精氨酸激酶(AK)的表达及其纯化--

精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化报告题目精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化作者姓名景书婷班级学号0802/2008114010216指导教师汪劲松完成时间2011年8月生物学实验教学中心目录引言 (2)1 实验试剂与实验仪器 (3)1.1实验材料与实验试剂 (3)1.2实验仪器 (3)2 实验方法 (4)2.1活化菌种 (4)2.2扩大培养 (4)2.3 IPTG诱导AK的表达 (4)2.4蛋白质提取 (4)2.5 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (4)2.6 AK的检测 (5)3 结果与分析 (6)3.1蛋白质His-tag Ni亲和层析法纯化的层析谱图 (6)3.2 AK经纯化后的SDS-PAGE电泳图谱 (7)总结 (8)参考文献 (9)精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化景书婷（指导老师：汪劲松）（湖北师范学院生命科学学院生物科学0802班湖北黄石435002）摘要：精氨酸激酶(Arginine kinase, AK）（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）是无脊椎动物细胞代谢中的磷酸激酶，它将ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸和ADP，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用。

本文中首先对转入精氨酸激酶基因的质粒的菌种进行活化和扩大培养，然后加入400mM/L的IPTG 65ul，在温度为37℃下来诱导精氨酸激酶基因在大肠杆菌中表达，通过His-tag Ni亲和层析技术分离纯化精氨酸激酶,经过SDS-PAGE电泳检测得到良好的重组的精氨酸激酶基因的表达及纯化效果，为进一步研究其分子结构、生理功能奠定基础。

关键词：精氨酸激酶亲和层析分离纯化电泳精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化景书婷（指导老师：汪劲松）（湖北师范学院生命科学学院生物科学0802班湖北黄石435002）引言精氨酸激酶（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）是磷酸原胍基化合物激酶的一种，主要存在于无脊椎动物体内，是细胞能量代谢中非常关键的的磷酸激酶。

[1][2]它的作用是催化可逆反应，将ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，从而形成一种具有高能健的储能分子——磷酸精氨酸[3]，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用。

AK在体内催化反应方程式如下：Mg2+ + ADP + Arginine phosphate Mg2++ ATP + ArginineAK广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到AK。

AK是由一个小的α螺旋组成的N端结构域和一个大的C端结构域组成的，C端结构域与Glu合成酶的C端结构域相似，8股串起来的反平行β折叠被7个α螺旋所包绕。

过渡态类似物的结合部位不在两个结构域之间，而是在C端结构域的内部[1]。

如图1所示：图1在菌株中，导入抗Kana青霉素的质粒，菌株中原有质粒产生阻遏蛋白，这种阻遏蛋白与基因结合，阻止基因的表达。

当加入IPTG诱导时，IPTG与阻遏蛋白结合，解除了阻遏蛋白与基因结合的抑制作用，使基因能够顺利表达。

我们本实验的主要目的是以IPTG诱导表达并纯化精氨酸激酶。

1 实验试剂与实验仪器1.1实验材料与实验试剂转入带有精氨酸激酶基因的质粒的大肠杆菌；LB培养基：10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化钠，加水定容至1000ml,分装后高压蒸汽灭菌。

Stripping Buffer: 62.5mmol/l Tris PH6.7；100mmol/l beta-mercaptoethanol；2%SDS Binding Buffer: NaOH(pH 7.4),NaCL(140mM),CaCl(2.5mM) 过滤除菌；低温保存12%的分离胶：缓冲液2.5ml，30%丙烯酰胺贮液4.0 ml，10%SDS0.1 ml，10%过硫酸铵溶液0.1 ml，加水3.3 ml，10%TEMED 40ul浓缩胶：浓缩胶缓冲液0.5ml，30%丙烯酰胺贮液0.67 ml，10%过硫酸铵溶液40ul，加水2.7 ml，10%TEMED 40ul卡那青霉素、400mM/L的IPTG、1 M NaOH、1.5 M NaCl、0.1 M NiSO4、50mM 200mM的咪唑1.2实验仪器紫外分光光度计U－4300，电脑恒温层析柜、ORION pH计、紫外检测仪、冷冻离心机、超声破壁仪、雪山制冰机、超纯水机、低温恒温槽电泳仪、电子天平、振荡培养箱、单人单面净化工作台、电热恒温鼓风干燥箱、高压灭菌锅2 实验方法2.1活化菌种取200 µL表达菌种接入6 mL的LB液体培养基（加入卡那青霉素3ul，其工作浓度为50 µg/mL）中，于37 ℃摇床振荡培养8-12小时。

2.2扩大培养将试管中活化的6 mL菌液接种到50 mL LB培养基，同时加入25 µL卡那青霉素（终浓度50 µg/mL）筛选大肠杆菌转基因质粒，培养基于37℃恒温培养箱中培养2-3 小时。

2.3 IPTG诱导AK的表达实验中在不同的培养时间（用OD值表征菌体密度）加入IPTG诱导表达发现，当温度为37 ℃，OD达0.6-0.8时，加入400mmol/L IPTG共65ul，诱导表达3-6h,IPTG 终浓度为0.5 mM时AK的表达量达到最大。

2.4蛋白质提取（1）将上述各管于4 ℃，5000 r/m离心10分钟；（2）弃上清，使沉淀物质重悬，每1 g沉淀加5 mL Binding Buffer 作为裂解液；（3）在冰上进行10分钟，间隔为2秒钟的超声波破壁,直到沉淀变得澄清为止；（4）于4 ℃，12000 rpm，离心10分钟，取上清，得到AK的粗提液。

2.5 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白预处理：(1)用Stripping Buffer洗20分钟；蒸馏水洗30分钟；(2)用1 M NaOH洗1小时；用Binding Buffer洗20分钟；蒸馏水洗30分钟；(3)用1.5 M NaCl洗1小时；用Binding Buffer洗20分钟；蒸馏水洗30分钟；(4)Ni柱再生：150 mL 0.1 M NiSO4洗→蒸馏水洗（穿流液无色）→Binding Buffer平衡。

平衡：6倍柱床体积Binding Buffer（pH=8.0）平衡。

上样：插A280滤光片，调A值（0）、T值（100）；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。

将粗提液45 mL上柱，流速约为1.6-1.8 mL/min。

洗脱：上样完后，继续用Binding Buffer （pH=8.0）淋洗。

待杂蛋白峰回落走平之后开始用不同梯度的咪唑（50 mM、200 mM）洗脱。

在280 nm处进行连续紫外检测，根据微电脑记录仪显示曲线。

分别收集峰值的洗脱液根据波峰对每管收集蛋白测活并留样、电泳检测纯化程度。

2.6 AK的检测SDS-PAGE电泳：（1）安装双垂直板电泳槽；（2）配12%的分离胶5 mL，浓缩胶3 mL；（3）制样：取样品40 µL与样品缓冲液10 µL混合，100 ℃加热5分钟；（4）上样：用微量注射器加样15-20 µL；（5）电泳：在凝胶上加40 V/cm电压，待染料进入分离胶后将电压提高到140 V/cm 继续电泳直到染料到达底部；（6）固定和染色：用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，加热几分钟；（7）脱色：半小时更换一次脱色液，处理3-5次，直到胶板呈现淡蓝色。

3 结果与分析3.1蛋白质His-tag Ni亲和层析法纯化的层析谱图将合并后的含AK蛋白溶液经His-tag Ni亲和层析纯化后得到如图2，当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有精氨酸激酶可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。

可以看到开始用Binding Buffer （pH=8.0）淋洗，出现一个很高的杂蛋白峰，随着杂蛋白的不断被洗脱下来，杂蛋白峰回落走平。

特异结合在基质上的精氨酸激酶最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。

用不同梯度的咪唑（50 mM、200 mM）洗脱。

层析谱图上相继出现了两个蛋白峰。

且第一个洗脱主峰高于第二个洗脱主峰。

说明第一次洗脱出大量的精氨酸激酶。

用咪唑洗脱后没有杂峰出现，表明用亲和层析法纯化蛋白效率高，效果好。

图2 蛋白质His-tag Ni亲和层析法纯化的层析谱图3.2 AK经纯化后的SDS-PAGE电泳图谱将AK提取液、穿流液、纯化的目标蛋白分别通过SDS-PAGE电泳检测得到图3 。

采用SDS-PAGE电泳，则待分离的蛋白的电泳迁移率主要取决于蛋白的相对分子质量，而与原来所带电荷和分子形状无关。

由图可知，AK提取液中有各种的杂蛋白，但以精氨酸激酶的含量最高。

穿流液中含有极其少量洗脱下来的杂蛋白和精氨酸激酶。

而经His-tag Ni亲和层析纯化后，电泳条带单一，说明AK达到了较高的纯度。

图3 经His-tag Ni亲和层析后的SDS-PAGE电泳图谱（从左至右依次为：1：AK提取液；2：穿流液；3-6：纯化目标蛋白）总结我们以IPTG诱导精氨酸激酶基因在E.Coli菌株中表达，通过His-tag Ni亲和层析技术分离纯化得到较纯的活性精氨酸激酶。

为进一步研究精氨酸激酶分子构象以及在甲壳动物适应不良环境的过程中,精氨酸激酶调控的磷酸精氨酸与ATP 之间平衡的能量代谢反应的重要作用[4]提供理论借鉴。

实验过程中，实验指导老师认真地为我们讲解实验内容，多次耐心地纠正我们实验的不良操作习惯。

本次综合试验让我对大二生物化学理论课中蛋白质的分离纯化程序和分离纯化蛋白的方法有了更深层次的认识。

实验采用亲和层析的方法对蛋白进行分离，通过SDS-PAGE电泳检测得到单一条带，认识到亲和层析这种只需经过一步的处理即可将某种所需蛋白质从复杂的混合物中分离出来并且纯化度相当高。

但是对于His-tag Ni亲和层析技术，对于层析柱的预处理的实验步骤很重要，预处理的步骤的处理是否恰当会直接影响到层析图谱的效果。

综合实验：精氨酸激酶(AK)的表达及其纯化9 参考文献[1] 雷婧，万华涛，汪劲松，王卫东，潘继成。

精氨酸激酶C 端结构域的克隆及其表达纯化[J].化学与生物工程。

2020.27（06）：41—44[2]汤洪敏， 杨吟野。

天门冬氨酸对精氨酸激酶的作用研究[J]。

贵州大学学报。

2005，22（04）:388-391[3] 李海龙，马勇，李杰，史锋。

精氨酸激酶在六氟异丙醇溶液中结构与活性的变化：去折叠平衡态中间体存在的证据[J]。

浙江大学学报。

2007，34（05）：565—569[4]姚翠鸾，王志勇，相建。