全外显子组测序的具体方法及步骤
全外显子捕获测序的杂交和封闭原理
全外显子捕获测序的杂交和封闭原理
做外显子捕获测序实验时，会用到Cot DNA，blocker(封闭接头序列)，探针（DNA/RNA均可），链霉素磁珠等，它们具体起什么作用呢？下面，我们就来聊聊这个问题。
就实验原理来讲，外显子捕获测序的基本流程是：1.先对各个样品独立构建常规测序文库；2：等摩尔比例混合各个待杂交的文库；3：在杂交缓冲液体系内加入文库、杂交探针、Cot DNA、Blocker等；4.加入链霉素磁珠抓取杂交复合状态DNA；5：在洗脱缓冲液中洗脱目标文库，并扩增。
下图是正常建好的文库示意图。
大家都知道，DNA是双链互补配对的。
当加热打开DNA双链变性为单链DNA之后，慢慢降低温度，单链DNA会根据互补配对原则自然还原回双链状态（也就是退火过程）。
那么，可以想象一下，当很多不同的DNA文库混合在一起的时候，进行退火操作，可能会产生什么样子的DNA结合状态呢？下图说明了其中可能存在的3种情况。
由上图可知，不论哪种状态，都不可能捕获到目标DNA。
其实，情况2、3的杂交状中，P5或者P7端还可以杂交第三个、第四个等等分子。
所以，加入Blocker就是为了阻止P5、P7端的杂交，从而阻止非特异性杂交。
Cot DNA则是为了阻止原来互补配对的单链杂交回来。
带Biotin修饰的探针是为了杂交靶序列，链霉素磁珠是为了吸附Biotin修饰的杂交复合物。
全外显子测序报告解读原则与技巧
全外显子测序报告解读原则与技巧全外显子测序是利用高通量测序技术对生物体全基因组外显子区域进行测序，从而揭示人类个体及群体基因组中与疾病相关的基因变异，是现代个性化医学的重要技术手段之一。
下面我们将介绍全外显子测序报告的解读原则和技巧。
解读原则：1.全面性：全外显子测序提供了全面、高通量的大量数据，必须对其进行全面、深入的解读。
同时需要结合临床资料，以全面、系统性的方式进行解读。
2.多参考性：全外显子测序可能会检测到一些变异，但并不一定与致病性相关。
因此，需要根据多个参考数据库、文献资料以及基于家系检测的疾病遗传性等多方面的数据进行判断和筛选。
3.个体化：全外显子测序报告需要与具体个体相关的临床资料、家族病史等进行结合，重点考虑与之相关的变异是否致病、临床意义何在等方面。
4.实用性：全外显子测序报告应当具有实用性，得出的结论应当能指导个体的诊断、治疗与遗传咨询。
解读技巧：1.对阳性结果进行验证：全外显子测序可能会检测到大量的单核苷酸多态性（SNP）、小的结构变异等，为了保证结果的精确性，最好对阳性结果进行验证，可以使用参考文献、数据库或其他现代检验技术进行检验。
2.避免过度解读：全外显子测序结果的解读需要考虑基因本身的复杂性，并非所有的变异都与疾病相关。
因此不应过度解读，需要根据科学方法进行分析和评价。
3.结合病史、家族史等临床资料：全外显子测序结果需要结合实际临床背景进行解读，包括基因检测的目的、临床表现、影响家庭、遗传风险等因素。
4.遵循实践指南：目前许多学会和机构都制定了全外显子测序报告解读的指南，如美国基因组医学协会（ACMG）和全球基因组联盟（GA4GH）等，解读应该遵循指南的原则和标准。
总之，全外显子测序是一项高复杂性的技术，其结果的解读需要谨慎，需要全面、深入地理解和分析，以确保结果的准确性和实用性。
同时，我们需要结合个体的临床信息和基因组数据来指导临床医生的决策和个体的诊断治疗方案，为个性化医学做出贡献。
全外显子组测序常见问题（上）
全外显⼦组测序常见问题（上）1全外显⼦组测序必须要有参考基因组吗？必须有，如果没有参考因组，要提供近缘物种的序列，但不能保证捕获结果的可靠性。
因为捕获探针是根据提供的参考序列来设计的，如果已知⽬标区域与参考基因组⽐有较⼤出⼊，例如⼤⽚段的插⼊缺失，是不推荐的。
2为什么外显⼦测序在分析时需要跟全基因组⽐对，⽽不是直接与⽬标区域⽐对？第⼀，⽬标区域相对于全基因组⼀般较短，⽽且可能不连续，如果将⽬标区域单独提取出来，会影响区域边缘的序列⽐对效果；第⼆，⽆法评估捕获质量，例如脱靶率、on target⽐例等。
3全外显⼦组测序⼀般建议做多少倍的覆盖？⼀般做100×或150×。
较⾼的覆盖倍数，对于测异质性的遗传变质，可以发现⼩⽐例的突变。
另外，外显⼦测序的覆盖是随机的，这样较⾼的平均覆盖率有利于保证⼤部分的区域有⾜够的覆盖倍数。
4全外显⼦组测序深度的意义是什么？测序深度如何换算？测序深度代表了序列被探针组覆盖的次数，次数越⾼，测序结果的识别就越精确，后续的统计分析也就越准确。
如果做肿瘤、低频突变研究，建议测序深度⾄少应达到150×以上。
如果只看经典SNP、⾮低频突变，测序深度也⾄少应该在30×以上。
测序深度换算⽅法：⼀般⽬标区域的捕获效率在60-70%，安捷伦和罗⽒等外显⼦捕获试剂盒的⽬标区域⼤⼩在60Mb左右，即测序深度=10G*60%/60Mb=100×。
5全外显⼦组测序能够测出多⼤的⽚段缺失？⼤致能测出50bp的⽚段缺失。
由于外显⼦测序的覆盖很不平均，所以如果有⼤段的缺失，⽆法判断是因为杂交没有捕获到，还是因为缺失。
⽬前能够测到的，就是在⼀个read中发现的缺失。
⼀个read的长度也就是150bp，所以50bp以下的⽚段缺失可以从外显⼦测序中测出来。
6全外显⼦组测序可以做CNV分析吗？检测CNV的⽅法还有哪些？全外显⼦测序因为有⼀个杂交捕获的过程，这样就会有⼀个杂交捕获效率的问题。
利用外显子组测序检测一个家系突变的分析方法介绍201412
Fastq文件示例>>
第二步：测序质量评估及过滤
• 评估数据产量和质量（Illumina报告示例）， 并根据需要去除接头污染和低质量序列， 如：
– FastQC可对Illumina和ABI SOLiD测序序列质量 进行快速评估（FastQC质量报告示例） – FASTX-Toolkit和Galaxy即可评估序列质量，还 可去除污染碱基和低质量碱基并对序列进行 质量过滤
变异注释工具比较
(Pabinger, et al. Brief in Bioinform, 2013)
实际应用中，具体运用某个特定的软件是可以根据需要调整、优化的
常用注释工具ANNOVAR
• /annovar/
• 较全面的功能注释，广为使用 • 需在本地安装注释数据库，如dbSNP、 1000genomes、SIFT、DGV等，按需灵活使用 • 可基于基因注释、基于区间注释，还可过滤 • 对于SNP和indel，结果包括基因注释、氨基酸 置换预测评分、保守性预测评分、dbSNP ID、 千人基因组变异频率、NHLBI-ESP 6500 个外显 子测序变异频率等 • Annovar注释结果示例
– 目前是验证DNA序列突变的金标准
• 全基因组或全外显子组的第二代测序(Nextgeneration sequencing, NGS)(Illumina: 30-150bp)
– 优点：是通量高，成本较低 – 缺点：需PCR易引入误差，容易在高GC和同聚物的区域 出现错误，无法对高重复区域和单倍体型或杂合子序 列等这些复杂区域进行测序
可在线使用的注释工具 SeattleSeq Annotation
• /SeattleSeqAnnotation137/
• 可接受多种输入格式，如Maq、GFF、CASAVA、VCF、 自定义格式、一行一基因型格式、GATK BED • 可根据NCBI 全基因注释、或CCDS（仅编码区）、 或NCBI和CCDS两者兼有 • 注释的结果内容较SnpEff丰富，但不及ANNOVAR全 面
外显子组测序ppt课件
- Choi M, Scholl U I, Ji W, et al. Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, 106(45): 19096-19101.
Reads on target
Percent reads on target
89,782,719 87,156,364 97.1%
Mean depth of coverage
Target bases at 1x
68,899,95
7
Target bases at 10x
79.1%
Target bases at 20x
• Exome sequencing produced a higher level of coverage for the targeted sequences (mean, 167.50×), slightly increasing our ability to detect mutations with VAFs of less than 10%. [3]
• The average cover-age of each base in the targeted regions was 100-fold, and 95.3% of these bases were covered sufficiently deeply for variant calling (≥10× cover-age) [2]
针对外显子设计PCR测序引物教程
针对外显子设计PCR测序引物教程在园子搜索后，没有看到长基因（大与1000base)最简洁方法，而我现在欧洲实验室里从事这方面工作，作了大量这方面的工作。
自乐不如同乐，愿将我们设计引物技巧与大家分享，敲字很辛苦，请斑竹给点分。
可能有战友说了，我们的长基因都是交给测序公司用鸟枪法来测全基因的。
当然，您有钱当然可以这样做。
我们的方法适用于基因测序筛查突变，步骤相对简便，比较经济。
另外，本实验室最近的一偏文章采用该法发在了NEMJ上，可见该法已经是经典成熟的。
（1）基础知识我们知道gDNA由非编码区，外显子，内含子构成。
我们关心的基因是否突变在非编码区，外显字以及临近外显子的一小段内含子上。
至于其他的内含子（gDNA中的大头），发生突变与否并不是我们关心的，其临床意义也相当小。
因此我们只要设计引物来PCR上面三个重点区域就可以了。
（2）设计软件在线设计软件exon primerhttp://ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/ExonPrimer.html大家从上图可以看到，网页提示我们现在需要输入两个序列，一个是cDNA，一个是gDNA。
由于我们还要考虑非编码区，而CDNA是没有非编码区UTR的。
因此，我们必须要用mRNA 输入网页中的cDNA栏。
否则我们得到的引物不会包含UTR。
要是有看官还看不懂的话，建议看下分子生物学教材关于cDNA和mRNA的区别。
下面我们以smurf2基因来说明如何设计针对外显子的测序引物。
（2）找到smurf2 mRNA打开gene bank/,注意要在database中选nucleotide如下图蹦出一大串序列。
找到我们要的人类的smurf2Homo sapiens SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 2 (SMURF2), mRNA直接点我们要的序列名字，就得到了mRNA了，Format:GenBank FASTA Graphics More Formats选项中当然要求点选FASTA形式了把mRNA序列拖选，拷贝下来再拷贝入在线设计软件exon primer （见第一贴）http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/ExonPrimer.html好了。
外显子组测序信息分析
生物学功能研究 Functional research
在多个家系或散发病例中进行突变筛查研究 Mutation screening
4.2 WES肿瘤研究上的思路
样本选取
样本选取
13721 92.05 47.31
12636 90.86 46.75
9776 66.84 43.05
9616 64.37 41.45
6904
6815
6684
6437
当比对到参考基因组目标区域的数据量在60%之上，认为外显子捕 获效率合格。
3.2.3、染色体覆盖深度分布
注：横坐标为染色体长度，纵坐标为覆盖深度取对数。
注： Codons：密码子的变化情况；Substitution：氨基酸的替换信息；SNP Type： SNP的类型；Prediction：预测结果(damaging/tolerated)，TOLERATED表示这个突变 是可以容忍的，即对蛋白质功能没有影响或影响很小，DAMAGING表示突变是有 害的，即对蛋白质功能有较大影响； Gene ：发生替换所在的基因。
3.5.4 、样品间差异表达基因GO分类统计
差异基因GO注释聚类图
topGO有向无环图
3.5.5 、样品间差异表达基因KEGG注释
差异基因KEGG通路示意图
四、外显子组测序的应用思路
4.1 WES找寻孟德尔疾病致病基因思路
遴选和采集 病例和家系 Samples collection
全外显子测序 Whole-exome sequencing
R04 16573 17840 30639 3774 34413
全外显子组测序的具体方法及步骤
全外显子组测序的具体方法及步骤全外显子组测序（Whole Exome Sequencing，简称WES）是一种高通量测序技术，用于测定一个个体的所有外显子区域的DNA序列。
外显子是编码蛋白质的基因组区域，占据了人类基因组的约1-2%。
WES可以用于寻找致病基因突变，特别是在遗传性疾病的分子诊断中有广泛的应用。
下面将详细介绍WES的具体方法及步骤。
1.样品准备：-提取DNA：从待测个体的外周血或组织样品中提取总DNA。
-细胞裂解：使用特定组织裂解缓冲液将细胞或组织样品裂解，释放DNA。
-纯化DNA：通过离心等步骤，去除杂质，纯化DNA。
2.外显子库建立：- 靶向捕获：使用外显子组富集探针（baits）将DNA中的外显子区域进行加权，并去除非外显子区域的DNA片段。
-杂交反应：将靶向探针与DNA样品进行杂交反应，使探针与待测DNA的外显子区域发生特异性结合。
-洗涤：将未结合的探针洗掉，保留结合的外显子区域DNA片段。
-PCR扩增：对靶向捕获得到的DNA片段进行PCR扩增，以增加样品中外显子区域的DNA原料。
3.高通量测序：-数据库构建：将PCR扩增得到的外显子DNA片段建立一个DNA文库，用于测序。
- 测序反应：使用高通量测序平台（如Illumina HiSeq X）进行DNA文库的测序，得到大量的短序列片段（reads）。
- 数据处理：通过对这些reads进行去除低质量序列、比对到参考基因组等处理，获得高质量的测序数据。
4.数据分析：- 变异检测：使用专门的变异检测软件对样品中的变异进行分析，包括单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，简称SNPs）和小片段插入缺失等。
-数据解读：将检测到的变异与公开的数据库进行对比，筛选出可能与疾病相关的变异。
-功能注释：对筛选出的变异进行功能注释，评估其潜在影响，进一步缩小候选基因的范围。
- 候选基因验证：对最终候选基因进行进一步的实验验证，如Sanger测序。
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全外显子组测序的具体方法及步骤
全外显子组测序（Whole Exome Sequencing，WES）是指利用序列捕获或者靶向技术将全基因组外显子区域DNA 富集后再进行高通量测序的基因组分析方法。
与全基因组重测序相比，全外显子组测序只需针对外显子区域的基因序列测序，覆盖度更深、数据准确性更高，更加简便、经济、高效。
技术优势
高性价，强分析，快速交付
外显子组测序主要用于识别和研究与疾病相关的编码区的基因组变异。
结合大量的公共数据库提供的外显子数据和正常人群数据库, 有利于更好地排除无害突变及解释变异信息之间的关联和致病机理。
技术路线
技术参数
样本要求。