焦磷酸测序 重亚硫酸盐
DNA甲基化与检测方法简介
最近，为了排除那些Alu重复序列，提出了更
该区域的CpG二核苷酸数（#CpG）
该区域的胞嘧啶C的数目（#C）* 鸟嘌呤G的数目（#C）
* 该区域的碱基数（#N）
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生命奥碱基对，GC含量超过55%，CpG比值大于0.65。 据估计，哺乳动物基因组中的CpG岛约有4万个。在健康人的基因组中，CpG岛中的CpG位点一般处
的开放状态，抑癌基因不断表达抑制肿瘤的发生。 而在肿瘤细胞中，该区域的CpG岛被高度甲基化， 染色质构象发生改变，抑癌基因的表达被关闭，从
而导致细胞进入细胞周期，凋亡丧失，DNA修复缺 陷，血管生成以及细胞粘附功能缺失等，最终导致 肿瘤发生。同样，如图1右所示，对于在正常细胞 中处于高度甲基化的一些基因和重复序列，如果其 甲基化水平降低，这些基因将表达和重复序列将激 活，从而导致基因印记丢失，细胞过度增长，不合 适的细胞特异性表达，基因组脆性增加，以及内寄 生序列(endoparasitic sequence)激活，最终也导致 肿瘤发生。
焦磷酸光化测序技术的基本原理及运用-人类学论文-生物学论文
焦磷酸光化测序技术的基本原理及运用-人类学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——摘要：人类基因组计划（Human Genome Project, HGP）不仅极大地提高了人类对基因组和相关遗传信息的认识水平，而且促进了生命科学研究技术的发展和应用。
正是在这样的历史背景下，焦磷酸光化测序技术（pyrosequencing）由瑞典研究人员发明。
焦磷酸光化测序技术的基础原理是基于通过合成测序原理进行酶促反应的DNA测序方法，通过基于释放焦磷酸盐时的链式反应的可见光检测，即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低和相匹配的碱基数成正比。
该技术可应用于DNA核苷酸序列和突变的检测、单核苷酸多态性的基因型的鉴定，以及DNA甲基化水平变化的分析等。
近年来，随着摄影器材和成像技术的快速发展，这项技术的原理是基于通过酶促反应而实时检测可见光，因此，有望在检测的敏感性方面得到更进一步的发展。
该文根据笔者在瑞典近三十年的工作经验和积累的文献，首先阐明焦磷酸光化测序的基本原理，然后介绍该技术的应用，最后讨论其发展前景。
关键词：人类基因组计划; 焦磷酸光化测序; 基因变异; 基因型; DNA甲基化;Abstract：The Human Genome Project（HGP）not only greatly improved the understanding of human genome and related genetic information, but also promoted the development of technologies in life science research. It was under this historical context that pyrosequencing was invented by Swedish researchers. Pyrosequencing is a method of DNA sequencing based on the sequencing by synthesis principle with enzymatic reactions, and relies on light detection based upon a chain reaction when pyrophosphate is released. The application of this technology involved the detection of DNA nucleotide sequences and mutations, the identification of genotypes of single nucleotide polymorphisms, the analysis of changes in DNA methylation levels etc. With the recent rapid development of photographic equipment and imaging technology, this technology is expected to have an increasing sensitivity in signal detection. Based upon the working experiences in Sweden for nearly 30 years and accumulated literature, this review first clarified the basic principles of pyrosequencing, then introduced the applications of this technology, and finally discussed its development prospects in the near future.Keyword：Human Genome Project; pyrosequencing; genetic variation; genotype; DNA methylation;1 、引言本世纪是生命科学的世纪。
重亚硫酸盐测序技术介绍
DNA甲基化含义 DNA甲基化含义
在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷 在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷 酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5 酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞 嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。大多数脊椎 嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。大多数脊椎 动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要 动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要 集中在基因5 集中在基因5＇端的非编码区，并成簇存在。甲基 化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后， 化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后， 甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基 化。DNA的甲基化可引起基因的失活。 化。DNA的甲基化可引起基因的失活。 DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5 mC） DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC） 和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7 和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌 呤（7 mG） 呤（7-mG）
启动子的CpG岛 启动子的CpG岛
CpG岛主要位于基因的启动子和第一 CpG岛主要位于基因的启动子和第一 外显子区域，约有60%以上基因的启动 外显子区域，约有60%以上基因的启动 子含有CpG岛。GC含量大于50%,长度 子含有CpG岛。GC含量大于50%,长度 超过200bp。在启动子（promotor）或 超过200bp。在启动子（promotor）或 “起始”区域周围，甲基化经常被抑 起始” 制。这些区域包含浓度相对较高的 CpG对，与此段区域对应的染色体区 CpG对，与此段区域对应的染色体区 段一起被称作CpG岛。CpG岛与56%的 段一起被称作CpG岛。CpG岛与56%的 基因编码有关。
重亚硫酸盐测序
CpG岛 基因组中长度为300～3000 bp的富含CpG二 核苷酸的一些区域，主要存在于基因的5′区 域。启动子区中CpG岛的未甲基化状态是基 因转录所必需的，而CpG序列中的C的甲基 化可导致基因转录被抑制。 位于多种脊椎动物已知基因转录起始位点周 围、由胞嘧啶(C)和鸟嘧啶(G)组成的串联重 复序列。
DNA甲基化含义 甲基化含义 在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷 酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞 嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。大多数脊椎 动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集 DNA 中在基因5＇端的非编码区，并成簇存在。甲基化 位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲 基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基化。 DNA的甲基化可引起基因的失活。 DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC） 和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌呤 （7-mG）
重亚硫酸盐修饰直接测序技术
亚硫酸氢盐技术
基本原理
亚硫酸氢盐能使单链DNA的胞嘧啶脱氨变成 尿嘧啶，而5‘甲基胞嘧啶无变化，在CpG两 端设计引物，扩增出所需片段后进行直接测 序，TG为非甲基化位点，CC为甲基化CG位 点。从而获取CpG岛内所有的甲基化位点。
含有很多CpG 结构, 2CpG 和2GPC 中两个胞嘧啶的5 位碳 原子通常被甲基化, 且两个甲基集团在DNA 双链大沟中呈特 定三维结构。基因组中60%～ 90% 的CpG 都被甲基化, 未 甲基化的CpG 成簇地组成CpG 岛, 位于结构基因启动子的核 心序列和转录起始点。有实验证明超甲基化阻遏转录的进行。 DNA 甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化, 使 DNA 失去核酶ö限制性内切酶的切割位点, 以及DNA 酶的敏感位点, 使染色质高度螺旋化, 凝缩成团, 失去转录活 性。5 位C 甲基化的胞嘧啶脱氨基生成胸腺嘧啶, 由此可能 导致基因置换突变, 发生碱基错配: T2G, 如果在细胞分裂过 程中不被纠正,就会诱发遗传病或癌症, 而且, 生物体甲基化 的方式是稳定的, 可遗传的。
重亚硫酸盐测序技术介绍
在甲基化变异细胞占少数的混杂的样品中，由于 此方法可方便地应用于任何序列的甲基化状态的分析，能对甲基化的等位基因进行半定量，获得甲基化和未甲基化等位基因的比例；
大多数脊椎动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5＇端的非编码区，并成簇存在。
重亚硫酸直接测序法对启动子测序的应用
最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。 甲基化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基化。
CpG岛的甲基化
CpG岛经常出现在真核生物的 house-keeping基因的调控区，在其 它地方出现时会由于CpG中的C易 被甲基化而形成5'-甲基胞嘧啶，脱 氨基后形成胸腺嘧啶，由于T本身 就会存在于DNA中，因此不易被 修复，所以被淘汰。故CpG在基因 组中是以岛的形式分布的。
基本原理
重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱 氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变， 行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲 基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成 胸腺嘧啶。最后，对PCR产物进行测序，并且与未 经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。 此方法一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目 的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。在寻找有 意义的关键性CpG位点上，有其他方法无法比拟的 优点。
重亚硫酸氢盐直接测序技术的优缺点
重亚硫酸盐测序技术介绍
重亚硫酸氢盐直接测序技术的优缺点 若 无甲基化，则不会有任何片段扩增出现。
在甲基化变异细胞占少数的混杂的样品中，由于所用链特异性PCR不是特异扩增变异靶序列，故灵敏度较MSP差。 重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增(引物设计时尽量避免有 CpG，以免受甲基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺ห้องสมุดไป่ตู้啶。 PCR法比 Southem法更为敏感，但只能检测甲基化敏感的限 制性位点的CpG甲基化，且DNA必须酶切完全，否 则会出现假阳性。 当用甲基 化不敏感的内切酶消化产物作为PCR模板时，不论 该部位是否甲基化都不应有片段扩出。
甲基化测序
DNA甲基化检测实验一、重亚硫酸盐的测序法实验流程（BSP）（Bisulfite Genomic Sequence）原理：结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。
重亚硫酸盐处理后，用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应（PCR）。
PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。
PCR产物克隆后进行测序。
通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA 分子中的甲基化状态。
该方法特点是：•特异性高，它能够提供特异性很高的分析结果，这是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的；•灵敏度高，可以用于分析少于100个细胞的检测样品。
用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图。
重亚硫酸盐测序法技术实验流程A．DNA制备用DNA抽提试剂盒（Promega, cat. no. A1125）抽提组织，细胞培养物，石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。
B．重亚硫酸盐处理C．DNA纯化用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。
D．PCR扩增E．PCR产物琼脂糖电泳后回收纯化F．PCR产物连接到pMD19-T (Takara) 载体中克隆及测序。
G．用分析软件对各样本测序结果进行甲基化程度分析二、甲基化特异性的PCR实验流程（methylation-specific PCR, MSP）原理：甲基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。
重亚硫酸盐处理DNA后，基因组DNA发生的由甲基化状态决定的序列改变。
随后进行引物特异性的PCR。
该方法引物设计是关键。
MSP中设计两对引物，即一对结合处理后的甲基化DNA链（引物对M），另一对结合处理后的非甲基化DNA链（引物对U）。
检测MSP扩增产物，如果用引物M能扩增出片段，则说明检测位点存在甲基化；若用引物U扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化（图3）。
重亚硫酸盐测序操作方案
重亚硫酸盐测序操作⽅案重亚硫酸盐测序操作⽅案⼀、样品收集1、配制2%低熔点琼脂糖称取0.02 g低熔点琼脂糖，倒⼊1.5 mL离⼼管中，随后加⼊1 mL mPBS溶液，置于100℃⾦属浴中反复加热并颠倒混匀⾄完全溶解，取出4℃保存待⽤。
2、收集细胞样品80℃以上热⽔浴使低熔点琼脂糖溶化。
向1.5 mL离⼼管底部加⼊8 µL低熔点琼脂糖，避免产⽣⽓泡。
迅速吸取细胞样品吹⼊琼脂糖中，冷却后加⼊500 µL矿物质油覆盖。
最后将离⼼管在热⽔浴中短暂浸泡使琼脂糖⼩球成型，取出-20℃保存待⽤。
⼆、亚硫酸氢盐修饰3、配制DNA细胞裂解液：向20 mL TE缓冲液中加⼊100 µL 的20 mg/ml蛋⽩酶K。
4、向含样品的离⼼管内加⼊500 µL DNA细胞裂解液，50℃⾦属浴8 h以上，以消化样品。
6、消化完成后，将离⼼管取出，换液清洗使⼩球变性：0.3M NaOH，500 µL，15 min，2次；0.1M NaOH，1 mL，5 min，1次。
7、换液加⼊500 µL转化液，50℃⾦属浴8 h以上，以转化样品，注意避光。
8、⽤TE缓冲液中⽌转化，1 mL ，15 min，6次。
9、⽤0.2M NaOH脱磺化，500 µL，15 min，2次。
10、⽤TE缓冲液中⽌脱磺化，1 mL，15 min，3次。
11、⽤双蒸⽔清洗，1 mL，10 min，2次。
12、清洗完成，⽤枪头吸取琼脂糖⼩球转移⾄200 µL离⼼管中，-20℃保存待⽤。
三、甲基化基因的PCR带，快速精确切取，将胶块放⼊1.5 mL离⼼管内。
15、对胶块称重，向离⼼管内加⼊3倍胶体积（0.1 g=100 µL）QG Buffer，50℃⾦属浴⾄胶融化，同批样品可统⼀为450 µL，以便于离⼼。
16、加⼊1倍胶体积（150 µL）异丙醇，颠倒混匀后将液体移⼊离⼼柱离⼼，13000 g，1 min。
重亚硫酸盐测序操作方案
重亚硫酸盐测序操作方案一、样品收集1、配制2%低熔点琼脂糖称取0.02 g低熔点琼脂糖，倒入1.5 mL离心管中，随后加入1 mL mPBS溶液，置于100℃金属浴中反复加热并颠倒混匀至完全溶解，取出4℃保存待用。
2、收集细胞样品80℃以上热水浴使低熔点琼脂糖溶化。
向1.5 mL离心管底部加入8 μL低熔点琼脂糖，避免产生气泡。
迅速吸取细胞样品吹入琼脂糖中，冷却后加入500 μL矿物质油覆盖。
最后将离心管在热水浴中短暂浸泡使琼脂糖小球成型，取出-20℃保存待用。
二、亚硫酸氢盐修饰3、配制DNA细胞裂解液：向20 mL TE缓冲液中加入100 μL 的20 mg/ml蛋白酶K。
4、向含样品的离心管内加入500 μL DNA细胞裂解液，50℃金属浴8 h以上，以消化样品。
6、消化完成后，将离心管取出，换液清洗使小球变性：0.3M NaOH，500 μL，15 min，2次；0.1M NaOH，1 mL，5 min，1次。
7、换液加入500 μL转化液，50℃金属浴8 h以上，以转化样品，注意避光。
8、用TE缓冲液中止转化，1 mL ，15 min，6次。
9、用0.2M NaOH脱磺化，500 μL，15 min，2次。
10、用TE缓冲液中止脱磺化，1 mL，15 min，3次。
11、用双蒸水清洗，1 mL，10 min，2次。
12、清洗完成，用枪头吸取琼脂糖小球转移至200 μL离心管中，-20℃保存待用。
三、甲基化基因的PCR第一轮反应体系25 μL，转化后琼脂糖小球计为2 μL DNA。
第二轮反应体系扩大为50 μL。
快速精确切取，将胶块放入1.5 mL离心管内。
四、胶回收15、对胶块称重，向离心管内加入3倍胶体积（0.1 g=100 μL）QG Buffer，50℃金属浴至胶融化，同批样品可统一为450 μL，以便于离心。
16、加入1倍胶体积（150 μL）异丙醇，颠倒混匀后将液体移入离心柱离心，13000 g，1 min。
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焦磷酸测序重亚硫酸盐
焦磷酸测序是一种基于DNA聚合酶链式反应（PCR）的测序技术。
它是一种混合式测序方法，能对大量DNA片段进行测序。
这种技术基于DNA聚合酶链式反应中两种在一定温度
下互补结合的引物。
在DNA的扩增过程中，链终止核苷酸扣除在内，由于DNA聚合所需要的缺少的单核苷酸，DNA的长度会逐渐增加。
这时，一个还原剂重亚硫酸盐（NaHSO3）被添加到反应体系中，使得终止核苷酸可以被还原。
接下来，热量的作用下，还原后的终止核
苷酸被剥离，使得链的延伸能够再次进行。
在继续塑型过程中，一旦有一种特定的二进制
码序列出现，反应便会停止。
接下来通过比对序列相似度找出二进制码串，即可确定测
序的结果。
而重亚硫酸盐（NaHSO3）是一种常用的化学剂，用于对化合物的还原作用，它的化学
式为Na2S2O5。
它在红倒试验中起到还原Cu2+的作用，以生成Cu2O沉淀。
在焦磷酸测序中，重亚硫酸盐和DNA扩增反应中的核苷酸共同作用，实现可控的DNA延伸和中断。
在焦磷酸测序中，重亚硫酸盐的浓度需要精确控制才能保证测序的准确性。
如果重亚
硫酸盐浓度太高，则会导致DNA链不断断开，因而DNA的延伸被大大限制。
反之，如果重
亚硫酸盐的浓度过低，则会使得扩增过程中的DNA变得过于短小，失去良好的延伸性。
综上所述，重亚硫酸盐在焦磷酸测序反应体系中发挥了关键的作用，它在DNA扩增中
提供了可控的链延伸和中断，从而使得大量基因片段得以测序。