酶工程制药常用技术及应用

酶工程制药常用技术及应用

酶是由生物体活细胞产生的具有催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。绝大多数酶的化学本质是蛋白质。具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。酶作为一种生物催化剂，已广泛地应用于轻工业的各个生产领域。近几十年来，随着酶工程不断的技术性突破，在工业、农业、医药卫生、能源开发及环境工程等方面的应用越来越广泛。

酶工程就是将酶或者微生物细胞，动植物细胞，细胞器等在一定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。它包括酶制剂的制备，酶的固定化，酶的修饰与改造及酶反应器等方面内容。酶工程的应用，主要集中于食品工业，轻工业以及医药工业中。

一、酶工程制药的基本技术

现代酶工程制药的基本技术主要包括酶和细胞的固定化、酶的化学修饰、酶法的手性药物合成技术等。

1.酶和细胞的固定化技术

酶本身还是溶于水的，只是是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶在水中溶性凝胶或半透膜的微囊体从而导致流动性降低。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产，但是活性降低，使用范围减小，技术还有发展空间。固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。酶和细胞的固定化方法有：吸附、共价结合、包埋、选择性热变性、光照、辐射和定点固定化技术等，在制药工业中，包埋法应用较多，其次为吸附法。

固定化细胞包括微生物细胞（包括基因工程菌）、动物和植物细胞。植物细胞固定化一般采用包埋法，在中药有效成分的应用上具有广阔的前景，至今研究成功的固定化植物细胞有固定化南洋金花、烟草、胡萝卜等10多种。动物细胞有固定化主要用吸附法和包埋法，目前动物细胞微囊化固定法使其研究的热点，动物细胞有固定化技术现已成功应用于药物药物筛选模型、单克隆抗体、白细胞

介素、干扰素等药物的生产过程。利用固定化酶或细胞构建固定化的基因工程菌或基因工程细胞生产大批量的蛋白质类药物是酶工程制药的发展方向。

2.酶的化学修饰技术

酶的化学修饰是利用化学手段将某些化学物质或基因结合到酶分子上，或将酶分子的某些部分删除或置换，从而改变酶的理化性质、进而达到改变酶的催化性质的目的。酶的化学修饰常用的修饰剂主要有乙酸酐、磷氧酰氯、环氧丙烷、氮芥、重氮盐类、羟胺等。修饰酶的功能集团有氨基、羟基、咪唑基等可解离集团。酶修饰的方法主要有：①双功能试剂交联的方法，利用某些双功能试剂分子两端的功能集团可使酶分子内部分子间肽链的两个游离氨基分别发生交联，即双功能试剂交联的方法；②高分子结合法，酶于高分子化合物结合后，可增加酶的稳定性和活力，及高分子结合法，如抗白血病药物天冬酰胺经游离氮酰化反应修饰后，起高了在血浆中的稳定性。

3.酶的手性药物合成技术

酶的手性药物合成技术主要包括酶催化不对称合成及外消旋体的不对称拆分技术。手性药物的酶合成所用的酶主要有蛋白水解酶、脂肪水解酶、氧化还原酶、纤维素酶、糖苷酶、淀粉酶等。主要的酶法手性药物合成反应的类型有水解、酰化、氧化、酯交换、氨解、环氧化、羟化、还原、磺化反应等。酶的手性药物合成技术已成功应用于氨基酸、非甾体抗炎药、5-羟色胺颉砊物、?-阻断剂和摄取抑制剂、阿巴卡韦等手性药物的大规模生产中。由于酶的手性药物合成技术具有反应条件温和、催化效率高和专一性强等优点，利用生物催化或生物转化等方法来生产手性药物已成为当今生物技术的发展方向。

二、酶工程技术在制药工业中的应用

酶在制药工业中的作用主要是催化前体物质转化为药物，另外固定化酶膜或者酶管也广泛应用于制药过程的参数检测与测量，特别是生物制药过程。下面以几个典型的应用为例进行叙述。

1.青霉素酰化酶在新型抗生素生产中的应用

青霉素酰化酶能以青霉素或头孢霉素为原料，可以分别在青霉素的6位或者头孢霉素的7位催化酰氨键的形成与断裂。典型的应用顺序为首先催化青霉素或头孢霉素酰氨键的断裂，获得半合成抗生素的直接底物6-氨基青霉烷酸(6-APA)

或7-氨基头孢霉烷酸(7-ACA)；然后在其他酰基供体存在的条件下催化形成新的酰氨键，从而获得具有全新侧链的新型抗生素。

天然发酵生成的青霉素有两种，一为青霉素G，另一为青霉素V。通过青霉素酰化酶催化下进行酰基置换反应，用新的酰基供体置换苯乙酰基，则可以获得许多新型的半合成青霉素。比如用α氨基苯乙酰置换原来的苯乙酰基，可以获得氨苄西林。羟氨苄西林、羧苄西林和磺氨苄西林等也都是采用酶催化半合成的方法通过青霉素的酰基置换反应获得的。

天然发酵生成的头孢霉素是头孢霉素C，头孢霉素C在青霉素酰化酶催化下，首先水解生成7-ACA，再与侧链羧酸衍生物反应形成各种新型头孢霉素。例如：头孢利定、头孢噻吩、头孢氨苄等。

2.酶应用于生物大分子

由于中草药多来源于植物，即药源植物。但只有这些植物中的一些特定小分子成分，才是其中的药效成分。中草药制剂提取就是将这些有效成分从植物整体或者器官中提取出来，并结合辅料，制备成适合保存、运输和服用的药物。这个过程的第1步就是中草药药材的粉碎提取，由于植物中纤维素的存在，使得药材的粉碎难度加大。一个可行的方案是采用纤维素酶降解纤维素，形成可溶性单糖，从而提高其溶解度降低黏度。但由于纤维素酶价格较高，目前该应用还限于实验室研究阶段。

另外利用纤维素酶降解农作物秸秆中的纤维素形成可被微生物利用的可溶性单糖，可以使得生物质能系统中的微生物利用原来难以利用的纤维素作为碳源进行发酵，从而提高产能效率。

3.固定化酶在生物传感方面的应用

生物传感器是用生物活性材料(酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜等)与物理化学换能器有机结合的一门交叉学科，是发展生物技术必不可少的一种先进的检测方法与监控方法，也是一种物质分子水平的快速、微量的分析方法。在未来21世纪知识经济发展过程中，生物传感器技术必将是介于信息和生物技术之间的新增长点，在国民经济中的临床诊断、工业控制、食品和药物分析(包括生物药物研究开发)、环境保护以及生物技术、生物芯片等研究中有着广泛的应用前景。其原理为：待测物质经扩散作用进入生物活性材料，经分子识别，发生

生物学反应，产生的信息继而被相应的物理或化学换能器转变成可定量和可处理的电信号，再经两次仪表放大并输出，便可知道待测物浓度。

生物传感器具有以下共同的结构：包括一种或数种相关生物活性材料(生物膜)及能把生物活性表达的信号转换为电信号的物理或化学换能器(传感器)，两者组合在一起，用现代微电子和自动化仪表技术进行生物信号的再加工，构成各种可以使用的生物传感器分析装置、仪器和系统。其中固定化酶膜是采用最多的生物膜。

生物传感器采用固定化生物活性物质作催化剂，价值昂贵的试剂可以重复多次使用，克服了过去酶法分析试剂费用高和化学分析烦琐复杂的缺点。另外，生物传感器还具有其他特点：①专一性强，只对特定的底物起反应，而且不受颜色、浊度的影响。②分析速度快，可以在1min内得到结果。③准确度高，一般相对误差可以达到1％。④操作系统比较简单，容易实现自动分析。⑤成本低，在连续使用时，每例测定仅需要几分钱人民币。⑥有的生物传感器能够可靠地指示微生物培养系统内的供氧状况和副产物的产生。在生产控制中能得到许多复杂的物理化学传感器综合作用才能获得的信息。同时它们还指明了增加产物得率的方向。研制的生物传感器已广泛应用于体育、工业发酵等行业。截止到1998年年底，共推广了200多台套，创经济效益达600多万元。通过生物传感器的推广应用，提高了我国运动员的训练水平，给谷氨酸发酵行业创造了上亿元的经济效益。

目前重组蛋白药物、抗体、疫苗等生物药物都来源于发酵过程，而发酵过程的监控是实现发酵过程最优化的前提。目前应用最成功的生物传感器都是利用固定化酶催化原理实现信号转换，从而实现发酵过程参数的测量。

应用最早的葡萄糖传感器就是采用固定化葡萄糖氧化酶的生物膜作为活性材料，在有氧气存在的情况下，当样品中的葡萄糖组分接触到固定在膜上的葡萄糖氧化酶时，就被转化为过氧化氢和葡萄糖酸。产生的过氧化氢可以通过电化学的方法通过氧电极进行准确的测量。由于葡萄糖的浓度和经酶催化产生的过氧化氢浓度之间存在线性关系，所以可以通过氧电极作为换能器将过氧化氢浓度转化为电信号，从而通过电信号的强弱来表示样品中葡萄糖的浓度。具体操作是首先利用标准葡萄糖溶液建立校正曲线，由于该设备线性程度非常好，只需要采用两个标准葡萄糖溶液即可。

利用相同的原理，采用其他氧化酶替代葡萄糖氧化酶，可以用于乳酸、谷氨酸、乙醇、次黄嘌呤、肌苷、尿素和胆碱等测量。

三、小结

现在已知的酶的酶有几千种，但是还远远不能满足人们对酶日益增长的需要。随着科技的发展，人们正在发现更多、更好的酶。其中，令人瞩目的有核酸酶和抗体酶、端粒酶、糖生物学和糖基转移酶和极端环境微生物和不可培养微生物的新酶种，此外，新的固定化、分子修饰和非水相催化等技术越来越受到人们关注。伴随着人类基因组计划取得的巨大成果，基因组学和蛋白质组学的诞生，生物信息学的兴起，以及DNA重排技术的发展，预期在不久的将来，众多新酶的出现将使酶的应用达到前所未有的广度和深度。可以预计,随着各种高新技术的广泛应用及酶工程研究工作的不断深入,酶工程研究和酶制剂工业必将取得更快、更大的发展。

参考文献

[1]吴剑波.微生物制药--现代生物技术制药丛书[D].化学工业出版社2002.

[2]张林生.生物技术制药[D]. 科学出版社,2008.

[3]郭勇.酶工程[D]. 科学出版社,2009.