测序深度的意义是什么？测序深度如何换算？测序深度代表了序列被探针组覆盖的次数，次数越⾼，测序结果的识别就越精确，后续的统计分析也就越准确。
如果做肿瘤、低频突变研究，建议测序深度⾄少应达到150×以上。
如果只看经典SNP、⾮低频突变，测序深度也⾄少应该在30×以上。
测序深度换算⽅法：⼀般⽬标区域的捕获效率在60-70%，安捷伦和罗⽒等外显⼦捕获试剂盒的⽬标区域⼤⼩在60Mb左右，即测序深度=10G*60%/60Mb=100×。
5全外显⼦组测序能够测出多⼤的⽚段缺失？⼤致能测出50bp的⽚段缺失。
由于外显⼦测序的覆盖很不平均，所以如果有⼤段的缺失，⽆法判断是因为杂交没有捕获到，还是因为缺失。
⽬前能够测到的，就是在⼀个read中发现的缺失。
⼀个read的长度也就是150bp，所以50bp以下的⽚段缺失可以从外显⼦测序中测出来。
6全外显⼦组测序可以做CNV分析吗？检测CNV的⽅法还有哪些？全外显⼦测序因为有⼀个杂交捕获的过程，这样就会有⼀个杂交捕获效率的问题。
利用外显子组测序检测一个家系突变的分析方法介绍201412
Fastq文件示例>>
第二步：测序质量评估及过滤
• 评估数据产量和质量（Illumina报告示例）， 并根据需要去除接头污染和低质量序列， 如：
– FastQC可对Illumina和ABI SOLiD测序序列质量 进行快速评估（FastQC质量报告示例） – FASTX-Toolkit和Galaxy即可评估序列质量，还 可去除污染碱基和低质量碱基并对序列进行 质量过滤
变异注释工具比较
(Pabinger, et al. Brief in Bioinform, 2013)
实际应用中，具体运用某个特定的软件是可以根据需要调整、优化的
常用注释工具ANNOVAR
• /annovar/
• 较全面的功能注释，广为使用 • 需在本地安装注释数据库，如dbSNP、 1000genomes、SIFT、DGV等，按需灵活使用 • 可基于基因注释、基于区间注释，还可过滤 • 对于SNP和indel，结果包括基因注释、氨基酸 置换预测评分、保守性预测评分、dbSNP ID、 千人基因组变异频率、NHLBI-ESP 6500 个外显 子测序变异频率等 • Annovar注释结果示例
– 目前是验证DNA序列突变的金标准
• 全基因组或全外显子组的第二代测序(Nextgeneration sequencing, NGS)(Illumina: 30-150bp)
– 优点：是通量高，成本较低 – 缺点：需PCR易引入误差，容易在高GC和同聚物的区域 出现错误，无法对高重复区域和单倍体型或杂合子序 列等这些复杂区域进行测序
可在线使用的注释工具 SeattleSeq Annotation
• /SeattleSeqAnnotation137/
• 可接受多种输入格式，如Maq、GFF、CASAVA、VCF、 自定义格式、一行一基因型格式、GATK BED • 可根据NCBI 全基因注释、或CCDS（仅编码区）、 或NCBI和CCDS两者兼有 • 注释的结果内容较SnpEff丰富，但不及ANNOVAR全 面
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346: 256-259.
［案例三］ 癌症研究：外显子测序研究局限性肺腺癌瘤内异质性[14] 本研究采用多区域取样分析瘤内异质性的研究思路，对11位患者的局限性肺腺癌的48
个肿瘤样品进行了外显子测序。共鉴定出7269个体突变，其中21个是已知的与癌症相关的 基因突变，76% 的体突变及21个已知癌症基因突变中的20个都可以在同一肿瘤的所有区域 样品中检测到，表明对肿瘤的某一区域进行单次活检，以适当的深度对其测序，可以鉴别 出绝大多数突变。而前期关于肾透明细胞癌的研究结果表明，肿瘤不同区域样品的共有突 变仅占突变总数的31%~37%，说明肿瘤异质性在不同癌种间存在差异。
应用方向
孟德尔疾病研究
马布里综合症[1]：发现致病基因PIGV； 逆向性痤疮[2]：发现致病基因NCSTN； 眼皮肤白化病[3]：发现致病基因SLC24A5； 先天性肾脏和尿道畸形[4]：发现致病基因DSTYK;
复杂疾病研究
混合型低脂血症[5]：发现致病 基因ANGPTL3； 孤独症[6]：发现11 个新生突变 ……
[9] Rudin C M, Durinck S, Stawiski E W, et al. Comprehensive genomic analysis identifies SOX2 as a frequently amplified gene in small-cell lung cancer[J]. Nature Genetics, 2012, 44(10): 1111-1116.
技术参数
样品要求 捕获平台 测序策略 测序深度 项目周期
外显子组测序 样品总量：≥1.0 μg DNA （提取自新鲜及冻存样本）
≥1.5 μg DNA （提取自FFPE样本） 样品浓度：≥20 ng/µl
Agilent SureselectXT Custom Kit
HiSeq PE150
1. 单基因病/复杂疾病有效测序深度50X以上 2. 肿瘤有效测序深度100X以上 注：可根据老师研究目的进行更高深度测序
37天
生物信息分析
1. 数据质控：去除接头污染和低质量数据 2. 与参考序列进行比对、统计测序深度及覆盖度
高级信息分析（单基因病）
1. 突变位点过滤 2. 显/隐性遗传模式分析（需老师提供家系信息）
2.1. 显性遗传模式分析 2.2. 隐性遗传模式分析 3. 候选基因功能注释 4. 基因功能及通路分析 5. 家系连锁分析 6. 纯合子区域（ROH）分析
［案例二］ 复杂疾病研究：外显子测序鉴定肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）的致病 基因[13]
肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS），又称为渐冻症，是一种成年型的神经退行性疾 病。本研究选取了47个父母+患病儿的ALS家系，利用全外显子测序寻找 De novo mutation。 发现了25个de novo突变基因，进行功能聚类分析，锁定了1个与染色质包装、神经树突生 长相关的基因CREST，后期通过细胞试验验证了该基因突变会影响神经元的伸展，证实 CREST突变与ALS相关。
[2] Liu Y, Gao M, Lv YM, et al. Confirmation by exome sequencing of the pathogenic role of NCSTN mutations in acne inversa (hidradenitis suppurativa) [J]. Journal of Investigative Dermatology,2011, 131(7): 1570-1572.
[4] Sanna-Cherchi S, Sampogna R V, Papeta N, et al. Mutations in DSTYK and dominant urinary tract malformations[J]. New England Journal of Medicine, 2013, 369(7): 621-629.
基本信息分析
3. SNP／InDel检测、注释及统计 4. Somatic SNV／InDel检测、注释及统计（成对样本）
高级信息分析（复杂疾病）
1. 突变位点过滤 2. 显/隐性遗传模式分析（需老师提供家系信息）
2.1. 显性遗传模式分析 2.2. 隐性遗传模式分析 3. 候选基因功能注释 4. 新生突变筛选及分析（成三/成四家系） 4.1. de novo mutation 筛选 4.2. 新生突变速率计算 5. 候选基因功能富集 6. 蛋白互作网络分析（PPI） 7. 基因显著性分析 （推荐20对Case/Control or trios样本）
图1 STAG3 基因结构图 （红色箭头为 STAG3 基因突变位置）
图2 ALS家系图及CREST突变功能验证
图3 产生化疗抗性的个体样本中体突变的数量及频率
参考文献
[1] Krawitz PM, Schweiger MR, Rödelsperger C, et al. Identity-by-descent filtering of exome sequence data identifies PIGV mutations in hyperphosphatasia mental retardation syndrome[J]. Nature Genetics, 2010, 42(10): 827-829.
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遗传因素的影响。这项研究利用外显子测序技术首次在中东家系1（MO1DA）的卵巢早衰 病人中发现了减数分裂基因中的STAG3基因突变可以导致隐性遗传卵巢早衰，也在小鼠动 物模型和卵巢早衰病患中得到了证实。为探索卵巢早衰或卵巢功能不全的发生机理，以及 阐明该病的临床高度异质性和遗传病因复杂性开辟了一个新的研究途径。
外显子组测序（Whole Exome Sequencing，WES）是利用探针杂交富集外显子区域的DNA序列，通过高通量测序，发现与蛋白质功能变异相关遗传突
变的技术手段。相比于全基因组测序，外显子组测序更加经济、高效。
技术优势
1. 直接对蛋白编码序列进行测序，找出影响蛋白结构的变异 2. 高深度测序，可发现常见变异及频率低于1%的罕见变异 3. 针对外显子组区域测序，约占基因组的1％，有效降低费用，周期和工作量
[7] Jones S, Wang T L, Shih I M, et al. Frequent mutations of chromatin remodeling gene ARID1A in ovarian clear cell carcinoma[J]. Science, 2010, 330(6001): 228-2ID1A； 白血病[8]：发现致癌基因DNMT3A； 小细胞肺癌[9]：发现致癌基因SOX2 ……
群体研究
藏族人高原适应性研究[10]； 深度解析人类罕见遗传变异[11]；
……
案例解析
［案例一］ 单基因病研究：外显子测序解析卵巢早衰的遗传因素[12] 卵巢早衰通常是指女性40岁之前闭经，1%的妇女患有此病，病因复杂，被认为受到
高级信息分析（癌症）
1. 易感基因筛查 2. NMF突变特征及突变频谱分析 3. 已知驱动基因筛选 4. 高频突变基因统计及通路富集分析 5. MRT高频突变基因相关性分析 6. OncodriveCLUST驱动基因预测 7. 高频CNV分布及重现性分析 8. 肿瘤纯度／倍性分析 9. 异质性／克隆结构分析 10. NovoDrug高频突变基因靶向用药预测 11. NovoDR耐药突变筛选 12. 基因组变异Circos图展示