利用外显子组测序检测一个家系突变的分析方法介绍201412
全外显子组测序的具体方法及步骤
全外显子组测序的具体方法及步骤
全外显子组测序（Whole Exome Sequencing，WES）是指利用序列捕获或者靶向技术将全基因组外显子区域DNA 富集后再进行高通量测序的基因组分析方法。
与全基因组重测序相比，全外显子组测序只需针对外显子区域的基因序列测序，覆盖度更深、数据准确性更高，更加简便、经济、高效。
技术优势
高性价，强分析，快速交付
外显子组测序主要用于识别和研究与疾病相关的编码区的基因组变异。
结合大量的公共数据库提供的外显子数据和正常人群数据库, 有利于更好地排除无害突变及解释变异信息之间的关联和致病机理。
技术路线
技术参数
样本要求。
外显子组测序信息分析
Base_covered_on_target(Mb)10 Coverage_of_target_region11 Fraction_of_target_covered_with_at_least_20x12 Fraction_of_target_covered_with_at_least_10x13 Fraction_of_target_covered_with_at_least_4x14
13721 92.05 47.31
12636 90.86 46.75
9776 66.84 43.05
9616 64.37 41.45
6904
6815
6684
6437
当比对到参考基因组目标区域的数据量在60%之上，认为外显子捕 获效率合格。
3.2.3、染色体覆盖深度分布
注：横坐标为染色体长度，纵坐标为覆盖深度取对数。
二、外显子组测序流程
基因组DNA的随机打断 DNA片段生物信息分析
三、外显子组测序信息分析流程
主要信息分析内容归类
3.1、数据过滤与评估 3.2、整体质量评估 3.3、SNP检测与注释 3.4、InDel检测与注释 3.5、高级分析
外显子组测序在医学研究中的应用
一 • 外显子组测序技术简介 二 • 外显子组测序流程 三 • 外显子组测序信息分析内容 四 • 外显子组测序的应用方案
一、外显子组测序技术简介
外显子测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区 域DNA捕捉并富集后，再进行高通量测序的基因组分析方法。
外显子组序列仅占全基因组序列的1%左右，与人类85% 致病基因突变相关。与全基因组测序相比，外显子组测序不 仅费用较低，而且测序覆盖度更深，数据准确性更高。
外显子组测序信息分析
外显子组测序信息分析外显子组测序技术的基本步骤包括DNA提取、文库构建、高通量测序和生物信息学分析。
首先，从样品中提取DNA，通常使用血液或组织样本。
然后，将DNA片段切割，并使用特定的引物将其扩增为文库。
接下来，将文库中的DNA片段进行高通量测序，产生大量的短读取序列。
最后，使用生物信息学工具对测序数据进行分析，以寻找变异并解读其意义。
外显子组测序的结果可以提供大量有关基因组的信息。
首先，可以检测SNV和Indel等单个碱基突变，这些突变可能与人类疾病的发生相关。
其次，可以检测到外显子区域的读框错移突变，这些突变可能会导致蛋白质的功能改变。
此外，还可以通过检测外显子区域的拷贝数变异(CNV)来揭示与疾病相关的基因缺失或复制。
最后，外显子组测序还可以帮助发现新的基因和调控元件，以及对个体之间的遗传差异和基因底物关系进行研究。
虽然外显子组测序技术已经取得了很大的成功，但仍然面临一些挑战。
首先，外显子组测序只能揭示外显子区域的变异，而无法揭示基因组的其他部分。
其次，由于测序数据的复杂性，需要进行大量的生物信息学分析，对于没有相关经验的研究者来说可能会有一定的难度。
此外，由于运营和存储测序设备的成本较高，外显子组测序对实验室和研究者的设施和经济资源要求较高。
总之，外显子组测序是一种强大的技术，可以揭示与人类疾病相关的基因变异。
通过对测序数据的分析和解读，可以帮助我们更好地理解基因组的结构和功能，为疾病的诊断和治疗提供重要的信息。
尽管面临一些挑战，随着技术的进步和成本的下降，外显子组测序在个性化医学和遗传学研究中将发挥越来越大的作用。
全外显子测序报告解读原则与技巧
全外显子测序报告解读原则与技巧全外显子测序是利用高通量测序技术对生物体全基因组外显子区域进行测序，从而揭示人类个体及群体基因组中与疾病相关的基因变异，是现代个性化医学的重要技术手段之一。
下面我们将介绍全外显子测序报告的解读原则和技巧。
解读原则：1.全面性：全外显子测序提供了全面、高通量的大量数据，必须对其进行全面、深入的解读。
同时需要结合临床资料，以全面、系统性的方式进行解读。
2.多参考性：全外显子测序可能会检测到一些变异，但并不一定与致病性相关。
因此，需要根据多个参考数据库、文献资料以及基于家系检测的疾病遗传性等多方面的数据进行判断和筛选。
3.个体化：全外显子测序报告需要与具体个体相关的临床资料、家族病史等进行结合，重点考虑与之相关的变异是否致病、临床意义何在等方面。
4.实用性：全外显子测序报告应当具有实用性，得出的结论应当能指导个体的诊断、治疗与遗传咨询。
解读技巧：1.对阳性结果进行验证：全外显子测序可能会检测到大量的单核苷酸多态性（SNP）、小的结构变异等，为了保证结果的精确性，最好对阳性结果进行验证，可以使用参考文献、数据库或其他现代检验技术进行检验。
2.避免过度解读：全外显子测序结果的解读需要考虑基因本身的复杂性，并非所有的变异都与疾病相关。
因此不应过度解读，需要根据科学方法进行分析和评价。
3.结合病史、家族史等临床资料：全外显子测序结果需要结合实际临床背景进行解读，包括基因检测的目的、临床表现、影响家庭、遗传风险等因素。
4.遵循实践指南：目前许多学会和机构都制定了全外显子测序报告解读的指南，如美国基因组医学协会（ACMG）和全球基因组联盟（GA4GH）等，解读应该遵循指南的原则和标准。
总之，全外显子测序是一项高复杂性的技术，其结果的解读需要谨慎，需要全面、深入地理解和分析，以确保结果的准确性和实用性。
同时，我们需要结合个体的临床信息和基因组数据来指导临床医生的决策和个体的诊断治疗方案，为个性化医学做出贡献。
外显子组测序技术
外显子组测序技术一、前言外显子组测序技术是一种高通量测序技术，它可以通过对人类基因组的外显子进行测序，来寻找与疾病相关的基因变异。
本文将详细介绍外显子组测序技术的原理、方法和应用。
二、原理外显子组测序技术是一种全基因组测序的变体，它只对基因组中编码蛋白质的区域（即外显子）进行测序。
这种技术可以检测到与疾病相关的单核苷酸多态性（SNP）、插入/缺失（indel）和结构变异等多种类型的突变。
三、方法1. 样品准备首先需要从患者或正常人身上提取DNA样品，并将其分离成片段。
然后使用特定的酶来切割这些片段，使其只包含编码蛋白质的区域。
2. 库制备接下来需要将这些片段连接到适当大小的DNA片段上，并添加适当的标签以便于后续处理。
这个过程称为库制备。
3. 测序完成库制备之后，需要进行高通量测序。
当前可用于外显子组测序的技术包括Illumina、Ion Torrent和Pacific Biosciences等。
4. 数据分析测序完成后，需要对数据进行处理和分析。
这个过程可以使用各种软件来完成，例如BWA、GATK和SAMtools等。
四、应用外显子组测序技术已经被广泛应用于疾病研究和临床诊断。
例如，在肿瘤学中，它可以检测到肿瘤细胞中的突变，并帮助医生选择最佳的治疗方案。
此外，它还可以用于遗传性疾病的诊断和预测。
五、优缺点1. 优点外显子组测序技术具有高通量、高灵敏度和高特异性等优点。
它可以检测到多种类型的基因变异，并且可以同时对多个样品进行分析。
2. 缺点外显子组测序技术的主要缺点是成本较高，并且需要较长的数据处理时间。
此外，由于只对编码蛋白质区域进行测序，因此无法检测到与非编码RNA相关的突变。
六、总结外显子组测序技术是一种重要的高通量测序技术，它可以用于疾病研究和临床诊断。
虽然它有一些缺点，但随着技术的不断发展，相信它将在未来得到更广泛的应用。
外显子测序 生物学重复-概述说明以及解释
外显子测序生物学重复-概述说明以及解释1.引言1.1 概述外显子测序（exome sequencing）是一种基于高通量测序技术的生物学研究方法，其目的是对生物体中的外显子区域进行快速、准确地测序和分析。
外显子是基因组中编码蛋白质的片段，它们占据了整个基因组的仅0.5至1.5的区域，但却承载着80以上的已知致病突变。
因此，外显子测序被广泛应用于寻找蛋白质编码基因的突变，以及与遗传性疾病、肿瘤和其他复杂疾病相关的致病突变的鉴定和研究。
外显子测序的基本原理是使用高通量测序技术对DNA样本进行测序，然后利用生物信息学方法将测序结果与参考基因组进行比对和分析，从而确定样本中外显子的序列和存在突变的位置。
与全基因组测序相比，外显子测序具有较低的成本和更高的效率，因为外显子相对较小且具有较高的功能重要性，可以更准确地筛选和鉴定潜在致病突变。
外显子测序在生物学研究中的应用广泛而重要。
它不仅可以用于研究人类遗传性疾病和肿瘤突变，还可应用于农业、畜牧业和其他生物领域的基因组学研究。
通过对不同个体的外显子进行测序，我们可以了解个体间的遗传差异、突变积累和遗传进化规律，为人类进化和适应性研究提供重要依据。
然而，外显子测序也面临一些挑战。
首先，由于外显子区域相对较小，它只能提供关于外显子的信息，对非编码区域的突变鉴定有限。
其次，外显子测序在处理复杂疾病和疾病相关基因组变异时可能会遇到困难，因为这些变异可能位于基因的调控区域或与功能相关的非编码RNA中。
此外，外显子测序对测序深度和准确性要求较高，因此需要高质量的测序平台和数据分析方法的支持。
总之，外显子测序作为一种高效、准确的测序技术，在生物学研究和临床诊断中发挥着重要作用。
随着技术的不断发展和应用的不断扩大，外显子测序将为我们揭示生物体的基因组变异与功能之间的关系，为疾病的早期诊断和个性化治疗提供更多可能性。
同时，对于生物学重复的研究也为我们提供了全新的视角和理解，有助于揭示生命的奥秘和进化的规律。
利用外显子组测序检测一个家系突变的分析方法介绍201412
Fastq文件示例>>
第二步：测序质量评估及过滤
• 评估数据产量和质量（Illumina报告示例）， 并根据需要去除接头污染和低质量序列， 如：
– FastQC可对Illumina和ABI SOLiD测序序列质量 进行快速评估（FastQC质量报告示例） – FASTX-Toolkit和Galaxy即可评估序列质量，还 可去除污染碱基和低质量碱基并对序列进行 质量过滤
变异注释工具比较
(Pabinger, et al. Brief in Bioinform, 2013)
实际应用中，具体运用某个特定的软件是可以根据需要调整、优化的
常用注释工具ANNOVAR
• /annovar/
• 较全面的功能注释，广为使用 • 需在本地安装注释数据库，如dbSNP、 1000genomes、SIFT、DGV等，按需灵活使用 • 可基于基因注释、基于区间注释，还可过滤 • 对于SNP和indel，结果包括基因注释、氨基酸 置换预测评分、保守性预测评分、dbSNP ID、 千人基因组变异频率、NHLBI-ESP 6500 个外显 子测序变异频率等 • Annovar注释结果示例
– 目前是验证DNA序列突变的金标准
• 全基因组或全外显子组的第二代测序(Nextgeneration sequencing, NGS)(Illumina: 30-150bp)
– 优点：是通量高，成本较低 – 缺点：需PCR易引入误差，容易在高GC和同聚物的区域 出现错误，无法对高重复区域和单倍体型或杂合子序 列等这些复杂区域进行测序
可在线使用的注释工具 SeattleSeq Annotation
• /SeattleSeqAnnotation137/
• 可接受多种输入格式，如Maq、GFF、CASAVA、VCF、 自定义格式、一行一基因型格式、GATK BED • 可根据NCBI 全基因注释、或CCDS（仅编码区）、 或NCBI和CCDS两者兼有 • 注释的结果内容较SnpEff丰富，但不及ANNOVAR全 面
全外显子组测序解析卵巢早衰的遗传机制
The New England Journal of Medicine全外显子组测序解析卵巢早衰的遗传机制截止目前，在卵巢早衰（premature ovarian failure, POF）病例中发现了染色体缺失、重组、以及常染色体或X染色体上的突变等多种遗传变异，但是大多数卵巢早衰患者的遗传病因仍未明确。
巴黎大学的研究人员通过全外显子组测序，验证了 研究成果发表于2014年3月的The New England Journal of Medicine（IF:55.873）。
讨论本研究利用外显子组测序首次在卵巢早衰中东家系（MO1DA）中发现STAG3突变导致隐性遗传卵巢早衰，为探索卵巢早衰或卵巢功能不全的发生机理、及阐明该病的临床高度异质性和遗传病因复杂性开辟了新的研究途径。
首页 科技服务 医学检测 科学与技术 市场与支持 加入我们 关于我们提供领先的基因组学解决方案Providing Advanced Genomic Solutions阅读原文>>研究方法取 材建 库测 序Agilent SureSelectXT 50 Mb Exon Capture Illumina HiSeq 2000；测序深度50×中东家系（MO1DA）中的1个卵巢早衰患者和1个未患病同胞姐妹（其父母为近亲结婚）Stag315 DaysStag31. STAG3纯合突变筛选对家系中的两姐妹进行外显子组测序，其中一个患有卵巢早衰（IV-1），另外一个不患此病（IV-3），测序结果发现患者IV-1的7号染色体上有一个大的纯合区域，并发现位于7q21.3–22.2内的6个基因发生突变，根据基因的已知功能或表达结构域排除了其中5个基因，最后锁定一个基因 — STAG3，STAG3 发生了移码突变（c.968delC）。
外显子组测序信息分析
生物学功能研究 Functional research
在多个家系或散发病例中进行突变筛查研究 Mutation screening
4.2 WES肿瘤研究上的思路
样本选取
样本选取
13721 92.05 47.31
12636 90.86 46.75
9776 66.84 43.05
9616 64.37 41.45
6904
6815
6684
6437
当比对到参考基因组目标区域的数据量在60%之上，认为外显子捕 获效率合格。
3.2.3、染色体覆盖深度分布
注：横坐标为染色体长度，纵坐标为覆盖深度取对数。
注： Codons：密码子的变化情况；Substitution：氨基酸的替换信息；SNP Type： SNP的类型；Prediction：预测结果(damaging/tolerated)，TOLERATED表示这个突变 是可以容忍的，即对蛋白质功能没有影响或影响很小，DAMAGING表示突变是有 害的，即对蛋白质功能有较大影响； Gene ：发生替换所在的基因。
3.5.4 、样品间差异表达基因GO分类统计
差异基因GO注释聚类图
topGO有向无环图
3.5.5 、样品间差异表达基因KEGG注释
差异基因KEGG通路示意图
四、外显子组测序的应用思路
4.1 WES找寻孟德尔疾病致病基因思路
遴选和采集 病例和家系 Samples collection
全外显子测序 Whole-exome sequencing
R04 16573 17840 30639 3774 34413
基于全外显子组测序的致病性突变的分析研究
基于全外显子组测序的致病性突变的分析研究随着DNA测序技术的发展，全外显子组测序已成为了一种广泛应用的高通量测序技术。
相比于传统的Sanger测序技术，全外显子组测序覆盖面更广，能够检测到更多的突变，因此在致病性突变的分析研究中得到了广泛的应用。
一、全外显子组测序原理全外显子组测序就是通过对个体全部外显子区域进行测序，来检测基因组DNA的突变状态。
测序读段通过高通量测序仪进行自动化测序和拼接，生成整个基因组的测序片段组，然后进行基因突变位点分析和注释，并将结果与全球数据库进行比对，来确定基因的功能和表达情况。
常用的分析软件包括GATK、VariantStudio、ANNOVAR等。
二、全外显子组测序在致病性突变分析中的应用全外显子组测序是一种高效、准确、全面的技术，被广泛应用于致病性突变的分析研究中。
它能够检测到各种类型的致病性突变，如错义突变、无义突变、插入/缺失、剪接变异等。
通过全外显子组测序分析，可以确定基因的整体突变情况，挖掘出与疾病相关的突变位点，从而为疾病的诊断和治疗提供重要的依据。
例如，对于帕金森病的研究，全外显子组测序可以帮助鉴定突变，并发现新的针对该疾病的药物靶点。
对于遗传性视网膜疾病的研究，全外显子组测序可以检测出疾病相关的基因突变，并为个性化治疗提供基础。
三、全外显子组测序技术的挑战和应对全外显子组测序技术虽然具有高效、全面的优势，但也面临着一些挑战。
例如，由于基因的复杂性，在全外显子组测序中可能会遗漏一些重要的突变。
此外，全外显子组测序对样本的要求较高，需要较高的DNA质量和浓度，否则会影响数据的准确性。
针对这些挑战，研究人员也在不断地进行技术的改进和优化。
例如，加强样本的质量控制和样本的深度覆盖，可以提高数据的准确性；通过结合其他测序技术，如RNA测序、基因芯片等，可以增加对基因功能的深度分析。
四、结语全外显子组测序技术的应用正在推动致病性突变的分析研究领域不断向前发展。
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– case common missense/stop/coding_change/frameshift/splice/ ncRNA snps NOT in family controls, – with 1000genomes(ALL & ASN) and ESP6500 frequency <16%(MAF<0.16), – compared against SKLMG sequenced controls & cases
第四步：变异检测
• 运用 GATK/MuTect/VarScan/Atlas2 /Samtools /SVDetect /Polymutt等工具包， 查找 SNP和 Indel、缺失、插入、倒位、易 位、CNV等
– 我们目前采用GATK工具包 – GATK寻找SNP&Indel突变的流程图
• GATK Best Practices
SNP & Indel
突变注释（dbSNP，1000g，ESP6500， DGV等，位置，功能，保守性，通路， 蛋白互作网络…）
突变筛选，可视化 生成分析结果报告 突变验证，提送临床医生，生产件转换 成fastq文件
FASTQ file format
FASTQ 文件示例，该文件包含一条序列：
Fastq文件示例>>
第二步：测序质量评估及过滤
• 评估数据产量和质量（Illumina报告示例）， 并根据需要去除接头污染和低质量序列， 如：
– FastQC可对Illumina和ABI SOLiD测序序列质量 进行快速评估（FastQC质量报告示例） – FASTX-Toolkit和Galaxy即可评估序列质量，还 可去除污染碱基和低质量碱基并对序列进行 质量过滤
Variant Call Format (VCF) 是用于存储基因序列变异的特定文本文件格式，该格式是随着 大规模基因分型和DNA测序而出现的，如千人基因组计划。它包含描述元数据的行，然后是数据 表头行，后面的数据行每行包含基因组中一个位置的信息（如变异信息）。
VCF（Variant Call Format）文件（示例）
• Integrated Genomics Viewer (IGV)
（/software/igv/home ）
– 浏览大型基因组数据的高性能交互式视图 – 整合了NCBI refGene数据、hg19、hg18等不同 版本的人类参考基因组 – 可在本地交互式查看局部比对 – 可同时查看多个样本的比对，支持多种数据类 型
第三步：将序列比对到参考基因组
• 目的：对测出的序列片段进行定位，看位 于参考基因组上的哪个位置
• 生成SAM或BAM（二进制）文件
– 比对工具如：BWA，bowtie2，Illumina的 Hiseq Analysis Software ，SOAP等，我们用的 BWA mem
Bam文件用igv工具展示示例
显性 隐性
过滤正常人数据库 dbSNP, 1000 Genome Project, ESP, in-house数据库，
基因纯和或复合杂合位点
过滤正常人数据库
对蛋白功能影响的预测
dbSNP,1000 Genome Project, ESP, in-house数据库， 如：去除高频突变
变异筛选结果示例（ SNP&Indel）
• 非编码改变的影响预测准确性还相对有限， 通过数量性状定位或关联分析的文献数据
来预测是目前最为有效的方法
第六步：变异筛选 （举例，并非唯一方案）
找出患者共有而正常对照没有的变异 去除不影响功能的变异，如同义变异、基因间区、内含子区的变异， 保留Missense, nonsense, splice site, frameshift, cds-indel等变异
利用外显子组测序检测一个家 系突变的分析方法介绍
郑宇
2014-12-18
提纲
• NGS 测序简介 • 分析基本流程
– – – – – – 质量过滤 比对 寻找变异 变异质量过滤 变异注释 家系或群体样本综合分析过滤
（一）
NGS测序简介
DNA 测序简介
• 针对单个小扩增片段进行的Sanger测序(1-1000bp)
（二）
数据分析基本流程
分析目的：变异检测
• DNA变异常见类型：
– 单核苷酸多态（SNP）和短片段插入缺失 （Indel） – 缺失（deletion） – 插入（insertion） – 倒位（ inversion） – 易位（translocation） – 拷贝数变异 （CNV）
NGS数据分析基本流程
变异注释工具比较
(Pabinger, et al. Brief in Bioinform, 2013)
实际应用中，具体运用某个特定的软件是可以根据需要调整、优化的
常用注释工具ANNOVAR
• /annovar/
• 较全面的功能注释，广为使用 • 需在本地安装注释数据库，如dbSNP、 1000genomes、SIFT、DGV等，按需灵活使用 • 可基于基因注释、基于区间注释，还可过滤 • 对于SNP和indel，结果包括基因注释、氨基酸 置换预测评分、保守性预测评分、dbSNP ID、 千人基因组变异频率、NHLBI-ESP 6500 个外显 子测序变异频率等 • Annovar注释结果示例
• 实践显示，多种不同软件共同识别的变异 有更高的可靠性，因此有建议使用 consensus calls
第五步：变异注释
• 帮助预测变异的生物学功能或意义 • 运用 Annovar、SeattleAnnotation、 GenomeTrax等工具对每一变异筛查dbSNP、 1000genomes、PolyPhen、SIFT、 ESP 、 HGMD、OMIM、KEGG Pathway、CNV、 DGV等数据库，评估表型或疾病风险
（ /gatk/guide/best-practices）
Snp&Indel生成VCF或者GVCF格式结果文件
VCF格式
vs.
GVCF格式
VCF 格式
##fileformat=VCFv4.0 ##fileDate=20110705 ##reference=1000GenomesPilot-NCBI37 ##phasing=partial ##INFO=<ID=NS,Number=1,Type=Integer,Description="Number of Samples With Data"> ##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Total Depth"> ##INFO=<ID=AF,Number=.,Type=Float,Description="Allele Frequency"> ##INFO=<ID=AA,Number=1,Type=String,Description="Ancestral Allele"> ##INFO=<ID=DB,Number=0,Type=Flag,Description="dbSNP membership, build 129"> ##INFO=<ID=H2,Number=0,Type=Flag,Description="HapMap2 membership"> ##FILTER=<ID=q10,Description="Quality below 10"> ##FILTER=<ID=s50,Description="Less than 50% of samples have data"> ##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description="Genotype Quality"> ##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description="Genotype"> ##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Read Depth"> ##FORMAT=<ID=HQ,Number=2,Type=Integer,Description="Haplotype Quality"> #CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT Sample1 Sample2 Sample3 2 4370 rs6057 G A 29 . NS=2;DP=13;AF=0.5;DB;H2 GT:GQ:DP:HQ 0|0:48:1:52,51 1|0:48:8:51,51 1/1:43:5:.,. 2 7330 . T A 3 q10 NS=5;DP=12;AF=0.017 GT:GQ:DP:HQ 0|0:46:3:58,50 0|1:3:5:65,3 0/0:41:3
• 第三代测序
– 无需PCR实时测，读长更长，但通量低，准确性有待提 高
目标序列捕获测序
• 针对外显子组区域或用户定制的特定染色体区 域，主要检测目标区域内的点变异 • 目标序列捕获测序可用于家系研究，也可用于 较大样本量的病例-对照研究。对于已经完成 连锁分析的家系，可将疾病连锁区间及附近的 DNA区域或外显子序列进行捕获后进行测序 • 相比全基因组测序更加经济、高效，但由于捕 获技术本身的局限性，也不能100%检测所有 的外显子或SOLiD…）
加测/重测数据
质量差或 产量不足
质量评估(数据产量和质量)， 并去除低质量碱基 序列拼接组装（比对，去重，indel重 新比对，碱基质量重新计算）