酶在有序介孔材料上的固定化

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简介酶的固定化详解

生化制药
固定化酶的另一个巨大市场是用来生产工业、医学等领域的一些纯度要求较高的制剂。
固定化酶在环境保护中的应用
废水处理
生活污水和工业废水中有害成分主要是氯酚,将过氧化物酶大量吸附在磁石上,可以保证其100%的活力,并且比粗酶有了20倍以上的净化效果。因为可以对水中的氯酚选择性吸附。
酶的固定化研究展望
固定化的酸性蛋白酶可以将废胶卷上的明胶溶解,回收上面的银颗粒。
固定化碱性蛋白酶可以高效去除丝织品和棉织品纤维上的多余蛋白, 使织物柔软光滑。
固定化淀粉酶用于淀粉的糖化,可作为酒精和酿造发酵中原料的糖化剂。
固定化酶在生化制药中的应用
核酸蛋白质抗体
抗生素氨基酸
高纯度的蛋白酶
? 固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科
学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。
固定化酶的制备方法
酶的固定方法的介绍固定方法优缺点的比较酶的固定化的载体材料
固定化酶的制备方法
酶的固定方法
的活性功能基团形成化学共价健实现不可逆结合的酶固定方法。
固定化酶的制备方法优缺点比较
优点：酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。物理法缺点：由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。而且固定化酶的稳定性相对较低，容易脱落。
优点：稳定性高，不易脱落。
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? 目前,固定化酶技术已成为酶工程研究的重点和热点之一。
? 研究探索新的酶固定化技术 (如流体聚合包埋技术、纳米

漆酶在介孔分子筛MCM-41上的固定化研究

ＷＡＮＧＹａＺＨＥＧＸｕｈｎ，ＺＨＡＯＭｉｎ，Ｎ．ａｎ
（．ｐｒｍｅｔｆｐｉｄＣｈｍｉｒ，ｒｉｓｉｔｆｅｈｏｏｙＨａｂｎｌ００．ｉａ１ＤｅａｔｎＡｐｌｅｓｙＨａｂｎＩｔｕｅｏＴｃｎｌｇ，ｒｉ５０１Ｃｈｎ；ｏｅｔｎｔ
２．东北林业大学生命科学院，黑龙江哈尔滨１０４）５００
摘要：以介孔分子筛ＭＣ４Ｍ一１作为漆酶固定化的载体，采用物理吸附法进行固定化，考察了时间、ｐ和给酶量对Ｈ
固定化效果的影响，并对固定化酶的活性及其稳定性进行了研究，讨论了影响固定化过程和固定化酶性质的主要原因。
关键词：介孔分子筛；ＭＣＭ一ｌ４；漆酶；固定化
中图分类号：Ｑ５４５，Ｑ８４２１
文献标识码：Ａ
ＳｕｄｙｏｍｍｏｂｌａｉｎｏｃａｅＯｌＭｅｏｏｏｏｅｕａｅｅＭＣＭ－１ｔｆＩｉｉｔｏｆｚＬａｃｓｉｓｐｒｕｓＭｌｃｌｒＳｉｖ４
维普资讯
第２２卷第ｌ期２０年２月０８
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化
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学
报
Ｎｏｌ、０２，ｌ２
ＪｕｎａｅｉａｇｎｅｉｇｏｉｅｅＵｎｖｒｉｅｏｒｌＣｈｍｃｌｏｆＥｎｉｅｒｎｆＣｈｎｓｉｅｓｔｓｉ
Ｆｂ．
２０８０
文章编号：１０ —０５２０）１０８ —５０３９１（０８０ —０３０

介孔材料SBA-15固定化胰蛋白酶的研究

ｉｍｍｏｉｚｅｅｚｍｅｔｐｓｉｈｗａｓｅｌｄｉｅｃａｎｌｆＢＡ一５ｂｂｌｅｔｎｙｙｉｗｈｃｓｓｍｂｅｔｈｎｅｏＳｉｈｒｎａｎｈ１ｙｉｍｍｅｓｏｔｏ．ｈｆｅｔｆｍｍｏｉｚｔｎｃｎｉｏｓｒｉｎｍｅｈｄＴｅｅｃｓｉｏｂｌａｉｏｄｔｎｉｏｉｓｃｓｅｚｍｅｃｎｅｔａｉｎｐａｕｄｔｎｔｅａｓｒｅｍｏ￣ｏｎｙＢＡ一ｔｅｔｅｍａａｄｏｅａｉｎｌｔｂｌｉｆｈｕｈａｎｙｏｃｎｒｔ，ＨｖｌｅａｉｏｈｂｏｂｄａｕｏｎｍｅｆｚｍｅｉＳｅｎ１，ｈｒｌ５ｈｐｒｔａｓｉｔｓｏｅｎｏａｉｅｔｉｍｍｏｉｚｄｅｚｍｅｗｅｅｓｄｅ．ｄｔｅｂｓｅｚｍｅｃｎｅｔｔｎａｄｉｂｌｎｙｒｔｉｄＡｎｅｔｎｙｏｃｎｒｉｉｅｕｈａｏｎｍｍｏｉｚｔｎｔｒ／ｄ１，ｅｐｃｉｅｙｕｄｒｂｌｉｉｗｅｅ５ｍｇｍｌｉｏｍｅａｎａｈｒｓｅｔｌ，ｎｅ０ｖｗｈｃｈｂｏｂｄａｕｔｆｅｚｍｅｒａｈｄ２．／．ｔｗａｌｏｎｈｔｈｈｒａｄｏｅａｉｎｌｓｂｌｉｓｏｅｉｉｔｅａｓｒｅｍｏｎｎｙｅｃｅ３６ｍｇｇＩｈｏｓａｓｆｕｄｔａｅｔｅｏｔｍｌａｐｒｔａｔｉｔｆｈｍｍｏｉｚｄｎｏａｉｅｔｂｌｅｉｅｚｍｅｃｓｐｒｕｔｒｌＢＡ一ｓｓｏｏｂｏｄｓｐｏｒｍｍｏｉｚｔｎｏｎｙｒｉｈｒｔｎｔｏｅｏｅｆｅｅｚｍｅＳｌａｍｅｏｏｓｍａｅｉｈｔｒｉｏａＳ５ｗａｈｗｎｔｅａｇｏｕｐｒｆｔｏｉｂｌｉｆｉｏａ

介孔二氧化硅纳米粒子在生物吸附、酶固定、传递载体方面的应用

介孔二氧化硅纳米粒子在生物吸附、酶固定、传递载体方面的应用介孔二氧化硅纳米粒子（MSNS)为在治疗、药品和诊断中的广泛应用，提供了一种非侵入性（无创）和生物相容性的传输平台。

创建智能，刺激响应的系统，在局部的微妙变化的蜂窝环境都可能产生许多目前的药物/基因/DNA / RNA 的传递问题的长期解决方案。

此外，MSNs已经被证明在支持酶固定方面有很大的前途，使酶保留他们自己的活动，为在生物催化和能源方面的广泛应用提供了很大的潜力。

本文提供了一个全面的总结，在过去十年取得的进展，以及关于MSNs的可能应用作为生物大分子储存和传递的纳米容器。

我们讨论了一些关于在MSNs中生物大分子的吸附和释放的重要影响因素，以及这种纳米材料的细胞毒性方面的审查。

审查还强调了一些有前途的工作，即利用介孔二氧化硅纳米粒子的酶固定性。

1.介绍在过去几十年的深入研究和发展集中在发现新的治疗方法。

不幸的是，许多新药物是很难直接管理的，由于其在生物系统中的降解性。

随着纳米颗粒作为载体的使用，药物的毒性和副作用可以大大的降低，并且药物分子可以通过内吞作用转成不同的细胞。

这是与往往被采用仅仅通过大细胞（例如，巨噬细胞）或留在外面的靶细胞的微粒进行对比。

多种不同的纳米材料，例如双层氢氧化物（LDH）、脂质体和聚合物纳米粒子，已经被视为是生物大分子的控制和有针对性释放的传输工具。

介孔二氧化硅纳米粒子（MSNs）形成另一组重要的无机运载系统。

他们是理想的候选材料，是由于其形貌可控，有序结构和孔隙度，高水品的生物相容性以及以功能化。

自从在1992年发现了MCM-41s，新介孔二氧化硅材料的合成取得了快速的发展。

MSNs最著名和共同家族包括MCM- n,SBA-n（圣巴巴拉的无定形二氧化硅），MSU-n（密歇根州立大学二氧化硅），KIT-1（韩国技术研究所），IBN （生物工程与纳米技术研究所）和FDU-n（复旦大学）。

每个家族都有自己独特的优点和缺点，并已成功地使用在各种应用中。

酶固定化方法及载体特性

酶固定化一般方法及载体特性酶是重要的生物催化剂，具有专一性强、催化效率高、无污染、反应条件温和等特点，在制药、食品、环保、酿造、能源等领域都得到了广泛的应用。

但在实际应用中，酶也存在许多不足，如大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活，不够稳定；与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产；并且分离纯化困难，也会导致生产成本的提高等。

固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用的。

随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。

1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。

固定化酶技术为这些问题的解决提供了有效的手段，从而成为酶工程领域中最为活跃的研究方向之一。

1酶固定化的传统方法关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进，酶载体推荐创科催化酶载体树脂。

1.1 吸附法吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。

显著特点是：工艺简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。

但要求载体的比表面积要求较大，有活泼的表面。

1.2包埋法包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。

这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。

1)网格型将酶或包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。

也称为凝胶包埋法。

2)微囊型把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。

由于形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。

1.3结合法酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定的方法，叫离子键结合法。

酶固定化技术的最新研究进展

西安工程大学学报J o u r n a l o f X i a n P o l y t e c h n i c U n i v e r s i t y第38卷第1期(总185期)2024年2月V o l .38,N o .1(S u m.N o .185)引文格式:潘虹,陆天炆,王晓军,等.酶固定化技术的最新研究进展[J ].西安工程大学学报,2024,38(1):83-91.P A N H o n g ,L U T i a n w e n ,WA N G X i a o j u n ,e t a l .R e c e n t a d v a n c e s i n e n z y m e i mm o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g y [J ].J o u r n a l o f X i a n P o l y t e c h n i c U n i v e r s i t y,2024,38(1):83-91. 收稿日期:2023-08-06 修回日期:2023-10-21基金项目:陕西省自然科学基础研究计划项目(2021J Q -672㊁2022J Q -117);陕西省教育厅专项科研计划项目(22J K 0399) 通信作者:潘虹(1988 ),女,讲师,博士,研究方向为固定化酶和多孔水凝胶㊂E -m a i l :441595837@q q.c o m 酶固定化技术的最新研究进展潘虹,陆天炆,王晓军,洪一楠(西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048)摘要酶作为一种催化性能好且安全可靠的生物催化剂,在食品㊁医药及环境治理等诸多领域得到了广泛应用,但因受限于游离酶较差的环境稳定性而难以实现进一步的工业化应用㊂酶固定化技术有助于提高游离酶对敏感环境的耐受性和操作过程中的稳定性,大大缩减了应用成本㊂回顾了近五年内固定化技术的发展及现状,总结了吸附法㊁结合法等传统固定化方法,共固定化酶法等新型固定化方法,以及天然材料载体㊁复合材料载体和纳米载体等不同固定化载体在各个领域的研究进展㊂相比于游离酶,固定化酶体系在稳定性和重复使用性等方面得到了显著提升,但同时也存在一些不足,如固定后的活性回收率降低㊁载体合成途径繁琐且成本较高以及固定化酶作用机理尚不完善等㊂结合这些不足之处提出了酶固定化技术在未来的发展方向㊂关键词酶固定化;固定化载体;固定化方法;纳米载体;共固定开放科学(资源服务)标识码(O S I D )中图分类号:Q 814.2 文献标志码:AD O I :10.13338/j .i s s n .1674-649x .2024.01.011R e c e n t a d v a n c e s i n e n z y m e i m m o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g yP A N H o n g ,L U T i a n w e n ,WA N G X i a o ju n ,H O N G Y i n a n (S c h o o l o f E n v i r o n m e n t a l a n d C h e m i c a l E n g i n e e r i n g ,X i a n P o l y t e c h n i c U n i v e r s i t y,X i a n 710048,C h i n a )A b s t r a c t A s a n e f f i c i e n t a n d s a f e b i o c a t a l y s t ,e n z y m e s h a v e b e e n w i d e l y u s e d i n m a n yf i e l d s s u c h a s f o o d ,m e d i c i n e a n d e n v i r o n m e n t a lg o v e r n a n c e ,b u t i t i s d i f f i c u l t t o r e a l i z e f u r th e ri n d u s t r i a l a p-p l i c a t i o n d u e t o t h e p o o r e n v i r o n m e n t a l s t a b i l i t y o f f r e e e n z y m e s .E n z y m e i mm o b i l i z a t i o n t e c h -n o l o g y h e l p s t o i m p r o v e t h e t o l e r a n c e o f f r e e e n z y m e s t o s e n s i t i v e e n v i r o n m e n t s a n d t h e s t a b i l i t yd u r i n g o pe r a t i o n ,a n d g r e a t l y r e d u c e s t h e a p p l i c a t i o n c o s t .T h i s p a p e r r e v i e w s t h e d e v e l o pm e n t a n d c u r r e n t s i t u a t i o n o f i mm o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g yi n t h e p a s t f i v e y e a r s ,a n d s u mm a r i z e s t h e r e -s e a r c h p r o g r e s s o f d i f f e r e n t i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d s(i n c l u d i n g t r a d i t i o n a l i mm o b i l i z a t i o n m e t h-o d s s u c h a s a d s o r p t i o n m e t h o d a n d b i n d i n g m e t h o d a n d n e w i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d s s u c h a s c o-i mm o b i l i z a t i o n e n z y m e m e t h o d)a n d i mm o b i l i z a t i o n c a r r i e r s(i n c l u d i n g n a t u r a l m a t e r i a l c a r r i e r s, c o m p o s i t e c a r r i e r s a n d n a n o c a r r i e r s)i n v a r i o u s f i e l d s.I n g e n e r a l,c o m p a r e d w i t h f r e e e n z y m e s, t h e i mm o b i l i z e d e n z y m e s y s t e m h a s b e e n s i g n i f i c a n t l y i m p r o v e d i n t e r m s o f s t a b i l i t y a n d r e u s-a b i l i t y.H o w e v e r,t h e r e a r e s o m e s h o r t c o m i n g s,s u c h a s l o w e r r e c o v e r y r a t e a f t e r i mm o b i l i z a-t i o n,c u m b e r s o m e a n d c o s t l y c a r r i e r s y n t h e s i s p a t h w a y,a n d i m p e r f e c t m e c h a n i s m o f i mm o b i l i z a-t i o n e n z y m e.F i n a l l y,t h e d e v e l o p m e n t d i r e c t i o n o f t h e t e c h n o l o g y i n t h e f u t u r e w a s p u t f o r w a r d b a s e d o n t h e s e s h o r t c o m i n g s.K e y w o r d s e n z y m e i mm o b i l i z a t i o n;i mm o b i l i z a t i o n c a r r i e r s;i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d;n a n o c a r r i-e r s;c o-i mm o b i l i z a t i o n0引言生物酶是一类具有催化效率高㊁专一性强的生物催化剂[1],其本质是一种蛋白质㊂因此,生物酶通常需在常温常压等温和条件下才能表现出其高催化性能,当离开特定环境就会出现酶活性和稳定性迅速降低的缺点[2]㊂活性炭可以吸附蔗糖酶进行蔗糖水解,且保持了蔗糖酶较好的催化活性[3]㊂由此,固定化酶的思想被首次提出㊂随后,研究人员开始通过一系列酶固定化技术来改善游离酶存在的缺点㊂酶固定化技术就是指将游离酶通过一定的技术手段固定在某些不溶性载体上,进而使其在敏感环境下仍然表现出较高的稳定性和酶活性[4]㊂经固定化后的酶,可以借助载体的保护作用或者与载体之间相互作用,保护了酶蛋白的空间构象[5],进而提高了对p H㊁温度㊁重金属离子等影响因素的耐受性㊂同时,固定化酶可以通过简单的离心过滤等手段从反应体系中分离出来,促进漆酶的回收和重复使用[6]㊂目前,固定化酶技术已经在食品加工[7]㊁生物传感器[8]㊁纺织印染废水处理[9-10]㊁生物漂白[11]等诸多领域得到广泛的应用,其固定化技术也表现出愈发成熟的发展㊂本文综述了近五年酶固定化技术的发展,重点表现在固定化方法和固定化载体上,以及酶固定化技术在多个领域的应用㊂1酶固定化方法酶固定化方法可分为传统固定化方法和新型固定化方法㊂表1列出来近五年的一些酶固定化技术所用的方法㊂表1固定化酶所用固定化方法T a b.1I mm o b i l i z a t i o n m e t h o d s u s e d i n d i f f e r e n t i mm o b i l i z a t i o n t e c h n i q u e s固定化方法固定化对象载体材料参考文献传统固定化方法吸附法漆酶/α-淀粉酶生物炭/复合晶凝胶[12-13]共价结合法脂肪酶M I L-53(F e)/球形S i O2[14-15]化学交联法漆酶/葡萄糖淀粉酶磁性纳米粒/纳米S i O2[16-19]包埋法漆酶海藻酸铜微球[20]新型固定化方法吸附-交联法脂肪酶/β-葡糖糖苷酶大孔树脂/纳米S i O2[21-22]吸附-包埋法多种酶/纤维素酶多孔淀粉-阿拉伯胶微囊体/仿生S i O2[23-24]交联-包埋法漆酶聚集体介孔S i O2[25]脂肪酶/磷脂酶聚乙烯亚胺[26]共固定法葡萄糖淀粉酶/葡萄糖氧化酶S i O2[27]葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶磁性聚乙二醇微凝胶颗粒[28]1.1传统固定化方法1.1.1吸附法吸附法即物理吸附,物理吸附是一种简单易行的方法,通过氢键㊁疏水作用和范德华力等相互作用48西安工程大学学报第38卷使酶吸附到不溶于水的载体表面,该方法操作步骤简洁且不需要额外添加化学试剂,但其固定效果较差且容易受外界条件影响[29]㊂WA N G等采用吸附法将漆酶固定在碱改性生物炭(A-M B)上实现对孔雀石绿(MG)的吸附降解,结果表明,A-M B对MG 表现出最大吸附量757.58m g/g,固定化漆酶A/l a c @A-M B对MG的去除率可达97.70%,10次循环后仍然表现出超过75%的去除率[12]㊂A C E T等以沸石颗粒(P P A)为原料,通过简单方法制备了C u2+-A P P a C包埋型复合晶凝胶(C u2+-A P P a C)用于α-淀粉酶吸附固定,结果表明,α-淀粉酶最大吸附量可达858.7m g/g,同时相较于游离酶,其操作稳定性和存储稳定性也表现出明显的优势[13]㊂1.1.2结合法结合法是利用酶的侧链基团与载体表面的基团发生反应形成共价键,利用共价键将酶固定在载体上[30]㊂G H A S E M I等将M I L-53(F e)通过表面官能化对2种脂肪酶进行共价固定,结果显示脂肪酶固定化体系虽然没有实现对酶的高负载,但仍然表现出更广泛的温度和p H值稳定性,同时实现了酶的可重复使用能力和稳定性的显著改善[14]㊂此外,共价结合法由于化学键的形成,容易使酶的蛋白质构象发生改变,从而降低酶活性[31]㊂F A N等采用戊二醛多点共价结合法和吸附-交联法,以球形二氧化硅为载体,固定化皱纹假丝酵母脂肪酶(C R L),结果表明,多点共价处理后脂肪酶二级结构发生变化,使酶的残余活力下降[15]㊂但相比之下,共价结合法制备的酶体系具有更好的重复使用性和稳定性,使其在酸化油脂催化水解中更有潜力㊂1.1.3化学交联法交联法是通过一些双功能试剂将酶和载体进行连接[31],主要用到的交联剂有戊二醛㊁1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(E D C)㊁二醛淀粉和二醛纤维素[30,32-33]等㊂C H E N等以戊二醛作为交联剂制备了一种具有超顺磁性的固定化漆酶F e3O4@S i O2-N H2-L a c,该固定化体系表现出了良好的稳定性,对有机溶剂㊁金属离子有显著的耐受性和良好的循环使用性,同时在对酚类化合物的去除降解方面也表现出巨大的潜力[16]㊂Q I U等以二醛淀粉为交联剂,采用共价固定法将漆酶在离子液体改性的磁性纳米载体上进行固定,较于其他固定化漆酶,在处理含酚废水中表现出更大优势[17]㊂然而常见的交联剂在固定化过程往往会表现出一定的负面影响[34],为此研究人员着手发掘绿色安全的新型交联剂来避免这种负面影响㊂例如,O U Y A N G等提出了一种新的绿色高效固定化酶的方法京尼平苷酶解物作为交联剂固定化漆酶[18]㊂与直接使用京尼平或戊二醛作为交联剂,该方法绿色㊁安全,可应用于需要严格控制毒性的食品和医药行业㊂D A N I E L L I等研究了一种双功能交联剂2,5-二甲酰基呋喃(D F F)将葡糖淀粉酶固定在氨基官能化甲基丙烯酸树脂上[19]㊂使用海洋细菌费氏弧菌进行了生态毒性测定,相比于戊二醛,D F F表现出更低的生物毒性㊂1.1.4包埋法包埋法是将酶固定在聚合物材料的网格结构或微囊结构等多空隙载体中[35]㊂这种方法可以提供更好的保护和稳定性,限制了酶的扩散㊂但同时也存在孔隙的扩散阻碍,使得该方法的循环使用效率下降㊂例如,L A T I F等采用包埋法将漆酶固定化在海藻酸铜微球上进行双酚A的降解[20]㊂相比于游离酶,固定化漆酶表现出更高的p H㊁温度稳定性及储存稳定性,但在循环使用5次后剩余酶活降到了21.5%㊂1.2新型固定化方法1.2.1传统固定化方法的改进传统的单一固定化方法进行酶固定往往存在各自的缺点,因此出现了将单一方法进行两两结合来固定化酶的改进方法㊂常见的包括吸附-交联法[21-22]㊁吸附-包埋法[23-24]㊁交联-包埋法[25]等㊂例如,F A T H A L I等以介孔二氧化硅为载体,采用交联-包埋相结合的固定化方法制备了包埋交联漆酶聚集体(E-C L E A)[25]㊂相对于游离漆酶,条件优化后的固定化漆酶显示出较好的热稳定性和p H稳定性㊂此外E-C L E A存储21d仍然具有较高的相对活性,在重复使用20次后,其活性保持率可达初始活性的79%㊂对污染废水中苯酚的去除率可达73%[25]㊂1.2.2共固定化酶法共固定化酶是指将多种酶同时固定化在同一载体上的一种方法㊂A R A N A-P EÑA等实现了将5种酶进行逐层固定化的策略,使得整个固定化酶体系的活性明显增强[26]㊂与单一酶的固定化相比,共固定化酶法通常具有更大的优势㊂在保证了固定化后酶稳定性提高的同时,不同酶在共固定后,由于处于58第1期潘虹,等:酶固定化技术的最新研究进展同一载体上,酶之间可以发挥协同作用,且反应底物可以连续在酶之间传递,从而简化了反应步骤㊂G A O等制备了一种化学酶级联反应体系(G A&G O x@A u-S i O2),实现葡萄糖淀粉酶(G A)和葡萄糖氧化酶(G O x)共固定化[27]㊂借助于双酶和载体之间的级联效应,实现了从可溶性淀粉中高效提取葡萄糖酸㊂在保证了固定化双酶稳定性的同时,A u的加入可以使中间产物H2O2快速脱除,显著提高固定化体系的重复利用率㊂类似地,L I U等制备了一种具有可逆热响应释放的双酶固定化体系共固定G O x和辣根过氧化物酶(H R P),在葡萄糖浓度检测过程中表现出优于单酶检测试剂盒的良好性能[28]㊂此外,有学者研究发现,对于如漆酶这种绿色催化剂,较低的氧化还原电位大大限制了其在各个领域中的应用㊂但发现在固定化体系中引入具有高氧化还原电位的介体可以弥补漆酶的这一不足[36]㊂L O U等基于MO F s膜实现了漆酶和介体A B T S的共固定化,结果显示,固定化漆酶的底物亲和力要高于游离漆酶[37]㊂2酶固定化载体用于酶固定化的载体主要包括天然载体㊁人工合成载体和纳米载体,见表2㊂在选择固定化载体时要充分考虑具体的应用领域和需求等㊂表2固定化酶所用载体材料T a b.2 C a r r i e r s f o r i mm o b i l i z e d e n z y m e材料类别载体材料固定化对象固定化方法参考文献天然材料羧甲基纤维素漆酶包埋法[38]琼脂糖脂肪酶吸附法[39]磁性壳聚糖葡萄糖氧化酶共价结合法[40]藻酸盐脱氢酶/蛋白酶吸附法/包埋法[41-42]壳聚糖-黏土复合微球漆酶+介体包埋法[43]海藻酸钠-壳聚糖中性蛋白酶包埋法[44]人工合成材料改性二氧化硅乳酸脱氢酶/碳酸酐酶/甲酸脱氢酶化学交联法/共价结合法[45-47]二氧化钛漆酶吸附法[48]硅酸盐漆酶/葡萄糖氧化酶吸附-共价结合法/吸附法[49-50]氧化铝漆酶共价结合法[51]聚酰胺-胺树枝状大分子脂肪酶化学交联法[52]聚乙烯醇水凝胶-硅胶烯还原酶包埋法[53]二氧化硅-壳聚糖漆酶共价结合法[54]纳米材料磁性纳米粒子漆酶共价结合法[55]金属有机框架MO F s漆酶化学交联法[56]介孔Z I F-8过氧化物酶化学交联法[57]中空微球漆酶吸附法[58]共价有机框架C O F葡萄糖氧化酶+F e3O4吸附法[59]金属酚醛网络M P N酒精脱氢酶吸附法[60]磁性纳米颗粒漆酶+介体A B T S吸附法[61]2.1天然载体材料天然载体最大的优点就是来源广泛㊁低成本和低生物毒性㊂常用的天然载体有纤维素[38]㊁琼脂糖[39]㊁壳聚糖[40]和藻酸盐[41-42]等㊂同时,将天然载体杂化后用于酶固定化可以表现出更优良的固定化能力㊂M E H A N D I A[43]等利用天然载体制备了壳聚糖-黏土复合微球(C C B-L),采用包埋法对漆酶和介体进行共固定㊂微球在洗涤和储存期间均未观察到酶泄漏㊂同时固定化漆酶-介体体系通过填充床反应器系统(P B R S),对纺织废水的脱色率可达78%,C O D㊁B O D以及毒性水平均下降㊂类似地, B A I等将海藻酸钠和壳聚糖交联形成复合凝胶球,采用包埋法固定中性蛋白酶[44]㊂固定化酶在较宽的p H(5~8)和温度(30~80ħ)范围表现出高于游离酶的相对活性,循环使用性和存储稳定性也保持在良好水平㊂68西安工程大学学报第38卷2.2人工合成载体材料2.2.1无机材料无机材料来源广泛㊁合成简单㊁机械强度高,可以直接用于酶的固定㊂常见的无机材料有二氧化硅[45]㊁二氧化钛[48]㊁硅酸盐[49-50]和氧化铝[51]等㊂为了提高固定化效率,常常会先对无机材料进行表面改性再用于固定化㊂Z H A I等使用聚乙烯亚胺(P E I)和多巴胺的共沉积对二氧化硅微球进行改性,用于C O2酶促转化甲酸盐㊂优化后P D A/P E I-S i O2载体使得甲酸盐合成的初始反应速率从13.4倍增加至27.2倍㊂再通过固定化碳酸酐酶(C A)后,甲酸盐的合成速率增加到48.6倍[46]㊂随后,L I U等同样对S i O2微球进行P E I的表面改性后用来固定化甲酸脱氢酶,同样实现了C O2酶促转化甲酸盐的高效合成[47]㊂2.2.2高分子材料人工合成的高分子材料具有良好的结构刚性和其他优良的力学性能㊂如聚酰胺㊁聚乙烯醇等具有良好的固定化能力㊂Z H A O等采用3种胺类试剂将聚酰胺-胺树枝状大分子(P AMAM)接枝到F e3O4纳米粒子上,利用戊二醛作为交联剂得到了不同代数的F e3O4@S i O2/P AMAM磁性纳米载体[52]㊂固定化酶表现出相对游离酶更高的活性,而且改善了其在更宽的p H和温度范围内的耐受性㊂A L A GÖZ等先用聚乙烯醇水凝胶包裹烯还原酶(E R),再固定到氨基官能化的硅胶上㊂包埋后的E R比游离E R的热稳定性高34.4倍㊂在重复使用10次后,固定后的E R仍保持其初始活性的85%[53]㊂2.2.3复合材料针对有机㊁无机材料在实际应用中存在的不足,不少文献报道了将2类材料通过物理或化学手段进行复合得到新型复合材料,可以得到性能更优的固定化载体㊂例如,G I R E L L I等将二氧化硅和壳聚糖杂化得到复合材料,相比单材料拥有更好的机械强度㊁热稳定性及生物相容性㊂存储30d后仍具有大于70%的相对活性㊂对漆酶进行固定化后,固定化率达到92%,在较宽的温度和p H范围内固定化后漆酶表现出的稳定性也要高于游离漆酶,重复循环利用15次剩余活性仍在61%以上[54]㊂2.3纳米材料载体纳米材料凭借其小尺寸㊁高表面积和易改性等特点,成为了酶固定化载体研究的焦点㊂各种改性后的纳米材料也在酶固定化领域得到蓬勃发展㊂2.3.1磁性纳米载体磁性纳米载体是一种可以通过外部磁场实现固定化酶快速分离的良好材料㊂凭借这种磁学性质和低生物毒性[16],其在固定化载体的选择上表现突出㊂F e3O4是被广泛使用的一种磁性材料㊂但由于纯F e3O4自身的表面惰性和高团聚,往往需要对其进行表面改性后再应用于固定化㊂R A N等制备了一种壳核结构的磁性纳米载体F e3O4@M o S2@P E I 用于漆酶固定㊂在二硫化钼(M o S2)和聚乙烯亚胺(P E I)的修饰下,磁性载体拥有较大的比表面积并减弱了自身团聚效应,对漆酶的负载量可达120m g/g,酶活回收率可达90%,同时对于水中持久性致癌有机污染物也表现出了良好的降解效率[55]㊂2.3.2介孔纳米载体介孔材料作为一种多孔材料,凭借多孔结构和大的比表面积,也是酶固定化的理想载体㊂金属有机框架(MO F s)[56]凭借着可调控的孔径和较大的比表面积在酶固定化方面得到广泛应用㊂L I等采用水热法合成氨基官能化的MO F材料制备固定化漆酶,在最优条件下实现了95%的刚果红去除率,6次循环后降解率仍达到84.63%[56]㊂L U等以酵母为生物模板,将Z I F-8自组装到酵母上得到杂合Y@ Z I F-8,再用交联剂固定过氧化物酶得到Y@Z I F-8 @t-C A T㊂固定化酶的温度㊁p H耐受性得到提高,更值得一提的是固定化酶在存储45d后活性仍保持在99%以上[57]㊂除此以外,T A N G等还制备了具有中空结构的共价有机骨架微球(H-C O F-OM e)[58]㊂这种孔缺陷的中空结构有助于加快反应物的扩散,从而改善催化反应过程,对四环素具有优秀的降解效果㊂2.3.3金属纳米载体金属纳米材料由于引入了金属离子,可以提高载体的理化性质,在酶固定化过程中表现出重要作用㊂F U等将F e3+/F e2+固定到纳米花形的共价有机框架(C O F)中实现了固定化酶的磁分离[59]㊂L I 等研究了以磁性F e3O4为核,将单宁酸(T A)与不同类型金属离子(C u㊁F e㊁Z n㊁M n㊁A u)配位获得了用于固定化的金属酚醛网络(M P N)涂层[60]㊂不同金属离子的不同极化能力对M P N涂层的亲水性和疏水性造成影响,从而给酶的固定化效率㊁催化活性78第1期潘虹,等:酶固定化技术的最新研究进展和稳定性带来影响㊂对于漆酶而言,引入C u2+对漆酶的活性中心具有正向的促进作用,可以大大提高固定化漆酶的催化活性和底物亲和力[61]㊂3结论与展望生物酶作为一种极具潜力的生物催化剂,通过固定化技术使其在污染物的降解㊁食品加工㊁生物传感器等诸多领域得到了广泛应用㊂酶固定化技术促使酶在较宽的p H值和温度范围下表现出更优良的催化活性,大大提高了生物酶在敏感环境下的稳定性,实现了生物酶的可分离性及循环使用性㊂但目前看来,酶固定化技术依然存在一些不足㊂1)酶在固定化后,由于载体的存在使得底物扩散受阻,无法与酶充分接触,导致酶活性降低㊂可以通过基因工程技术从酶本身出发,利用定点突变或基因重组改变酶结构来提高酶活㊂同时,通过掺杂合适的单一过渡金属离子或多金属离子协同作用激发酶活也值得深入研究㊂2)目前固定化酶技术在污染物降解等领域的实际应用已经颇为成熟,但对于更深层次的作用机制还停留在较为浅薄的层面㊂在未来,随着生物信息技术的不断发展,将固定化酶技术与计算机模拟技术交叉,利用计算机软件模拟分析更深层次的机制原理,可以更好地掌握酶固定化技术㊂3)酶固定化技术仍处在实验室研究阶段,在实现更大规模的工业化应用仍然存在较大的挑战㊂同时,考虑到有些固定化载体制备的时间成本和资金成本,载体若仅用于一次固定化后就无法回收再利用就会造成过度浪费㊂如何实现固定化酶失活后固定化载体与酶的高效分离,从而实现载体的循环使用是一个新的挑战㊂因此,酶固定化技术仍然处在不断发展进步的阶段,需要更多的科研者来完善研究㊂参考文献(R e f e r e n c e s)[1]刘茹,焦成瑾,杨玲娟,等.酶固定化研究进展[J].食品安全质量检测学报,2021,12(5):1861-1869.L I U R,J I A O C J,Y A N G L J,e t a l.A d v a n c e s o f e n-z y m e i mm o b i l i z a t i o n[J].J o u r n a l o f F o o d S a f e t y&Q u a l i t 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硅基介孔材料为载体的酶固定化和刺激敏感的缓释体系

硅基介孔材料为载体的酶固定化和刺激敏感的缓释体系硅基介孔材料具有较大的比表面积、孔容和均一可调的孔径，并且其活性表面有利于进行官能团修饰，使其在酶固定化研究和药物缓释方面具有独特的优势。

固定化酶可以应用于生物传感和生物催化等领域。

介孔二氧化硅纳米粒子兼具纳米材料和介孔材料的双重特性，在构建先进的纳米尺度药物缓释体系中具有独特的应用潜力。

本学位论文研究了周期性介孔有机氧化硅材料作为载体的酶固定化、介孔二氧化硅薄膜担载酶分子制备的生物传感器和介孔二氧化硅纳米粒子构建的刺激敏感缓释体系：1.选择了周期性介孔有机氧化硅材料作为酶固定化的载体，考虑到目标蛋白中铁卟啉基团的疏水性，将疏水性苯基基团引入到介孔有机氧化硅载体中，设计并成功合成了一系列苯基含量不同的介孔有机氧化硅载体，研究了该系列载体对血红素类蛋白的固定化能力。

实验结果表明，该系列含苯基的载体表现了优异的血红素类蛋白固定化能力，载体对辣根过氧化物酶、血红蛋白和肌红蛋白的固定量分别为35mg g-1、244mg g-1和74mg g-1，其中载体对肌红蛋白的固定量可达到99%以上。

载体中苯基基团与血红素类蛋白疏水结构域之间的疏水作用是提高载体对于此类蛋白固定化能力的关键因素。

具有较强疏水性的MOS10担载的辣根过氧化物酶（HRP）的活力高于HRP原酶分子的活力。

此外，基于HRP-MOS10修饰的玻碳电极对于邻苯二酚具有明显的电化学响应，表明该类载体固定的HRP具有一定的应用可能性。

2.将固定化酶应用于苯酚类化合物的电化学检测，使用生长在铟锡氧化物（ITO）表面并担载了HRP的介孔二氧化硅薄膜（MSF）作为电极，利用HRP的催化性质对苯酚类化合物进行电化学检测。

实验结果表明HRP/MSF@ITO对苯酚、邻苯二酚、对苯二酚、间苯二酚均具有良好的电化学响应，检测限依次为0.12μM、0.08μM、0.24μM和0.004μM。

敏感度分别为47nA μm-1、75nAμm-1、15nA μm-1和146nAμm-1。

《酶的固定化》课件

稳定性等
稳定性评估可以帮助选择合适的固定化方法，提高酶的
固定化效果
稳定性评估还可以帮助优化固定化酶的生产工艺，降低
生产成本
固定化酶的使用寿命
固定化酶的稳定性：在固定化过程中，酶的活性和稳定性得到提高
固定化酶的寿命：固定化酶的寿命通常比游离酶长，可以延长酶的使用寿命
固定化酶的再生：固定化酶可以通过再生技术恢复活性，延长使用寿命
添加标题
酶的固定化可以减少污染，提高环保性能
酶的固定化可以简化生产工艺，提高生产效率
酶的固定化未来发展展望
新技术的开发与应用
酶固定化技术的发展：从传统的物理吸附到新型的化学键合新型酶固定化技术的应用：在生物催化、生物制药、环境保护等领域的应用酶固定化技术的挑战：如何提高酶的活性和稳定性，降低成本酶固定化技术的未来：开发新型酶固定化材料，提高酶的固定化效率和稳定性，拓展应用领域
酶的固定化应用
环境保护：酶的固定化可以用于污水处理、废气处理等领域
生物催化：酶的固定化可以提高反应速率和选择性
食品加工：酶的固定化可以用于食品加工，如酿酒、制糖等
医药工业：酶的固定化可以用于药物合成、药物分析等领域
酶的固定化技术
吸附法
原理：利用酶与载体之间的物理或化学作用力，使酶固定在载体上优点：操作简单，成本低，固定化效果好缺点：酶活性易受载体影响，固定化后酶活性降低应用：广泛应用于生物催化、生物制药等领域
提高固定化酶的稳定性与活性
改进固定化技术：提高酶的固定化效率和稳定性
优化酶分子结构：提高酶的活性和稳定性
筛选和优化固定化载体：提高酶的固定化效率和稳定性
研究酶的固定化机制：为提高酶的稳定性与活性提供理论支持

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CPCI 中国石油和化工
化工设计
酶在有序介孔材料上的固定化
焦志勇
（南京工业大学　江苏南京　211800）
摘要：目前，对酶在有序介孔材料上的固定化研究取得了巨大进步，研究人员通过对酶在有序介孔材料上固定化的研究，发现了各种方法的优缺点及其在实践中的应用。

这对石油的开采和利用具有重要的意义。

具体分析石油受有序介孔材料固定化酶的活性及因素的影响，并分别讨论了这些因素，以促进酶在有序介孔材料上固定化的发展，进一步挖掘固定化酶潜在的应用价值，使之最大限度地为现代化石油工业服务。

关键词：有序介孔材料石油酶固定化
1 酶固定化的意义
酶广泛应用于各种领域，它是一种生物催化剂，具有很高的专一性。

需在温和的条件下反应，具有很高的催化效率。

但因游离酶自身的特点，其应用容易受到限制。

它具有难以回收、稳定性差、不易循环利用和易混入产品等特点。

经过实践表明，酶固定化后，酶的热稳定性和PH 稳定性会大大提高，在各种领域被广泛应用。

因此，对酶在有序介孔材料上的固定化研究具有重要的现实意义，且发展前景广阔。

2 酶在有序介孔材料上的固定化概括
近几年，酶在有序介孔材料上的固定化有很多载体，常见的有：天然产物、凝胶、分子筛及树脂等。

在物理和化学性质上面，无机载体比有机载体具有较大的优势。

有序介孔材料是一种无机材料，具有很多优势，例如：它具有可以调变的孔径，化学稳定性高，成本低等特点。

被广泛应用于各行各业。

有序介孔材料的发现，使它作为一种新的载体，在酶的固定化方面具有很大的发展前景。

3 酶在有序介孔材料上的固定化方法
目前，酶在有序介孔材料上的固定化方法主要有3种，分别为：化学键合法、包埋法和直接物理吸附法。

3.1 化学键合法
有机集团能够在温和条件下，在载体表面上与酶反应，这是化合键合法固定化酶的前提。

其中有机集团可以是：乙烯、羧基、氨丙基和环氧基等。

通过后嫁接法和共聚合法这两种方法可以在有序介孔材料表面引入有机集团。

后嫁接法的特点是：对有序介孔材料表面的修饰不均匀，外表面上有大量的修饰基，因此，将大量的酶固定到载体外表面上及孔道口处，会使更多的酶受到阻碍，不能进入有序介孔材料的孔道。

化学键合法固定化酶的优点是：固定化酶的操作稳定性大大提高了。

有序介孔材料化学键合法固定化酶经过修饰后，对尺寸有一定的选择性。

3.2 包埋法
包埋法是指在有序介孔材料的孔道内部吸附酶分子，使孔口尺寸改变，且小于酶分子直径，从而达到在有序介孔材料孔道内将酶包埋在的目的。

这种方法的使用，可以有效避免物理吸附方法中酶的脱落。

生物学家在缓冲剂溶液中放入MCM-41及胰蛋白酶，使酶吸附在载体上，在分离载体及溶液后，继而进行硅烷化修饰，修饰用的酶为3-氨丙基三乙氧基硅烷。

这种方法的目的是减少孔口直径，使酶很难从载体孔道内流出。

经过研究发现，包埋法能够避免酶分子从孔道内流出，但对酶而言，由于硅烷化反应条件剧烈，酶会失去活性。

此外由于有序介孔材料的孔道口直径减小，反应产物及底物出入孔道受到限制，从
而降低了固定化酶的活性。

3.3 直接物理吸附法
直接物理吸附法是指：将有序介孔材料和酶溶液充分接触，在载体上吸附到酶。

这由于它主要依靠载体与酶之间的范德华力和静电吸引力，酶的结构不易受到影响，且不易破坏酶的活动中心和高级结构。

因此，这种方法使酶的活性不易损失。

但是，因为有较弱的酶固定化作用力，所以当温度、溶液离子强度和PH 值、及剧烈搅拌等条件改变时，酶分子很容易从有序介孔材料的载体上脱落。

通过对直接吸附在纯硅和SBA-15上胰蛋白酶的研究发现，酶极易从载体上脱落，在缓冲液中搅拌2小时后，有32%-35%的酶会脱落。

对酶在有序介孔材料上的直接物理吸附法的研究表明，酶的直接物理吸附对尺寸有一定的选择性。

在有序介孔材料SBA-15上固定化粗脂肪酶，粗脂肪酶中含有脂肪酶和蛋白酶，最终发现在SBA-15上有90%的脂肪酶被吸附，但在载体上吸附的蛋白酶量仅为20%。

此外，酶吸附在有序介孔材料孔道内，可以使酶的稳定性提高。

酶只有进入介孔材料的孔道内部，介孔分子筛的大孔容积和大比表面积才能被酶有效地利用。

因为酶的吸附形式和吸附速度对酶的固定化效率有很大的影响，所以应加大对酶的吸附形式和速度的研究。

3.4 酶的其他固定化法
这种方法主要是将其他一些新型的固定化法与以上3种固定化方法结合起来。

例如冷冻真空吸附法及先吸附再交联的方法等。

冷冻真空吸附法与普通的方法相比，使固定化酶在载体上具有较高的吸附量、稳定性及活性。

先吸附再交联的方法能有效地阻止酶从分子筛孔道内流出来，固定化酶不会因为溶液的剧烈搅动，而改变其活性。

4 总结
对有序介孔材料上的固定化酶的研究，大大提高了对石油的开采和利用效率。

在石油、医药等方面具有广阔的发展前景，对我国的经济发展将产生重要影响。

我们应加大对这种技术的研究，使它广泛应用于各种领域。

有序介孔材料上的固定化酶在石油领域具有重要的研究价值。

另一方面，因为载体与酶之间有多种相互作用力，这些作用力的有效利用，能提高载体上生物酶的附着力，从而使固定化酶的稳定性大大提高，在石油的开采和利用方面能起到举足轻重的作用。

参考文献：[1] 许云强，有序介孔材料对脂肪酶的固定及对药物控释的研[J]山东轻工业学院学报.2009
[2] 田修营，何文，赵洪石等.介孔材料的研究进展及应用前景[J].山东轻工业学院学报.2008.。