外显子组测序信息分析
外显子查找方法范文
外显子查找方法范文外显子（exon）是基因组中编码蛋白质的片段，它们是基因转录后的成果。
外显子查找是基因组学领域的一个重要任务，它可以帮助我们了解基因的功能和结构，以及鉴定和研究基因突变和遗传疾病。
在过去的几十年里，外显子查找方法经历了多次技术革新，从最早的Sanger测序到现在的高通量测序技术。
下面将介绍几种常用的外显子查找方法。
1. Sanger测序：Sanger测序是一种经典的测序技术，通过反复合成DNA链并在每个碱基上加入一种特殊的标记物来测定DNA序列。
借助Sanger测序，我们可以逐个测定DNA的碱基顺序，并通过比对已知外显子序列来确定外显子的位置。
2. 基于EST序列的外显子查找：EST（Expressed Sequence Tag）是从cDNA文库中得到的短序列片段，它们通常来自于外显子区域。
利用EST序列可以通过比对已知外显子序列来推断新的外显子。
3. 基于数据库的外显子查找：利用已知的外显子序列建立外显子数据库，如Ensembl、NCBI等，可以快速比对新的DNA序列来鉴定外显子。
4. 基于高通量测序的外显子查找：高通量测序技术的发展使得我们可以快速测定大量的DNA序列，从而推断编码蛋白质的外显子序列。
常用的高通量测序技术包括二代测序技术（如 Illumina、Iontorrent）和三代测序技术（如 PacBio、Nanopore），它们通过将DNA序列拆解成短片段并进行平行测序来提高测序速度。
5. 基于RNA-Seq的外显子查找：RNA-Seq是一种利用高通量测序技术直接测定RNA序列的方法。
由于RNA是从基因组DNA转录而来的，因此RNA-Seq可以直接测定外显子序列。
此外，由于RNA-Seq还可以检测到转录后修饰和剪接等信息，因此它成为目前外显子查找的主要方法。
总的来说，外显子查找是基因组学研究中的一项重要任务。
不同的外显子查找方法有不同的优缺点，在实际应用中需要根据研究的目的、样本的可得性和测序平台的要求来选择合适的方法。
外显子测序 生物学重复-概述说明以及解释
外显子测序生物学重复-概述说明以及解释1.引言1.1 概述外显子测序（exome sequencing）是一种基于高通量测序技术的生物学研究方法，其目的是对生物体中的外显子区域进行快速、准确地测序和分析。
外显子是基因组中编码蛋白质的片段，它们占据了整个基因组的仅0.5至1.5的区域，但却承载着80以上的已知致病突变。
因此，外显子测序被广泛应用于寻找蛋白质编码基因的突变，以及与遗传性疾病、肿瘤和其他复杂疾病相关的致病突变的鉴定和研究。
外显子测序的基本原理是使用高通量测序技术对DNA样本进行测序，然后利用生物信息学方法将测序结果与参考基因组进行比对和分析，从而确定样本中外显子的序列和存在突变的位置。
与全基因组测序相比，外显子测序具有较低的成本和更高的效率，因为外显子相对较小且具有较高的功能重要性，可以更准确地筛选和鉴定潜在致病突变。
外显子测序在生物学研究中的应用广泛而重要。
它不仅可以用于研究人类遗传性疾病和肿瘤突变，还可应用于农业、畜牧业和其他生物领域的基因组学研究。
通过对不同个体的外显子进行测序，我们可以了解个体间的遗传差异、突变积累和遗传进化规律，为人类进化和适应性研究提供重要依据。
然而，外显子测序也面临一些挑战。
首先，由于外显子区域相对较小，它只能提供关于外显子的信息，对非编码区域的突变鉴定有限。
其次，外显子测序在处理复杂疾病和疾病相关基因组变异时可能会遇到困难，因为这些变异可能位于基因的调控区域或与功能相关的非编码RNA中。
此外，外显子测序对测序深度和准确性要求较高，因此需要高质量的测序平台和数据分析方法的支持。
总之，外显子测序作为一种高效、准确的测序技术，在生物学研究和临床诊断中发挥着重要作用。
随着技术的不断发展和应用的不断扩大，外显子测序将为我们揭示生物体的基因组变异与功能之间的关系，为疾病的早期诊断和个性化治疗提供更多可能性。
同时，对于生物学重复的研究也为我们提供了全新的视角和理解，有助于揭示生命的奥秘和进化的规律。
利用外显子组测序检测一个家系突变的分析方法介绍201412
Fastq文件示例>>
第二步：测序质量评估及过滤
• 评估数据产量和质量（Illumina报告示例）， 并根据需要去除接头污染和低质量序列， 如：
– FastQC可对Illumina和ABI SOLiD测序序列质量 进行快速评估（FastQC质量报告示例） – FASTX-Toolkit和Galaxy即可评估序列质量，还 可去除污染碱基和低质量碱基并对序列进行 质量过滤
变异注释工具比较
(Pabinger, et al. Brief in Bioinform, 2013)
实际应用中，具体运用某个特定的软件是可以根据需要调整、优化的
常用注释工具ANNOVAR
• /annovar/
• 较全面的功能注释，广为使用 • 需在本地安装注释数据库，如dbSNP、 1000genomes、SIFT、DGV等，按需灵活使用 • 可基于基因注释、基于区间注释，还可过滤 • 对于SNP和indel，结果包括基因注释、氨基酸 置换预测评分、保守性预测评分、dbSNP ID、 千人基因组变异频率、NHLBI-ESP 6500 个外显 子测序变异频率等 • Annovar注释结果示例
– 目前是验证DNA序列突变的金标准
• 全基因组或全外显子组的第二代测序(Nextgeneration sequencing, NGS)(Illumina: 30-150bp)
– 优点：是通量高，成本较低 – 缺点：需PCR易引入误差，容易在高GC和同聚物的区域 出现错误，无法对高重复区域和单倍体型或杂合子序 列等这些复杂区域进行测序
可在线使用的注释工具 SeattleSeq Annotation
• /SeattleSeqAnnotation137/
• 可接受多种输入格式，如Maq、GFF、CASAVA、VCF、 自定义格式、一行一基因型格式、GATK BED • 可根据NCBI 全基因注释、或CCDS（仅编码区）、 或NCBI和CCDS两者兼有 • 注释的结果内容较SnpEff丰富，但不及ANNOVAR全 面
外显子组测序数据分析流程
外显子组测序介绍外显子（exon）是真核生物基因的一部分，包含着合成蛋白质所需要的信息。
全部外显子被称为“外显子组”（Exome）。
外显子组测序（Exome sequencing）是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。
由于外显子组测序捕获目标区域只占人类基因组长度的约1%，因此远比进行全基因组序列测序来得更简便、经济，目标区域覆盖度也更高，便于变异检测。
该项技术可用于以下研究1）检测疾病样本中外显子区域内高风险碱基变异位点；2）配合大样本分析，确定孟德尔遗传疾病相关外显子SNP位点和基因；3）在癌症研究过程中，检测癌症样本外显子区域内的体细胞突变位点和潜在的融合基因；4）用于种群遗传学研究的大规模样本基因组分析，检测SNP位点、LD并绘制种群图谱。
我们能提供详尽的全基因组重测序数据的处理和分析服务。
如您没有标准化的数据、只需流程中的局部分析内容或要求特立独行的数据分析思路，我们亦能满足您的要求。
数据处理和分析流程图预期结果示例图示例图1 各类型SNV在样本中的个数统计。
示例图2 不同类型外显子区域上的SNV类型统计。
示例图4 融合基因预测[1]示例图4 大量样本的GWAS分析结果[2]示例图5 肿瘤样本高频率突变基因统计[3]示例图来源文献[1]. Kangaspeska, S., et al., Reanalysis of RNA-sequencing data reveals several additional fusion genes with multiple isoforms. PLoS One, 2012. 7(10): p. e48745.[2]. Craig, J.E., et al., Rapid inexpensive genome-wide association using pooled whole blood. Genome Res, 2009. 19(11): p. 2075-80.[3]. Bea, S., et al., Landscape of somatic mutations and clonal evolution in mantle cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110(45): p. 18250-5.。
外显子组测序数据分析流程
外显子组测序数据分析流程外显子组测序（Exome Sequencing）是一种用于测序所有编码蛋白质的外显子区域的技术。
外显子是基因组中编码蛋白质的区域，占据整个基因组的约1-2%。
相较于全基因组测序，外显子组测序可以更加经济高效地研究和发现与疾病相关的基因变异。
以下是外显子组测序数据分析的一般流程：1.数据质控和预处理2.比对和变异调用将预处理后的数据与参考基因组进行比对，可以使用多种比对工具，如BWA、Bowtie等。
比对后，会通过一系列的筛选步骤，利用各种变异检测算法对测序结果进行检测，包括单核苷酸变异（SNV）、小片段插入/缺失（Indel）和结构变异（SV）等。
3.变异注释在进行变异注释时，将检测到的变异与各类公共数据库（如dbSNP、ClinVar等）进行比对，以确定变异的频率和相关的临床信息。
还可以使用预测软件预测变异的功能影响和通路关联等。
4.功能分析和数据解读对于已注释的变异，需要进一步进行功能分析和数据解读。
这包括通过标准化的生物信息学和统计学方法对候选变异进行筛选，确定相关性并验证其是否对目标表型有影响。
可以使用多种工具和软件，如ANNOVAR、Variant Effect Predictor（VEP）等。
5.通路分析和功能富集通路分析和功能富集分析帮助理解变异对细胞、组织或系统功能的影响。
可以使用数据库和工具，如DAVID、GSEA等，通过GO（Gene Ontology）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）路径信息和其他公共基因组学数据库，对变异进行通路富集和功能分析。
6.结果呈现最后，将数据分析结果通过可视化图形、表格和注释报告等形式进行展示和呈现。
这有助于更好地理解分析结果并帮助研究人员做出进一步的研究和决策。
需要注意的是，外显子组测序数据分析流程是根据具体研究目标和实验设计而有所不同的，上述流程仅为一般参考。
外显子组测序
346: 256-259.
［案例三］ 癌症研究：外显子测序研究局限性肺腺癌瘤内异质性[14] 本研究采用多区域取样分析瘤内异质性的研究思路，对11位患者的局限性肺腺癌的48
个肿瘤样品进行了外显子测序。共鉴定出7269个体突变，其中21个是已知的与癌症相关的 基因突变，76% 的体突变及21个已知癌症基因突变中的20个都可以在同一肿瘤的所有区域 样品中检测到，表明对肿瘤的某一区域进行单次活检，以适当的深度对其测序，可以鉴别 出绝大多数突变。而前期关于肾透明细胞癌的研究结果表明，肿瘤不同区域样品的共有突 变仅占突变总数的31%~37%，说明肿瘤异质性在不同癌种间存在差异。
应用方向
孟德尔疾病研究
马布里综合症[1]：发现致病基因PIGV； 逆向性痤疮[2]：发现致病基因NCSTN； 眼皮肤白化病[3]：发现致病基因SLC24A5； 先天性肾脏和尿道畸形[4]：发现致病基因DSTYK;
复杂疾病研究
混合型低脂血症[5]：发现致病 基因ANGPTL3； 孤独症[6]：发现11 个新生突变 ……
[9] Rudin C M, Durinck S, Stawiski E W, et al. Comprehensive genomic analysis identifies SOX2 as a frequently amplified gene in small-cell lung cancer[J]. Nature Genetics, 2012, 44(10): 1111-1116.
应用全外显子组测序产前诊断1例罕见的条纹状骨病伴颅骨硬化症
孕妇31岁，丈夫39岁，孕2产1，平素月经规律，（5～6）/28 d，末次月经2017年8月30日。
2017年12月7日因外院“孕12+3周B 超提示胎儿颈后透明带厚度0.3 cm”转诊至解放军总医院第一医学中心，孕14+1周复查B 超提示胎儿颈部皱褶（nuchal fold，NF ）厚度 0.48 cm，余未见明显异常；孕17+4周超声提示胎儿NF 厚度 0.76 cm，下颌骨短小，胎儿透明隔腔显示不清。
孕20周超声提示胎儿左侧侧脑室1.15 cm，NF 厚度 0.61 cm，透明隔及胼胝体可见；羊膜腔穿刺取羊水20 ml 进行细胞培养，经过胰蛋白酶消化、Giemsa 染色显带，行染色体核型分析未见异常；另取羊水10 ml，提取胎儿基因组DNA 行单核苷酸多态性微阵列（single nucleotide polymorphism array，SNP array ）检测亦未见染色体拷贝数异常。
孕22+6周超声提示胎儿左侧侧脑室增宽，宽约1.15 cm，胎儿NF 厚度 0.64 cm，孕妇和家属选择继续妊娠。
孕28周外院超声提示羊水指数33.5 cm，再次转至我院，孕31+4周超声提示胎儿双顶径9.37 cm，头围34.93 cm，左侧侧脑室1.02 cm，腹围30.07 cm，股骨长6.01 cm,羊水指数42.8 cm，脐动脉收缩压/舒张压（S/D ）2.9～4.2，收入院。
考虑不除外单基因遗传病，建议取羊水行全外显子组测序，告知为科研性质，结果回报需时较长，可能无助于处理。
夫妻双方同意行核心家系全外显子组测序及可疑致病位点Sanger 测序验证：提取羊水及夫妻双方外周血基因组DNA，质检合格后进行文库制备。
采用IDT The xGen Exome Research Panel v1.0全外显子捕获芯片实现目标序列的靶向富集，进行文应用全外显子组测序产前诊断1例罕见的条纹状骨病伴颅骨硬化症 许伊云 张鑫悦 汪淑娟 谢潇潇 周红辉 游艳琴 卢彦平（解放军总医院第一医学中心 妇产科，北京 100853）·病例报告·DOI ：10.3969/j.issn.2095-5340.2020.02.019基金项目：军队计生专项研究基金军队出生缺陷干预救助体系的研究（16JS010）通信作者：卢彦平（Email ：***************）库构建，经Illumina NovaSeq 6000系列测序仪高通量测序，目标序列测序覆盖度≥99%。
全外显子组测序鉴定一家系长岛型掌跖角化症SERPINB7基因突变分析
全外显子组测序鉴定一家系长岛型掌跖角化症SERPINB7基因突变分析作者：黄闰娣王笑宇刘成李荣华余佳林李常兴来源：《右江医学》2021年第04期【摘要】目的对一例临床诊断遗传性掌跖角化症患者进行全外显子组测序分析致病基因。
方法收集一例临床诊断遗传性掌跖角化症的临床资料，采集患者及家系成员样本提取外周血DNA，通过全外显子组测序结果筛选致病变异，进一步用Sanger测序进行家系验证。
结果一家系成员3人，患者1人，女，17岁，表现为掌跖角化症17年。
患者检测到SERPINB7纯合突变c.796C>T（p.Arg266Ter）位点，该突变导致SERPINB7基因编码的蛋白第266位氨基酸由精氨酸變为终止密码。
先证者父亲和母亲均检测到SERPINB7杂合突变c.796C>T（p.Arg266Ter）位点。
该例患者诊断为长岛型掌跖角化症（Nagashima-type palmoplantar keratosis，NPPK）。
结论 NPPK患者符合常染色体隐性遗传模式，SERPINB7 c.796C>T（p.Arg266Ter）基因纯合突变是导致该例NPPK患者的临床表型。
【关键词】长岛型掌跖角化症;丝氨酸蛋白酶抑制剂B7;基因;突变中图分类号：R758.5+3 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.04.004Analysis on SERPINB7 gene mutation in a family with Nagashima-type palmoplantar keratosis identified by whole exome sequencing[HJ2][HJ]HUANG Rundi1， WANG Xiaoyu2， LIU Cheng2， LI Ronghua3， YU Jialin1， LI Changxing4（1. Department of Dermatology， Dalang Hospital of Dongguan， Dongguan 523770，Guangdong， China;2. Department of Dermatology， Guangdong Armed Police Corps General Hospital Affiliated to GuangzhouMedical University， Guangzhou 510517， Guangdong， China; 3.Department of Dermatology， Quanzhou FirstHospital Affiliated to Fujian Medical University， Quanzhou 362000， Fujian， China; 4. Department ofDermatology， Nanfang Hospital of Southern Medical University， Guangzhou 510515，Guangdong， China）[HJ2][HJ]【Abstract】 Objective To carry out whole exome sequencing on 1 case of hereditary palmoplantar keratosis diagnosed in the clinic， so as to analyze pathogenic genes of it.Methods The clinical data of a case of hereditary palmoplantar keratosis were collected. The samples of the patient and her family members were collected to extract the peripheral blood DNA. Pathogenic variants were screened by the results of whole exome sequencing， and Sanger sequencing was used for further family verification.Results The family （3 members） included a 17- year-old female patient， characterized by palmoplantar keratosis for 17 years. A homozygous mutation of SERPINB7c.796C>T（p.Arg266Ter） was identified in the patient， which caused the protein 266 amino acid encoded by the SERPINB7 gene to change from arginine to termination code. SERPINB7 heterozygous mutation c.796C>T （p.Arg266 Ter） locus was detected in both father and mother of the patient. So the patient was diagnosed with Nagashima-type palmoplantar keratosis （NPPK）.Conclusion The NPPK patient is consistent with autosomal recessive inheritance pattern， and SERPINB7 c.796C>T（p.Arg266Ter） homozygous mutation is responsible for the clinical phenotype of this NPPK patient.【Key words】 NPPK; SERPINB7; gene; mutation长岛型掌跖角化症（Nagashima-type palmoplantar keratosis，NPPK）首先在日本报告，是一种罕见的先天性掌跖角化症，遗传模式符合常染色体隐性遗传，临床表现为掌跖等部位出现红斑、丘疹、斑块、角化，常伴真菌感染或手足多汗症[1～2]。
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Base_covered_on_target(Mb)10 Coverage_of_target_region11 Fraction_of_target_covered_with_at_least_20x12 Fraction_of_target_covered_with_at_least_10x13 Fraction_of_target_covered_with_at_least_4x14
13721 92.05 47.31
12636 90.86 46.75
9776 66.84 43.05
9616 64.37 41.45
6904
6815
6684
6437
当比对到参考基因组目标区域的数据量在60%之上，认为外显子捕 获效率合格。
3.2.3、染色体覆盖深度分布
注：横坐标为染色体长度，纵坐标为覆盖深度取对数。
二、外显子组测序流程
基因组DNA的随机打断 DNA片段生物信息分析
三、外显子组测序信息分析流程
主要信息分析内容归类
3.1、数据过滤与评估 3.2、整体质量评估 3.3、SNP检测与注释 3.4、InDel检测与注释 3.5、高级分析
外显子组测序在医学研究中的应用
一 • 外显子组测序技术简介 二 • 外显子组测序流程 三 • 外显子组测序信息分析内容 四 • 外显子组测序的应用方案
一、外显子组测序技术简介
外显子测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区 域DNA捕捉并富集后，再进行高通量测序的基因组分析方法。
外显子组序列仅占全基因组序列的1%左右，与人类85% 致病基因突变相关。与全基因组测序相比，外显子组测序不 仅费用较低，而且测序覆盖度更深，数据准确性更高。
3.3.2、 SNP注释
Type
INTERGENIC INTRAGENIC INTRON
UPSTREAM DOWNSTREAM UTR_3_PRIME UTR_5_PRIME SPLICE_SITE_ACCEPTOR SPLICE_SITE_DONOR
CDS
Other
NON_SYNONYMOUS_CODING NON_SYNONYMOUS_START START_GAINED START_LOST STOP_GAINED STOP_LOST SYNONYMOUS_CODING SYNONYMOUS_STOP
3.3、 SNP检测及注释
3.3.1、 SNP检测
SNP的检测主要使用GATK软件工具包实现。
BMK ID SNP Number
Transition Number
X1 X2 X3 X4 Total
985254 842516 263326 289954 1556901
669172 573399 178220 196145
3.3.3、突变特征
突变位点上下文碱基偏好性
注：横坐标为突变位点上下文的碱基位置，0为SNP突变位点，负数代表突变位点前的碱基， 正数代表突变位点后的碱基，纵坐标为不同碱基对应的比例。从图上可以看出，不同类型 的SNP突变上下文具有不同的碱基偏好性。
3.4、 InDel检测及注释
3.4.1、 InDel检测
3.1、数据过滤与评估
3.1.1、原始数据过滤
1. 过滤接头。对含接头的reads去除接头序列。 2. 一条reads上N（未能确定出具体的碱基类型）的比例
大于5%，则过滤掉该reads。 3. 过滤低质量reads，过滤掉Q30<85% reads。
3.1.2、测序数据统计与评估
测序质量值分布图
892 975
111 121 218 865 610 652 51 277 303 32 77 112 124
776 850 14 14 19 21 882 925 00 93 100 32 10 8 10 923 940 00 32 18
3.3.3、突变特征
突变频谱图
注：横坐标为不同类型的突变，纵坐标为不同类型突变对应的频率。
Transversion Number
316082 269117 85106 93809
Ti/Tv Ratio
2.11 2.13 2.09 2.09
Heterozygosity Number
207400 167179 26436 30446
Homozygosity Number
777854 675337 236890 259508
Region Insertion Deletion Heterozygosity Homozygosity
Total
R01 51689 57643 89744 19588 109332
R02 44234 51061 78848 16447 95295
X1 118.70
X2 118.70
X3 118.70
X4 118.70
Reads_mapping_ref(single reads)2
182.95
168.48
97.76 96.16
Mapping_datasize(Mb)3 Effective_sequences_on_target(Mb)5 Average_sequencing_depth_on_target7
R01
449352
3425
401739
24452
95551
395 2165 31 61 1971 2 378 8 26 5 1772 1 106
R02
380794
2896
343966
21350
83565
407 1891 36 54 1899 1 346 6 24 3 1732 1 89
R0 R0 34 113 125 110 682
碱基含量分布图
3.2、整体测序质量评估
3.2.1、测序深度统计
注：横坐标代表测序深度，纵坐标代表目标区域上对应深度的碱基数占总碱 基数的百分比。目标区域的单碱基分布近似服从泊松分布。
3.2.2、外显子捕获统计
Target region stat Length_of_target_region(Mb)1