尿蛋白SDS_琼脂糖凝胶电泳实验方法建立及临床应用
尿蛋白电泳在肾脏疾病诊断中的临床应用
［ ｙｗ ｒ ｓ ｕ ｉｅｐ ｏｅｎｅｅｔｏ ｈ ｒ ｓｓ Ｓ － Ｋｅ ｏ ｄ ］ ｒｎ ｒ ｔｉ ｌｃｒ ｐ ｏ ｅｉ； ＤＳ ＡＧＥ； ｋ ｄ ｅ ｉｅ ｓ ｉｎ ｙｄｓ ａｅ
用 于 肾脏 疾病 诊 断 的 传 统 。 能 测 定 ， 能大 体 了解 肾 脏 肾功 只 功 能 的情 况 ， 能 判 断 肾脏 损 伤 的 部 位 和 程 度 。尿 液 成 分 的 分 不
疾 病 患者 尿 液 进 行 电 泳 分析 。 结 果 根 据 尿 蛋 白 电 泳 图谱 扫 描 测 定 ， ０ １ ４例 尿 蛋 白 电泳 显 示 １ Ｏ例 为 生 理 性 蛋 白 尿 ， ７例 为 肾小 球 性 ３ 蛋白尿 ， ２例 为 肾小 管 性 蛋 白尿 ， ５例 为 混 合 性 蛋 白尿 ， 中 ２ １ ４ 其 Ｏ例 同 时做 肾 活检 ， 系膜 增 生 性 肾 小球 肾 炎 １ ８例 ， 增 生性 肾 小球 肾 炎 ２ ， Ｄ － ＧＥ尿 蛋 白 电 泳 结 果 与 肾活检 结 果基 本 相 符 。 结 论 琼 脂糖 尿 膜 例 Ｓ ＳＡ
析 ， 其 是尿 蛋 白 电泳 成 分分 析 ， 据 各 组 分 的 出现 与否 及 含 量 尤 根
３０ ０ｒｒｉ 心 ５ｍｉ ， 在 生 化 分 析 仪 上 测 定 尿 蛋 白 总 量 ， ０ ／ ｎ离 ａ ｎ先 若 尿 蛋 白 含 量 大 于 １ ５ｇ Ｌ， 用 生 理 盐 水 将 尿 液 作 相 应 稀 ． ／ 则
１ ｉ ｅ ｓ ｍ ｐｌｓ ｗ ｅ ｅ ｃａ ｓｆｅ ｓ ｔ ｅ ｆ ｌ ｗ ｉ ａｔｇｏ ｉｓ： ０ ｗ ｅ ｅ ｐｈｙ ｉ ｏ ｃ ｌｐｒ ｅｎ ｉ ３ ｗｅｒ ｏ ｅ ｕ ａ ０４ ｕｒｎ ａ ｅ ｒ ｌｓ ｉｉｄ ａ ｈ ｏｌｏ ｎｇ ｃ ｅ ｒｅ １ ｒ ｓｏｌｇｉａ ｏｔｉ ｕｒａ； ７ ｅ ｇｌｍ ｒ ｌ ｒ ｐｒ ｅｎｕ ｉ １ ｗｅ ｅ ｔ ｂｕｌｒ ｐ ｏ ｅｎｕｒａ；４５ ｗ ｅ ｅ ｍ ｉ ｄ ｐｒ ｔ ｉ ｉ．Ａ ｍ ｏ ｈｅ ２ ｔｅ ｓ ｗｈｏ ｕｎｄ ｒ ｎｔｐｅ ｃ ｔ ｏｔ ｉ ｒａ； ２ ｒ ｕ ａ ｒ ｔｉ ｉ ｒ ｘｅ ｏ ｅｎｕｒａ ｎｇ ｔ ０ ｐａ ｉｎｔ ｅ ｗｅ ｒ ｕ ａ ｎ ｏｕ ｅ ａ ｏ ｙ ｓｒ ｕ１ａ ｏ ｌ １ ｅ ｅ ｍ ｅ ａ ｇｉｌｐｒ ｌｆ ｒ ｔｖｅ ｇｏｍ ｅ ｕｌ ｅ ｓ ｒ ｎ ｌｂｉｐｓ ｉｎ ｔ ｎｅ ｕｓｙ， ｗ ｒ ｓ ｎ ａ ｏ ｉｅ ａ ｉ ｌ ８ ｒ ｏｎｅ ｈｒｔｓ， ｅ ｅ ｍ ｅ ｂｒ ｎｏｐ ｏｌｆ ｒ ｔｖ ｐ ｉｉ ２ ｗ ｒ ｍ ａ ｒ ｉｅ ａ ｉ ｅ ｇｌｍ ｅ ｕｌ ｅ ｏ ｒ ｏｎ ｐｈｒｔｓ ｈ ｅ ｕｌｓ ｆ ｕ ｉ ｏｔ ｉ ｌ ｃ ｒ ｈｏ ｅ ｉ ｅ ｅ ｎ ｃ ｏｒ ｎ ｅ ｉｉ．Ｔ ｅ ｒ ｓ ｔ ｏ ｒｎｅ ｐｒ ｅｎ ｅ ｅ ｔｏｐ ｒ ｓｓ ｗ ｒ ｉ ａ ｃ ｄａ ｃ ｗｉｈ ｒ ｎ ｌｂｉ ｙ． ｎｃｕ ｉｎ ｔ ｅ ａ ｏｐｓ Ｃｏ ｌｓｏ
尿蛋白超薄琼脂糖凝胶电泳及初步临床应用
尿蛋白超薄琼脂糖凝胶电泳及初步临床应用随着尿液的日渐受重视，尿液的检查也越来越受到人们的关注。
由于它有效、灵敏、快速，尿液蛋白凝胶电泳技术（UPEP）已成为尿液检查体系的重要组成部分。
相较于常规的凝胶电泳技术，超薄琼脂糖凝胶电泳具有更高的灵敏度，且能分析更多种类的蛋白，因此在实验室检测中被越来越多地应用。
尿液蛋白凝胶电泳技术（UPEP）可以根据蛋白分子量、电荷、酶生物学特性等对尿液蛋白进行快速分析。
而尿液的凝胶电泳分析普遍应用的是通用的15%的凝胶，即15%的去离子表面活性剂（SDS）凝胶电泳。
但这种技术无法有效地区分复杂结构的尿液蛋白，这类蛋白经常会有轻量结构或者非特定性双电荷，在凝胶电泳中往往不易检测出来，因此会对检测结果产生干扰。
为了克服15%SDS凝胶电泳技术无法有效识别复杂蛋白结构的缺陷，尿蛋白超薄琼脂糖凝胶电泳方法应运而生。
其主要特点是使用超薄的琼脂糖凝胶，可以获得更精细的蛋白图谱，以及更容易检测到低量尿液蛋白的能力。
此外，它具有用更低的溶液比率和更低的电流建立更细致的分离，这使它能够更有效的进行尿液蛋白的亚种识别。
尿蛋白超薄琼脂糖凝胶电泳技术从实验室方面和临床上都得到了巨大进步。
实验室方面，该技术普遍有效检测尿液中蛋白含量低于2mg/dl 浓度，能够检测出更多的成分，有助于进一步挖掘尿液蛋白的复杂结构，而且它是一种低成本、高性能的检测技术，有助于快速地排查尿液蛋白异常。
同时，尿蛋白超薄琼脂糖凝胶电泳技术也被应用于临床分析，其结果可以帮助医生判断患者的真正情况，以及有助于准确的诊断尿液蛋白异常。
总之，尿液蛋白超薄琼脂糖凝胶电泳技术是一种新兴而又广泛应用的检测技术，它在尿液蛋白凝胶电泳领域具有重要意义，不仅能够更全面、灵敏、准确的检测尿液蛋白，还能够有效的识别复杂的蛋白结构，为临床的诊疗提供更好的支持。
SDS-AGE尿蛋白电泳技术在肾脏疾病中的应用研究
SDS-AGE尿蛋白电泳技术在肾脏疾病中的应用研究杨小燕;吴泳泳;吕春;雷文辉【摘要】@@ 蛋白尿是肾脏疾病的常见临床表现,尿蛋白的选择性在一定程度上反映肾脏病变的程度.肾活检诊断肾脏疾病的准确性虽然高,但由于肾活检属创伤性诊断技术,存在很多不足,如患者的恐惧;顾虑;可能造成出血;感染等.【期刊名称】《实验与检验医学》【年(卷),期】2010(028)001【总页数】2页(P82,92)【作者】杨小燕;吴泳泳;吕春;雷文辉【作者单位】江西省赣州市人民医院检验科,江西赣州,341000;江西省赣州市人民医院检验科,江西赣州,341000;江西省赣州市人民医院检验科,江西赣州,341000;江西省赣州市人民医院检验科,江西赣州,341000【正文语种】中文【中图分类】R446.12+2蛋白尿是肾脏疾病的常见临床表现，尿蛋白的选择性在一定程度上反映肾脏病变的程度。
肾活检诊断肾脏疾病的准确性虽然高，但由于肾活检属创伤性诊断技术，存在很多不足，如患者的恐惧；顾虑；可能造成出血；感染等。
因此，本文采用十二烷基硫酸钠-琼脂糖凝胶(SDS-AGE)进行非浓缩尿蛋白电泳技术分析，在一定程度上可反映肾脏病变的部位及程度，对临床诊断和早期诊断肾脏疾病，特别对未开展肾活检的基层医院有重要临床意义。
1 资料与方法1.1 标本采集1.1 .1病例组 60例肾病患者均来自我院肾内科2008年1月～2008年12月住院病人，年龄10～70岁，平均42岁，男38例，女22例。
1.1 .2对照组健康人5例，无肾脏病史及其他慢性病史，尿蛋白含量0～100mg/24h。
1.2 仪器与试剂1.2 .1仪器法国Sebia公司产HYDRASYS全自动程序化琼脂糖凝胶电泳仪。
1.2 .2试剂均使用该公司提供的专用标准液和试剂。
1.3 方法1.3 .1 样品采集及处理收集新鲜晨尿5～10ml，标本如不能及时测定放冰箱时间不超过1周，先用尿蛋白筛选定量法测定蛋白含量，如蛋白质高于2g/L，则用生理盐水稀释至1.5g/L。
尿蛋白琼脂糖凝胶电泳及临床应用
尿蛋白琼脂糖凝胶电泳及临床应用
尿蛋白琼脂糖凝胶电泳是一种应用聚合物琼脂糖凝胶电泳技术分
离尿蛋白的方法，它以电泳分离蛋白，能够准确，快速，安全检测尿
蛋白，水凝胶琼脂糖凝胶电泳可以分离8种常见于泌尿系统蛋白、5种肾病标志蛋白和抗原特异性细胞介素包括尿酸肌酐、尿肌酐、白蛋白、凝血酶原、C3、IgG、IgA和IgM等。
它可以明显的提高残留检测的准
确性，为临床诊断提供快速可靠的依据，有助于早期筛检慢性肾病，
为临床治疗提供科学的依据，从而降低患者早期尿蛋白流失诊断失误
的可能性，改善治疗效果。
琼脂糖凝胶电泳的应用
【目的要求】 1．学习琼脂糖凝胶电泳的原理及操作方法； 2．掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法；
一 .电泳的概念
• 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现 象称为电泳。
• 区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样 品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中 迁移。支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于 温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。
4、嵌入染料的存在
荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶 中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并 拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更 强,还会使线状DNA迁移率降低15％。
5、 离子强度影响
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的 电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水 配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离 子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则 电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或 DNA变性。
3、加样：
取50μl PCR产物与10μl 6×载样液混匀,用微量 移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则 可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样 品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以防止 互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝 胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
4、电泳：
加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控 制电压保持在120V ，当溴酚蓝条带移动到距 凝胶前沿约2cm时，停止电泳。
5、观察和拍照：
将凝胶取出，放置在凝胶成像仪中观察、拍照。
待回收的PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳纯化，然后在紫外 灯下小心切下目标条带，放入一干净的EP管中,冻存在-80度冰箱 留待下次上课回收。
SDS尿蛋白及本周氏电泳的意义
室温
90~100℃
50~60℃
• 大多数骨髓瘤患者尿中有本周氏蛋白
本周氏蛋白
起因 结果
浆细胞增生症
血液中出现游离轻链 尿液中出现
影响
骨髓瘤 巨球蛋白血症 CLL慢性白血病 MGUS .....
• 溶菌酶 见于局部急性粒细胞白血病
• 血红蛋白 溶血性疾病,血型不合输血
• α1酸性糖蛋白 见于支气管肺癌
• 肌红蛋白
– ……
挤压伤,心肌梗死
• 肾小球性蛋白尿
肾小球滤过膜因炎症、免疫、代谢等因素损伤后滤过膜孔 径增大、断裂和〔或〕静电屏障作用减弱。
根据滤过膜损伤程度及尿蛋白的组分，尿蛋白分为2类：
定量分析蛋白尿
• 筛查
- 溴酚蓝试纸条检测〔> 150 - 200 mg/L 〕:蛋白尿阳性变 蓝，本周氏蛋白时会产生假阴性
• 定量检测方法
- 比浊法〔不建议使用〕 - 建议采用比色法〔焦性没食子酚红，考马斯蓝〕
尿中总蛋白的定量分析 无法检测到
低浓度的本周氏蛋白
特异蛋白测定
• 免疫法定量测定
▪ 肾小球性标志蛋白:
SDS尿蛋白电泳
Sebia
肾脏疾病：慢性隐匿，发病率急剧上升，早期就诊率2030%，局部患者首诊即终末期肾功能衰竭 慢性肾功能衰竭〔CRF〕是各种慢性肾脏病〔CKD〕的最 终结果
CRF并发症严重,死亡率高
严重危害人类健康的全球性的公共卫生问题
肾单位的生理结构和各类生理蛋白
2百万个肾单位
每天过滤180升 的血浆
polymerization
琼脂糖凝胶电泳和SDSPAGE凝胶电泳
三、注意事项与实验技巧
1. 制胶和加样过程中要防治气泡的产生。 2. 紫外光对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长。 3. EB具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。 4. 加样时，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否
则样品渗漏或DNA带型不整齐。 5. 配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液。因为pH 或离子强度很
小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，影响DNA 片段的泳动。 6. 梳板的选用 一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，
梳齿宽厚，形成的点样容积较大，用于DNA 片段回收实验等； 相反，梳齿窄而薄，形成的点样容积就较小，用于PCR产物、 酶切产物鉴定等。一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制 胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。
本产品分为还原型和非还原型两种，还原型上样 缓冲液中的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链间二 硫键断裂，使通过二硫键连接的各亚单位彼此分离， 在电泳凝胶上显现多个蛋白条带，选购和使用时请务 必注明，仔细区分。
上样缓冲液 之二
注意事项
还原型上样缓冲液中含一定量的DTT（二硫 苏糖醇）或巯基乙醇，有轻微刺激性气味，较 易区分；
TEMED
8 ml 3.2 ml 2.7 ml 2 ml 100 μl 50 μl
5 μl
浓缩胶 5% H2O 30% 丙烯酰胺 1 M TrisHClPH8.8 10% SDS 10% AP TEMED
4ml (2 cm)
3.2 ml
0.67 ml
1 ml
50 μl
25 μl
28
5 μl
凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌 胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。 用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围 如下表：
琼脂糖凝胶电泳在蛋白质结构研究中的应用
琼脂糖凝胶电泳在蛋白质结构研究中的应用琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离和鉴定生物样品中蛋白质的方法。
这种方法基于蛋白质在凝胶中的电泳迁移性质，通过不同尺寸的孔道分离不同分子量的蛋白质，进而得到不同的电泳带。
这种方法不仅可以用于大规模蛋白质分离和鉴定，还可以用于研究蛋白质结构和复合体生成的相关问题。
在蛋白质结构研究方面，琼脂糖凝胶电泳可以用于分离分子量相近的蛋白质，从而提高对蛋白质的分析准确性。
当蛋白质在凝胶中迁移时，由于不同尺寸的孔道对不同分子量的蛋白质具有不同的限制作用，因此分子量相近的蛋白质会被分开，以便得到更清晰的带。
这种方法还可以用于分离蛋白质的亚单位或同源物，以便进行更细致的分析和鉴定。
琼脂糖凝胶电泳还可以用于研究蛋白质的复合体。
许多蛋白质在体内常常形成复合体，这些复合体参与了许多生物过程，如信号转导、基因转录等。
使用琼脂糖凝胶电泳，可以分离蛋白质组成相近的复合体，这为研究复合体的组成和结构提供了一种便捷的途径。
此外，可以通过特定的抗体将靶蛋白与其复合体分离出来，进而进行免疫印迹等技术的分析。
然而，琼脂糖凝胶电泳也存在着一些限制。
首先，它只能分离分子量在数十千达到约200万的蛋白质，对于大分子量的蛋白质或蛋白质复合体则不适用。
其次，由于不同的蛋白质在凝胶中具有不同的电泳迁移率，因此出现了多种电泳迁移率的蛋白质可能不能很好地分离。
最后，电泳过程中的一些化学变化，如氧化还原反应和光谱相互作用，可能会释放出氧气等自由基，对蛋白质的化学活性产生一定的影响。
总之，琼脂糖凝胶电泳是一种常用的生物分离和鉴定方法，具有分离效果好、使用简便等优点。
对于研究蛋白质结构和复合体的组成具有重要意义。
然而，仍需要根据实验要求和样本性质选择合适的方法。
未来，琼脂糖凝胶电泳将继续发展和迭代，推动蛋白质研究领域的进一步提升。
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大步,但实际效果如何还有待进一步的验证。
1992年英国国家生物标准及控制研究所(NI B2 SC)组织了9个国家的22个实验室进行协作,制备了编号为89/644的纤维蛋白原标准品,ICTH建议作为国际标准品向WH O推荐。
由于影响因素较多,纤维蛋白原标准品的使用只解决了纤维蛋白原测定标准化的一部分问题。
1992年NCC LS就APTT测定的暂行规范颁布了H292T文件。
到目前为止,ICSH和ICTH还未提出APTT测定标准化的方案。
(收稿日期:2004204211)(本文编辑:赵允文)中图分类号:R446.12+2 文献标识码:A尿蛋白S DS-琼脂糖凝胶电泳实验方法建立及临床应用吴惠毅1,孙召东1,刘安定2,仇为民1,祝捷凯3,杨新玲1(1.江苏连云港市第一人民医院检验科;2.蚌埠医学院检验系实习生,安徽蚌埠,233000;3.江苏大学医学技术学院实习生)摘要:目的 建立尿蛋白十二烷基磺酸钠(S DS)-琼脂糖凝胶(AGE)电泳方法。
方法 分别对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四种琼脂糖、不同的缓冲对、电压和电泳时间进行实验,确定最佳的分离条件,建立测定方法并应用于临床。
检测临床尿蛋白阳性标本57份。
结果 当Ⅳ型琼脂糖凝胶浓度为40g/L,S DS含量为0.1%,在pH7.0的AMP-咪唑-HCl缓冲体系下进行电泳,可以有效的将尿蛋白按分子量大小进行分离。
57份临床尿蛋白阳性标本电泳结果表明,生理性蛋白尿24例、中、高分子5例、小分子1例和混合型17例。
结论 本法具有分离效果好、操作简便、灵敏度高、成本低廉等优点,可以将尿蛋白按分子量大小分为小分子、中分子以及混合型,对肾脏疾病的受损部位和损伤程度的判断具有较高的价值,适于基层实验室的常规开展。
关键词:尿蛋白;琼脂糖凝胶电泳;十二烷基磺酸钠 蛋白尿是肾脏疾病的重要的临床表现之一,正确判断蛋白尿性质、来源及损伤的程度对指导临床治疗具有重要的意义。
S DS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(S DS-PAGE)[1]由于其具有分子筛作用,可以将蛋白质按分子量大小进行分离,是临床用于分析尿蛋白较为理想的方法,但其操作繁琐,需预浓缩尿液,技术要求高,检测时间长,不能满足临床常规大批量标本检测。
Bricon等[2]报道应用十二烷基磺酸钠-琼脂糖凝胶电泳(S DS-AGE)法分离尿蛋白获得与S DS-PAGE同样的结果,且操作简单、快速、尿标本不需要预浓缩,可以有效地将尿蛋白按分子量大小分为低分子、中分子、高分子。
法国Sebia公司相继推出商品化试剂盒,现已在国内许多大医院使用[3,4],但其价格昂贵,难以在国内广泛推广应用。
我们在Bricon报道的基础上,通过大量的实验,摸索出最佳分离条件,并依此建立了适合于国内常规开展的尿蛋白S DS-AGE方法,经临床应用结果满意,现报道如下。
1 材料与方法1.1 仪器 DYY2电泳槽(北京六一仪器厂), ECP3000电泳仪(北京六一仪器厂)1.2 试剂1.2.1 琼脂糖凝胶缓冲液 称取S DS1.0g,22氨基22甲基21,32丙二醇(AMP)3.5g,咪唑1.7g,硼酸0123g,加蒸馏水溶解,混匀后用HCl调节至pH7.0,定容至1000ml。
1.2.2 电极缓冲液 称取S DS1.0g,AMP3.5g,咪唑3.4g,硼酸0.23g,加蒸馏水溶解,用1.0m ol/L HCl 调整至pH7.0,定容至1000ml。
1.2.3 染色液 1.5g考马斯亮蓝R250溶于227ml 甲醇,加46ml冰醋酸,用蒸馏水定容至500ml,混合后滤纸过滤。
1.2.4 脱色液 112ml甲醇,加28ml冰醋酸,加蒸馏水至500ml。
1.2.5 标本处理液 1.0g S DS溶于100ml凝胶缓冲液,再加入2ml巯基乙醇。
1.2.6 40g/L琼脂糖凝胶 4.0g琼脂糖Ⅳ(S olon Industrial Parkway・S olon,Ohio US A),加入凝胶缓冲液100ml,加热溶解,贮存于冰箱备用。
1.2.7 2%溴酚蓝溶液 2.0g溴酚蓝溶于100ml 95%乙醇。
1.3 临床标本 57例蛋白尿标本来自我院门诊及住院病人,其中男性31例,女性16例,年龄14-62岁。
对照组来自我院健康体检中心。
留取晨尿10ml,2500rpm离心5min备用。
1.4 方法1.4.1 凝胶板的制备 超薄琼脂糖凝胶板制备按文献[5]报道的方法进行,所不同的是在制备好的琼脂糖凝胶板上用自制打槽器打一5mm×1.2mm加样槽。
1.4.2 标本处理 80μl标本加入20μl标本处理液,再加入少量2%溴酚蓝,旋转混匀。
如蛋白浓度大于2g/L,应先用生理盐水稀释至2g/L后,再加样本处理液。
1.4.3 加样 用微量加样器加5μl处理好的标本液于加样槽中。
1.4.4 电泳 加好样的凝胶板放入电泳槽,盐桥为六层滤纸,60V恒压,电泳30min。
1.4.5 干燥 取下凝胶板,用电吹风吹干。
1.4.6 染色 吹干的凝胶板放入染色液中染色30 min。
1.6.7 脱色 取出凝胶板,放入脱色液中,脱色至背景无色。
2 结 果2.1 琼脂糖凝胶的选择 分别应用不同浓度的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四种类型琼脂糖凝胶进行蛋白电泳,观察在不同浓度条件下尿蛋白的分离效果,尿蛋白阳性标本经Sebie公司S DS-AGE结果证实,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三种琼脂糖对高分子蛋白的分离效果较差,即不能有效地将中高分子蛋白分离;而Ⅳ型琼脂糖可以将蛋白有效的地分为低、中、高分子量蛋白,且分离效果满意。
琼脂糖的浓度对琼脂糖凝胶分离蛋白的效果也有较大的影响,实验中发现,分离效果随着琼脂糖凝胶浓度的增加而增加,当其浓度≥40g/L时,分离效果最佳,结果见封3图6,但随着琼脂糖凝胶浓度的加大,制板难度也随之增加,因此我们最终选择Ⅳ型琼脂糖,其浓度为40g/L。
2.2 缓冲液的选择 将MOPS、T ris、T rince、AMP、咪唑分别与HCl组成缓冲对,然后进行实验,结果表明,均达不到理想的分离效果;我们进行了缓冲对之间的组合实验,结果发现,在AMP-咪唑-HCl缓冲体系中,在pH为7.0时蛋白质分离效果最佳。
2.3 电压、电泳时间选择 分别在不同的电压条件下进行电泳实验,结果表明,电压越高,电泳速度越快,但随之产热也越多,经过多次实验,我们发现在60V恒压条件下,电泳30分钟即可达到满意分离效果。
2.4 S DS浓度的影响 我们分别将样本处理液中的S DS配置成0.55%～2.0%浓度,缓冲液中S DS 配置成0.05%～1.0%浓度,然后进行实验,结果表明,样本处理液中S DS浓度为1.0%时效果最好,当其浓度达2.0%时,虽然对分离效果无影响,但影响染色结果,大分子量蛋白着色明显变浅。
缓冲液中S DS最佳浓度为0.10%。
2.5 与Sebia检测试盒比较 应用我们建立的方法与法国Sebia试剂盒同时检测临床不同类型的蛋白尿阳性标本,结果,除在电泳速度略慢于Sebia法外,检测结果两法完全一致。
2.6 临床应用 应用我们建立的方法,检测尿蛋白阳性标本57例,10例健康成年人,结果见表1。
而10例健康成年人仅见微弱白蛋白区带。
表1 57例尿蛋白阳性标本电泳结果蛋白尿类型例数百分率(%)生理性蛋白尿2442.1中、高分子58.8小分子1119.3小分子、中分子、高分子1729.83 讨 论琼脂糖是一种链状多糖物质,可形成高筛网状结构,对物质进行分离。
琼脂糖的类型很多,不同类型的琼脂糖有不同的理化性质,如强度、电渗流等,因此,不同类型的琼脂糖适合于不同物质的分离。
琼脂糖凝胶电泳技术由于其分辨率好、灵敏度高、结果易于保存等优点,在国外已经得到广泛应用。
我们曾报道应用琼脂凝胶电泳[6,7]分析尿蛋白,可将尿蛋白分为白蛋白、α1、α2、β、γ五条区带。
S DS-AGE之所以能将蛋白质按分子大小排列,是因为S DS是一种阴离子表面活性剂,当其浓度达到蛋白质量的5～10倍时,与还原剂共同作用,能使蛋白质分子内的氢键及二硫键断裂,解离成单独的亚基,亚基与S DS充分结合形成带负电荷的亚基-S DS胶束,所带的电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷量,从而消除了不同分子之间原有的电荷差异[2]。
实践中我们发现,不仅琼脂糖类型对分离效果有影响,而且凝胶的浓度也是决定分离成败的重要因素之一。
本文实验表明,在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四种琼脂糖中,以40g/LⅣ型琼脂糖分离效果最好,可以将尿蛋白按低、中、高分子量进行有效分离。
缓冲溶液、pH、电压等是影响S DS-AGE电泳的重要因素。
Bricon等[2]报道S DS-AGE法在中性pH条件下进行,缓冲液为咪唑-HCl,我们对其进行了多次重复实验,未能重复实验结果,出现中高分子蛋白分离不开,区带较宽。
我们重新选择了缓冲系统,尝试了MOPS、T ris、T rince、AMP-HCl缓冲系统,并进行了不同的配对实验,结果表明,在咪唑-HCl缓冲体系中加入AMP及硼酸,可有效地提高分离效果。
临床应用结果表明,本法可将尿蛋白按其分子量大小分为低分子、中分子、高分子,10例健康成年人仅见到微弱白蛋白区带,对肾脏疾病的诊断、鉴别诊断、指导治疗和判断预后具有重要的价值,且方法操作简单、快速、不需要特殊的仪器设备、成本低廉,检测结果与法国Sebia试剂盒一致,我们在实验中采用超薄琼脂糖凝胶制备技术,具有较高的测定灵敏度,凝胶板易于保存,可以满足于临床常规批量检测要求。
参考文献:[1]M iltenyi M,Tulassay T,T ausz T,et al.Urinary protein patterns for dif2ferential diagnosis of glomerular of nong omerular hematuria[J].Clin Nephrol,1984,22(5):105-108.[2]Le Bricon T,Erilich D,Beng ou fa D,et al.S odium dodecyl sulfate2a2garose gel electrophoresis of urinary proteins:application to multiple myeloam[J].Clinical Chem istry,1998,44(6):1191-1197.[3]沈 霞,张敏华,汪 萍,等.非浓缩尿蛋白电泳的临床应用[J].中华医学检验杂志,2001,24(5):266-268.[4]陈 立,庄叶萍.S DS-AGE非浓缩尿蛋白电泳的建立和应用[J].天津医科大学学报,2002,8(1):109-110.[5]赵绍林,吴惠毅.超薄琼脂糖凝胶板简易制备技术[J].临床检验杂志(待发表).[6]吴惠毅,王学珍.尿蛋白琼脂糖电泳法[J].中华医学检验,1988,11(5):285-287.[7]陈 晋,吴惠毅,沈来龙,等.尿蛋白超薄琼脂糖凝胶电泳[J].临床检验杂志,1994,12(3):158.Experimental Study on Sodium Dodecy1Sulfate2agarose G elE lectrophoresis of U rinary Protein and Clinical ApplicationW U Hui2yi,S UN Z ao2dong,LI U An2ding,et al(Department of Clinical laboratory,The first people’s hospital of Lianyungang, Lianyungang,222002,China)Abstract:Objective T o establish an electrophoresis method of S odium dodecy1sulfate2agarose gel electrophoresis(S DS2AGE)to separte the urine protein.Methods have tried different m odel agarose,different king of bu ffer,different electric v oltage and time in electrophoresis, in order to obtain the best separation condition,and then be used.The method is used for determining57positive urine protein sam ples.R e2 sults When theⅣagarose gel concentration is40g/L,the S DS content is0.1%and the AMP2Imidazole2HCl electrode bu ffer is in pH7. 0,the urine sam ples can be separated effectively by m olecular weight.The results of57urine sam ples can be divided into24m oderate m olecu2 lar protein,5m oderate and high m olecular protein,11low mlecular protein,17mixed m olecular protein respectively.Conclusion The cost of this method is low,m ore sim ple and highly sensitive.The urine protein can be divided by m olecular weight into m oderate m olecular protein, m oderate and high m olecular protein,low m olecular protein and mixed protein,which have great value in judging the damaged part and degree of the kidney.I t is suitbale for the grass2roots laboratory to carry out as a routine.K ey w ords:urine protein;agarose gel electrophoresis;S DS(收稿日期:2004209221)(本文编辑:赵允文)浙江省临床检验管理与技术规范征订通知各医疗机构:《浙江省医疗机构管理与诊疗规范丛书》之《浙江省临床检验管理与技术规范》分册由浙江省卫生厅组织省各质控中心有关专家编写。