精氨酸激酶

含配体溶液
洗下未结合的蛋白
收集目的蛋白
亲和层析过程
his- tag所用层析凝胶的基质
上连接了一个NTA （[=nitrilotriacetic acid]氮基三乙酸），可以与Ni离子结合，而Ni离子与融合蛋白的6Xhis 氨基酸之间产生如图的吸引力，从而将带有his-tag组氨酸标签的融合蛋白与其它蛋白区分开来。从图中可以看到，组氨酸残基红色五元咪唑环是蛋白与Ni离子作用的关键。因此带暴露的His-6的蛋白能结合于固化Ni树脂，用适当缓冲溶液冲洗去其他蛋白后，再用可溶的竞争性螯合剂洗脱可以回收靶蛋白。
白质分离的凝胶主要是聚丙烯酰胺凝胶，该凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺配制而成，其最大的特点是凝胶的孔径可根据需要进行选择。以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，可进行非变性电泳和变性电泳。
主要内容
1 透析 2 层析原理 3 凝胶过滤 4 离子交换层析 5 亲和层析 6 电泳
1透析
按照分子大
➢ 将作为固相成分的不溶性基质，例如葡聚糖凝胶、纤维素、树脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。
➢ 然后加样品，再用适当的溶剂洗脱。
➢ 样品中各种成分通过柱子取决于与固相成分的相互作用，最后以不同速率被洗脱出来，达到将各个成分分离的目的。
1.2 凝胶过滤层析
凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。
带有SO3－或COO－基团，通常以SO3－Na＋或COO－H＋形式出现的叫做阳离子交换基；
带有N＋（C2H5）基团通常以N＋（C2H5）Cl－出现的叫做阴离子交换基。
阳离子交换基
强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂
阴离子交换基
强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨乙基纤维素
加样
阳离子交换层析过程
平衡液洗
蛋白质
离子交换树脂
高离子强度洗脱液洗
高离子强度洗脱液洗
收集
4 亲和层析
依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。
时刻要记住：蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所
以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH 值。
当pI < pH时，蛋白质带净负电荷；而当 pI > pH时，蛋白质带净正电荷。
举一例子：
已知蛋白X等电点为7，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。
答案：建立阴离子交换柱，比如Q-Sepharose。用pH8.5的缓冲液平衡柱子，同时蛋白X溶解于pH8.5的缓冲液中，在此 pH值下蛋白X带有负电，将含有蛋白X的混合液上样，然后用起始液冲洗，蛋白X会与此柱结合，然后盐梯度洗脱。
透析袋
小进行分离。
分离取决于透析袋截留
浓缩的蛋白混合样品
的分子量。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ透析液
开始透析
处于平衡状态
2 层析原理
层析也称之色谱，基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，由于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通过固相的速率产生了差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。
层析因固相介质不同又分为离子交换层析、分子筛层析和吸附层析等各种层析。
电泳
❖ 电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gel electrophoresis）。凝胶可以是淀粉凝胶（starch gel）、琼脂糖凝胶（agarose gel）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）。一般凝胶介质中的pH 被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。
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精氨酸激酶(AK)的表达及其纯化
目录
1 2 3 4
研究背景实验材料实验方法结果及分析
蛋白质的分离纯化
❖ 蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。目标蛋白质的分离决不是一件轻而易举的事情，因为要把它与性质、大小和结构十分相似的其他蛋白质分离开来存在许多困难。有些目标蛋白质在组织细胞内的含量很低，这无疑将增加获取足量蛋白质的难度。
单个凝胶珠本身象 “筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。
带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内
大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出
凝胶过滤层析过程示意图
凝胶凝胶基质珠
小分子大分子
凝胶过滤层析过程示意图
Andrews的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)
logMr
▲目标蛋白质的分离纯化程序主要包括: ⑴材料的选择； ⑵组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液； ⑶蛋白质初步提纯； ⑷选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全纯化； ⑸目标蛋白的鉴定。用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性。因此，在目标蛋白质的整个分离纯化过程中要在较低温度下(0－4℃)操作，注意使用蛋白酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质特定的折叠结构受到破坏。
Kav
蛋白质Mr=49,000
洗出液中的蛋白质浓度
未知洗脱体积（mL）
G-200 G-100
logMr
球蛋白Mr“ 选择性曲线”
3 离子交换层析
如果被分离的样品中各个成分受溶液pH的影响，有时带正电荷，有时带负电荷，此时就可利用离子交换层析方法进行样品的分离。
离子交换层析的固相是离子交换体，包括离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。
一、蛋白质是两性电解质根据蛋白质的分子结构，很容易得出构成蛋白质
的两性解离的基础是氨基酸残基的侧链可解离的基团。作为两性电解质，每种蛋白质都有其等电点(pI) ，
这与它所含的氨基酸种类和数量有关。所有的蛋白质，不管它具有什么样的功能，都能
在细胞内起一定的缓冲作用。
1. 蛋白质的电泳分离凝胶电泳是目前常用的一种生化方法。用于蛋
当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高1000至10000倍。
平衡液
混合蛋白样品
带有配体的树脂珠（或胶粒）

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激酶入核的条件

激酶入核的条件
激酶入核是指激酶分子从胞质进入细胞核的过程。

激酶入核对于细胞信号传递和基因调控起着重要作用。

1.核定位信号（NLS）：激酶蛋白通常通过核定位信号（NLS）来进入细胞核。

核定位信号是一段氨基酸序列，可以被核定位蛋白（例如importin家族蛋白）识别和结合，从而促进激酶进入细胞核。

核定位信号通常包含正电荷氨基酸，如赖氨酸（lysine）和精氨酸（arginine），并呈现出一定的序列特征。

2.激酶激活状态：激酶进入细胞核通常需要处于激活状态。

激活的激酶可能与其他蛋白质或结构分子相互作用，通过激酶激活状态来调控激酶的进入和活动。

例如，磷酸化可以调控激酶的激活状态，从而影响其进入细胞核。

3.细胞环境调控：细胞环境中的一些因素也可以影响激酶的核定位。

例如，离子浓度、ATP水平、细胞结构等因素可能对激酶入核起调控作用。

此外，其他蛋白质、RNA或小分子可以与激酶相互作用并影响其进入细胞核。

4.激酶与转运蛋白相互作用：激酶通过与一些转运蛋白相互作用，来调节其进入细胞核的过程。

转运蛋白可以作为激酶进入核内的载体，通过与激酶结合并帮助其通过核孔复合物进入细胞核。

总的来说，激酶入核是一个复杂的过程，受到多种条件的调控。

这些条件包括核定位信号、激酶的激活状态、细胞环境调控以及与转运蛋白的相互作用等。

这些条件相互作用，共同决定了激酶的入核效率和精确性，从而对细胞的信号传递和基因表达起到重要的调控作用。

凡纳滨对虾精氨酸激酶的分离纯化及性质研究

凡纳滨对虾精氨酸激酶的分离纯化及性质研究姚翠鸾;王志勇;张瑞英;韩学哲;张子剑;孔鹏;冀培丰;黄珊珊【期刊名称】《水产学报》【年(卷),期】2008(32)5【摘要】经过CM-纤维素批量层析、Separdex G-100柱层析、DEAE_纤维素柱层析等步骤,从凡纳滨对虾肌肉组织分离得到精氨酸激酶,经SDS-PAGE检测达到电泳纯,分子量约为40kDa.对该酶的性质进行分析结果表明,精氨酸激酶的最适作用温度为55℃,当温度高于65℃时,酶活力显著下降;pH 8时酶活力较高,低浓度的精氨酸对酶活力有促进作用,高浓度时表现抑制作用,而底物类似物精胺和氨基胍则对酶促反应表现出完全的抑制.NaCl,KCl对酶的活力具有促进作用,低浓度(10 mmol·L-1)MgCl2对酶活力表现出激活作用,而CuCl2与MnCl2则表现出完全抑制酶活力,CaCl2与ZnCl2在低浓度时对酶活力无明显影响,但是随着浓度升高,对酶具有抑制作用.【总页数】7页(P690-696)【作者】姚翠鸾;王志勇;张瑞英;韩学哲;张子剑;孔鹏;冀培丰;黄珊珊【作者单位】集美大学水产学院水产生物技术研究所,福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室,福建,厦门,361021;集美大学水产学院水产生物技术研究所,福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室,福建,厦门,361021;河北人学生命科学学院,河北,保定,071002;科学出版社,北京,100717;河北人学生命科学学院,河北,保定,071002;河北人学生命科学学院,河北,保定,071002;集美大学水产学院水产生物技术研究所,福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室,福建,厦门,361021;集美大学水产学院水产生物技术研究所,福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室,福建,厦门,361021【正文语种】中文【中图分类】S917【相关文献】1.凡纳滨对虾过敏原精氨酸激酶的质谱鉴定及其免疫交叉反应研究 [J], 孙一帆;黄建芳;向军俭;王彩霞;陈成枫2.尖吻蝮蛇毒中精氨酸脂酶的分离纯化与性质研究 [J], 郑颖;向左云;姚光宁;王维详;杨美峰3.纳豆激酶分离纯化及其性质研究 [J], 范强;姚文兵;高向东;夏磊4.纳豆激酶的分离纯化及酶学性质研究 [J], 董志奎;杨超;尹宗宁;李萌5.凡纳滨对虾精氨酸激酶的多克隆抗体制备及组织特异性表达分析 [J], 姚翠鸾;冀培丰;孔鹏;王志勇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

精氨酸激酶(AK)的提取与纯化

精氨酸激酶（AK）的提取与纯化报告题目精氨酸激酶（ＡＫ）的提取与纯化作者姓名徐青龙班级学号1005/2010114020208指导教师汪劲松完成时间2013年10月生物学实验教学中心目录１引言 (1)1.1精氨酸激酶（AK） (1)1.2亲和层析法 (2)1.3电泳法 (2)1.4本实验主要工作 (3)2.1实验用品 (3)2.1.1实验材料 (3)2.1.1实验试剂 (3)2.1.2仪器设备 (4)2.2方法 (5)2.2.1活化菌种 (5)2.2.2 扩大培养 (5)2.2.3 IPTG诱导AK基因的表达 (5)2.2.4 蛋白质提取 (5)2.2.5蛋白质的检测 (6)2.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (6)3 结果与分析 (7)3.1蛋白质层析图谱 (7)3.2AK诱导表达电泳图 (8)4总结 (9)参考文献 (10)致谢 (10)精氨酸激酶（AK）的提取与纯化朱景鹏（指导老师：汪劲松）（湖北师范学院生命科学学院生物科学1005班湖北黄石435002）摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。

本实验采取含有包含AK基因的重组质粒的表达菌体E. coli Rosetta，在含有50 μg/ml 的卡纳霉素的LB 培养基中培养。

当菌体浓度A600达到0.6-0.8 时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）,使培养基中的IPTG终浓度为0.2 mM ,诱导培养3 小时后，从菌体中得到精氨酸激酶粗提液。

再通过Ni离子亲和层析柱分离纯化精氨酸激酶，最后通过SDS-PAGE电泳来检测精氨酸激酶的表达以及其纯化程度。

关键词：精氨酸激酶分离与纯化１引言1.1精氨酸激酶（AK）精氨酸激酶（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）是磷酸原胍基化合物激酶的一种，主要存在于无脊椎动物体内，是细胞能量代谢中非常关键的的磷酸激酶[1]。

精氨酸酶缺乏症-罕见病诊疗指南

精氨酸酶缺乏症一、疾病概述精氨酸酶缺乏症(arginase deficiency)也称精氨酸血症(argininemia)，或高精氨酸血症，属常染色体隐性遗传病，是先天性尿素循环障碍中较少见的类型。

1969年由Terheggen等[1]首次报道。

精氨酸血症患者的临床表现与其他类型的尿素循环障碍有所不同，多数患儿在婴儿早期智力运动发育正常，随着疾病进展，在婴儿晚期出现进行性智力运动发育倒退、癫痫等神经系统损害。

除一般高氨血症所导致的症状外，可有步态异常、痉挛性瘫痪、小脑性共济失调等。

国内外关于精氨酸血症发病率的研究资料较少，据报道其发病率为1/350 000～1/2 000 000不等。

国内韩连书等从4 981名临床疑似遗传代谢病患者中检查出了1例精氨酸血症患者[2]；杨艳玲教授团队曾报道7例精氨酸血症患者[3]。

精氨酸酶(EC3.5.3.1)有两种同工酶，Ⅰ型存在于肝脏，为精氨酸酶的主要类型；Ⅱ型存在于肝外组织，含量较少。

精氨酸血症是由于Ⅰ型精氨酸酶缺乏导致的一种疾病。

精氨酸酶缺乏导致精氨酸不能顺利转化为瓜氨酸，血液及尿液中精氨酸浓度增高，尿素生成障碍，引起神经、肝脏、肾损伤等多脏器损害，引起一系列临床表现。

编码Ⅰ型精氦酸酶的基因（ARGl）位于6q23，长11.5 kb，包括8个外显子和7个内含子，编码由322个氨基酸组成的精氨酸酶同工酶Ⅰ蛋白。

迄今已报道了至少30种ARG1基因突变。

二、临床特征精氨酸血症患者临床表现复杂，个体差异较大，包括痉挛、震颤、舞蹈样运动、多动、共济失调、痉挛性四肢瘫痪、抽搐、精神发育迟缓等进行性神经系统损害，以及肝病、周期性呕吐和小头畸形。

患儿早期可表现出厌食蛋白倾向及蛋白不耐受，进食高蛋白食物后血氨增高，导致呕吐或嗜睡，易合并营养不良。

进行性神经系统损害是精氨酸血症患者主要的临床特点，病情严重者可于新生儿早期发病，出生后数日出现惊厥，病死率高。

患儿于2岁内出现“剪刀”步态、痉挛性双侧瘫、惊厥、严重智力低下、脑电图异常。

生物化学实验PPT课件：精氨酸激酶的提取、分离、纯化及活力测定

四、操作步骤
（一）酶液的制备
（二）凝胶层析
1. 凝胶溶胀根据柱床体积称取一定量 Sephadex G-100 干胶，加入蒸馏水，沸水煮沸2个小时，使之充分溶胀。
2. 装柱用充分溶胀的Sephadex G-100装柱，装柱前，先在柱中加入一定量的层析柱平衡液，然后倒入凝胶，打开柱底部的出口，使其自然沉降,保持柱顶部缓冲液1-2 cm 高。
蛋白质含量及酶活力测定
蛋白质含量测定可采用紫外法或考马斯亮蓝法。酶活力测定：取3 ml 测活反应液于比色杯中，加入30 l酶液，立即混匀并测定575 nm处的吸光值，计时，当吸收值达到1.4时停止测定，并记录所需时间，以每秒575 nm处每变化0.001为一个酶活力单位，如反应开始时A575为2.0，反应60秒后，A575为 1.4，则酶活力为
恒流泵电源
记录仪
层析柜
思考题
• 1. 影响蛋白质分离效果的因素有哪些? • 2. 获得理想纯化结果应注意哪些关键步骤？ • 3. 蛋白峰的高低和和宽窄与纯化结果有关系？ • 4. 如何确定目的蛋白？ • 5. 如何评价蛋白质纯度？ • 6. 为什么蛋白质纯化过程中每一步都要测定蛋白
质含量和活性？
精氨酸激酶的提取、分离、纯化及活力测定
凝胶过滤分离纯化蛋白质
• 实验目的 • 实验原理 • 实验材料、仪器和试剂 • 实验操作步骤 • 仪器使用 • 思考题
一、目的
学习和掌握蛋白质的提取、凝胶层析分离纯化精氨酸激酶的原理和操作技术，并学习目的蛋白质的确定方法。
二、原理
凝胶过滤(Gel Fitration Chromatography，GFC) 又称分子筛层析、分子排阻层析、凝胶色谱。基本原理是混合物中各组分通过层析柱时按其分子大小不同而被分离的技术。固定相（凝胶）是一种不带电荷的具有三维空间的多空网状结构的物质，分子量大的蛋白质不能渗入凝胶颗粒内部，流程短，先被洗脱下来，而分子量小的蛋白质可可以进入凝胶网孔，流程长，后被洗脱下来，从而达到分离的目的。

精氨酸激酶的折叠及其部分结构的研究_1[1].1精氨酸激酶_11_15

第一章引言１．１　精氨酸激酶　精氨酸激酶(Arginine kinase，AK)(E.C.2.7.3.3)是一种磷酸原胍基化合物的激酶。

它的作用是催化如下可逆反应：将ATP上的磷酸基团转移到精氨酸上，从而形成一种具有高能键的储能分子――磷酸精氨酸。

反应方程式如下：精氨酸＋ATP・磷酸精氨酸＋ADP・Mg + H+AK被发现已经超过70年的历史了, 它属于磷酸原（胍基化合物）激酶这个大家族中的一员。

现在已经在许多种无脊椎动物中发现了AK, 例如有鳌节肢动物(chelicerate arthropod) Limulus polyphemus[1], 腹足动物(gastropod) Cellana grata 和Aplysia kurodai [2]，海参Stichopus japonicus[3]，头足类动物Nautilus pompilius[4]，龙虾(lobster) Homarus vulgaris[5]，海葵（sea anemone）Anthopleura japonicus[6]，海湾对虾（gulf shrimp）penaeus aztecus[7]等无脊椎动物中都已经分离得到了AK。

尽管说基本功能都是催化同样的高能磷酸键转移反应，但是从不同的无脊椎动物体内得到的AK的结构和分子量大小却存在着很大的差异。

这些不同的精氨酸激酶结构和大小有以下类别：（1）单亚基，如海湾对虾（gulf shrimp）penaeus aztecus 的AK[7]，是一种相对分子量约为40 kDa的单亚基的蛋白质。

单亚基的AK是目前研究最多的一种AK。

本论文中用到的AK就是单亚基，相对分子量约为40 kDa。

（2）双亚基，如海参Stichopus japonicus中分离得到的AK就是一种相对分子量约为84 kDa的双亚基蛋白质[3]。

（3）四个亚基，如环节动物（annelid）Sabella pavonina中具有相对分子量在150～160 kDa之间的四亚基AK[8]。

精氨酸激酶与重金属离子相互作用的研究

精氨酸激酶与重金属离子相互作用的研究利用Q SephroseTM-XL强阴离子交换色谱从虾的精氨酸激酶粗提液中纯化出精氨酸激酶，采用SDS-PAGE检测酶的纯度，改进的pH比色法测定酶的活性，并对精氨酸激酶的性质进行了研究，分别以Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Cd2+为效应物，研究它们对精氨酸激酶催化活力及聚沉作用的影响，进一步利用荧光光谱研究了精氨酸激酶与五种重金属离子的相互作用。

结果表明，Q SephroseTM-XL强阴离子交换色谱纯化出的精氨酸激酶不仅纯度高而且活性强，随着重金属的浓度增高，酶的活力逐渐下降，酶的聚沉程度加快，重金属离子的金属性越强，其对酶活性的影响越小，酶活性降低越慢，根据Stern-Volmer曲线，重金属离子与精氨酸激酶相互作用会导致精氨酸激酶的荧光发生静态猝灭作用。

根据静态猝灭公式，以lg[(F0-F)/F]对lg[c]作图，通过斜率和截距求出了Ag+与精氨酸激酶的结合常数KA=3.881×105及结合位点数n=1.1968，Cu2+：KA=2.817×104及结合位点数n=1.1055, Zn2+：KA=1.108×105及结合位点数n=1.1943, Fe3+:KA=1.175×104及结合位点数n=1.0312,Cd2+：KA=1.538×104及结合位点数n=1.0021。

研究充分了说明不同的重金属离子影响精氨酸激酶分子构象变化的机理、程度不同，研究也证明了荧光光谱能较敏感地反映出精氨酸激酶分子的构象变化，是一种较好的检测重金属离子与精氨酸激酶相互作用的工具。

丝／精氨酸蛋白特异性激酶生理功能及其在肿瘤中的研究进展

（滨州医学院人体解剖学与组织学胚胎学研究所，烟台２６４０００）丝氨酸／精氨酸（ｓｅｒｉｎｅ／ａｒｇｉｎｉｎｅ，ＳＲ或ＲＳ）蛋白激酶是一ＰＫ１向细胞核内转移的区域信号，维持激酶在细胞中的分布。与ＳＲＰＫ１不同，ＳＲＰＫ２在Ｎ末端包含丰富的脯氨酸序列，它可以与体外蛋白质中Ｗｗ结构域相互作用。ＳＲＰＫ１除了能与ＳＲ蛋白家族拼接因子结合外，还能与其他酶底物发生反应，如磷酸化核纤层蛋白Ｂ受体上的ＲＳ重复区域，调节核纤层蛋白Ｂ受体与染色体的黏附作用］。ＳＲＰＫ１和蛋白磷酸酶１（ｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ１，ＰＰ１）共同存在能调节ＳＲ蛋白磷酸化和去磷酸化平衡，失平衡时，ＳＲＰＫ１聚集可以对抗其他磷酸化酶对ＲＳ区域的磷酸化，因位于细胞质内的ＳＲＰＫ１能快速磷酸化ＲＳ区域Ｎ末端部位ＲＳ１的１Ｏ个丝氨酸，使位于ＲＳ１前部的ＲＮＡ识别模体（ＲＮＡｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｍｏｔｉｆｓ，ＲＲＭｓ）减弱ＰＰ１与ＲＳ１连接后的去磷酸化功能［５］。此外，Ｍｙｌｏｎｉｓ等＿６］在睾丸提取物中显示ＣＫ２蛋白激酶可以磷酸化ＳＲＰＫ１的Ｓｅｒ５
ｋｉｎａｓｅ，ＳＲＰＫ）家族是一类能特异性磷酸化ＲＮＡ剪接子内ＲＳ

精氨酸激酶(AK)

精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化报告题目藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化作者姓名余姣班级学号0801/2008114010130指导教师汪劲松完成时间2011年5月生物学实验教学中心目录摘要........................................................................ 错误！未定义书签。

引言.. (2)1 实验材料 (2)2 实验方法 (3)2.1菌种活化 (3)2.2扩大培养 (3)2.3 IPTG诱导AK的表达 (3)2.4 AK的提取及其纯化 (3)2.5His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (3)2.6 AK的检测SDS-PAGE电泳 (4)3 结果与分析 (4)3.1 提取物的层析谱图与分析 (5)3.2 提取物SDS-PAGE电泳图与分析 (6)总结 (6)参考资料 (7)藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化余姣（指导老师：汪劲松）摘要：精氨酸激酶（AK)(E.C.2.7.3.3)是一种磷酸原胍基化合物激酶，存在无脊椎动物中。

本实验是将具有重组有AK基因的质粒的E.coli，在含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中活化和扩大培养。

当菌体密度即OD值为0.6-0.8时，用0.5μg/ml IPTG异丙基硫代- -D-半乳糖诱导lac乳糖操纵子表达AK 5h。

接着5000 r/m离心10分钟，弃上清液获得沉淀物重悬加裂解液后用超声波破壁至沉淀变得澄清，再12000 r/m离心，弃沉淀得到AK的粗提液。

采用亲和层析法（含His-tag Ni的树脂层析柱）纯化AK，最后SDS-PAGE电泳，鉴定。

关键词：精氨酸激酶亲和层析光谱分析精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化余姣（指导老师：汪劲松）引言：蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。

目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。

精氨酸激酶在六氟异丙醇溶液中结构与活性的变化：去折叠平衡态中间体存在的证据

Ｃｏｏｍａｔｏｌｃｎｅａｎａｔｖｔｏｎｏｒｉｎｅｋｉｓｎｈｅｆｕｒｉ０ｐ０ａｎＩｎｆｒｉｎａｈａｇｎｄｉｃｉａｉｆａｇｎｉｎａｅｉｘａＩ００ｓｒｐ０：Ｅｖｉｅｅｆｒｅｉｔｎｃｆａｎｆｌｄｎｃｏｘｓｅｅｏｎｕｏ —
Ａｂｔａｔ：Ｔｈｅｄｎａｕｒｔｏｎｏｆａｇｉｎｅｋｉａｅ（Ｋ）ｉａｒｏｕｏｅｒｔｏ１，３，３ｈｅｆｕｏｓｒｐａｏｌｓｒｃｅｔａｉｒｎｉｎｓＡｎｖｉｓｃｎｃｎｔａｉｎｓｏｆ１，１，３，－ｘａｌｏｒｉｏｐｏｎ（ＨＦＩＰ）ｗａｓｉｅｔｇａｅｎｒｎｓｃｆｕｏｅｓｅｃｎｖｓｉｔｄｂｙｉｔｉｉｌｒｃｎｅ，ＡＮＳｂｉｉｇ，ｆｒｕｔａｉｌｔｃｒｕａｉｈｒｉｍ（ｎｄｎａ — ｌｒｖｏｅｉｃｌｒｄｃｏｓＣＤ）ｓｅｔａａｐｃｒｎｄａｔｖｔｓａｃｉｉｙａｓｙ．ＴｈｅｃｎｃｎｔａｉＦＩｍｐｌｅａｎｄｒ８ｏｅｒｔｏｎｏｆＨＰｅｏｙｄｗｓｕｅ１５．ｔｖｏｄｔｇｅｔｏｏｆｐｒｅｎ．Ｉ．５～Ｏａｉｈｅａｇｒｇａｉｎｏｔｉｎ０
Ｖｌ４Ｎ．Ｓ＿ｏ５ｏ３
ｅｐ．２００７
精氨酸激酶在六氟异丙醇溶液中结构与活性的变化去折叠平衡态中间体存在的证据
李海龙勇，马，李杰，史锋
（．浙江大学生命科学学院，江杭州３０５；．浙江清华长三角研究院，江嘉兴３４０）１浙１０８２浙１００

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